Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kultur af pattegrise Intestinal 3D organoider fra kryopræserverede epitelkrypter og etablering af cellemonolag

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64917
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 2, 4, 1, 1
1GenPhySE, Université de Toulouse, INRAE, ENVT, 2Lallemand Animal Nutrition, 3Institut NuMeCan, INRAE, INSERM, Université de Rennes, 4FG 16: Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch-Institute

Summary

Her beskriver vi en protokol til dyrkning af svins tarm 3D-organoider fra kryopræserverede epitelkrypter. Vi beskriver også en metode til at etablere cellemonolag afledt af 3D-organoider, hvilket giver adgang til den apikale side af epitelceller.

Abstract

Intestinale organoider bruges i stigende grad til at studere tarmepitelet til modellering af fordøjelsessygdomme eller til at undersøge interaktioner med lægemidler, næringsstoffer, metabolitter, patogener og mikrobiotaen. Metoder til dyrkning af tarmorganoider er nu tilgængelige for flere arter, herunder svin, som er en art af stor interesse både som husdyr og som en translationel model for mennesker, for eksempel til at studere zoonotiske sygdomme. Her giver vi en dybdegående beskrivelse af en procedure, der anvendes til dyrkning af svins tarm 3D-organoider fra frosne epitelkrypter. Protokollen beskriver, hvordan man kryopræserverer epitelkrypter fra svinetarmen og de efterfølgende procedurer til dyrkning af 3D tarmorganoider. De vigtigste fordele ved denne metode er (i) den tidsmæssige dissociation af isoleringen af krypter fra kulturen af 3D-organoider, (ii) forberedelsen af store lagre af kryopræserverede krypter afledt af flere tarmsegmenter og fra flere dyr på én gang og dermed (iii) reduktionen i behovet for at prøve frisk væv fra levende dyr. Vi beskriver også en protokol til etablering af cellemonolag afledt af 3D-organoider for at give adgang til den apikale side af epitelceller, som er stedet for interaktioner med næringsstoffer, mikrober eller lægemidler. Samlet set er protokollerne beskrevet her en nyttig ressource til undersøgelse af svinets tarmepitel i veterinær og biomedicinsk forskning.

Introduction

Tarmepitelet er dannet af et monolag af celler, der dækker fordøjelsesslimhinden ved grænsefladen med lysmiljøet. Denne position er forbundet med forskellige funktioner, såsom næringsstofabsorption og barrierefunktion, der understøttes af tilstedeværelsen af stamceller og flere differentierede epitelcelletyper (absorberende, enteroendokrine, Paneth og bægerceller)1. Udødeliggjorte cellelinjer, der traditionelt anvendes til at studere epitelceller, har store begrænsninger, da de ikke afspejler tarmepithelets cellulære kompleksitet og præsenterer genomiske abnormiteter2. Udviklingen af tredimensionelle (3D) organoider af Sato et al.3 gav en ny model til at studere tarmepitelet med en forbedret fysiologisk relevans. Faktisk er intestinale organoider afledt af ikke-transformerede stamceller, består af flere celletyper og rekapitulerer funktionaliteten af tarmepitelet. Intestinale organoider bruges i stigende grad til at forstå udviklingen og funktionerne i tarmepitelet og dets interaktioner med patogener, næringsstoffer, toksiner, lægemidler, mikrobiotaen og dets metabolitter2.

Oprindeligt udviklet til mennesker og mus, er de metoder, der anvendes til dyrkning af tarmorganoider, for nylig blevet tilpasset andre arter, herunder svin4. Gonzales et al.5 var de første til at dyrke svineorganoider fra jejunum ; Siden da er svineorganoider blevet beskrevet for andre tarmsegmenter (tolvfingertarmen, ileum og tyktarmen)6,7,8 og har vist sig at bevare en placeringsspecifik fænotype 9,10,11. Svinetarm 3D-organoider bruges nu almindeligvis til at studere effekten af næringsstoffer 12,13 eller enteriske infektioner 6,8,14.

De fleste af undersøgelserne har beskrevet kulturen af intestinale organoider startende fra frisk isolerede epitelkrypter. Dette er imidlertid ikke altid muligt af logistiske årsager, navnlig når man arbejder med store dyr som svin. Faktisk kan dyrefaciliteter til svin være placeret langt fra laboratoriet, hvor organoider dyrkes, hvilket komplicerer arbejdsorganisationen. Desuden er organoidkultur tidskrævende; Det er således ikke praktisk samtidig at dyrke flere organoide linjer, for eksempel fra forskellige tarmsegmenter eller flere dyr. For at omgå disse problemer har nogle få undersøgelser hos mennesker, heste og svin beskrevet metoder til dyrkning af organoider fra frosne tarmvæv (eller biopsier) eller fra isolerede epitelkrypter 4,15,16,17. Disse metoder tillader kryopræservering af intestinale epitelstamceller fra flere tarmsegmenter af et enkelt dyr, som derefter kan bruges til at dyrke organoider, når det er nødvendigt. Desuden giver dette mulighed for en kraftig reduktion i antallet af levende dyr, der anvendes som donorer af stamceller, da der kan oprettes store lagre af kryopræserverede krypter (principperne i 3R). En anden fordel ved denne metode er væksten af intestinale organoider kun fra dyr af interesse efter opnåelse af fænotypiske eller genotypiske resultater, hvilket er yderst omkostningseffektivt.

In vivo polariseres tarmepitelceller med den apikale side rettet mod lumen. In vitro, i 3D-organoider, vender den apikale side af epitelceller også mod lumen (dvs. inde i organoiderne)4. Denne organisation forhindrer adgang til den apikale side, hvilket er et problem, når man studerer virkningerne af luminale komponenter (fx næringsstoffer, mikrober, metabolitter) på epitelceller. For at omgå denne ulempe er der udviklet flere metoder, såsom dyrkning af organoidceller som 2D-monolag, mikroinjektion og polaritetsvending ("apikale organoider")18,19. Kulturen af organoide cellemonolag fremstår som det mest effektive og medgørlige system. Princippet er at adskille 3D-organoider i enkeltceller og frø dem på en cellekulturbeholder, der tidligere er belagt med et tyndt lag ekstracellulær matrix (ECM)20. Under disse dyrkningsforhold vender den apikale side af epitelcellerne opad og er således tilgængelig for eksperimentelle behandlinger20. Kulturen af organoidcellemonolag blev for nylig tilpasset svinetarmen21,22; cellemonolag afledt af svin 3D-organoider er blevet brugt til flere applikationer, herunder undersøgelse af enteriske infektioner 6,23,24,25, transport af næringsstoffer9 og modellering af fordøjelsessygdomme 26.

Her præsenterer denne undersøgelse først en detaljeret protokol for dyrkning og vedligeholdelse af svins intestinale 3D-organoider afledt af kryopræserverede epitelkrypter (figur 1). Derefter beskrives en protokol for at etablere cellemonolag fra svintarm 3D-organoider. De her beskrevne metoder giver eksperimentelle værktøjer, der kan bruges til at studere grisens tarmepitel for næringsstoftransport, barrierefunktion og værtsmikroorganismeinteraktioner.

Protocol

Denne protokol blev godkendt af den lokale etiske komité (N°TOXCOM/0136/PP) i overensstemmelse med det europæiske direktiv om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål (2010/63/EU). Denne protokol er beskrevet for jejunum som et eksempel, men den kan bruges til hvert segment af tynd- og tyktarmen (tolvfingertarmen, jejunum, ileum, tyktarmen).

1. Isolering af epitelkrypter fra smågrisetarmen

BEMÆRK: Forbered et lager af komplet Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEMc) med DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (P / S). Forbered 50 ml alikvoter og opbevar dem ved 4 °C i 1 måned.

  1. Fremstilling af opløsninger (skal udføres på dagen for kryptisoleringen)
    1. Forbered dissociationsopløsningen indeholdende fosfatbufret saltvand (PBS), 3 mM dithiothreitol (DTT), 9 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer og 1% penicillin-streptomycin (P / S) og opbevar på is.
    2. Forbered fryseopløsningen indeholdende DMEMc, 10% FBS, 10% dimethylsulfoxid (DMSO) og 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer og opbevar på is (den endelige FBS-koncentration er 18%).
    3. Forbered transportopløsningen indeholdende kold PBS suppleret med 1% P/S og opbevar den på is.
  2. Isolering af epitelkrypter
    1. Slagtning af en pattegris ved elektronarkose efterfulgt af ekssanguination.
    2. Umiddelbart efter slagtning skal du åbne grisens underliv med en skalpel og fjerne hele tarmen.
    3. Saml ca. 2 cm af et tarmsegment og opbevar det i kold transportopløsning. Hold segmentet på is indtil kryptisolering (op til 2 timer).
    4. Læg vævet i en petriskål. Åbn tarmsegmentet i længderetningen og vask forsigtigt vævet i kold PBS suppleret med 1% P/S for at fjerne tarmindholdet.
    5. Overfør vævet til en ny petriskål fyldt med 10 ml kold PBS suppleret med 1% P/S.
    6. Hold vævet med pincet og fjern villi og det resterende slim ved at skrabe med et mikroskopglas.
      BEMÆRK: Fjernelsen af villi (den tungeformede struktur) kan kontrolleres ved mikroskopisk observation af supernatanten.
    7. Vævet overføres til et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml iskold dissociationsopløsning og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) på en roterende ryster (15 omdr./min.).
    8. Overfør vævet til en ny petriskål og tilsæt 10 ml kold PBS suppleret med 1% P/S.
    9. Isoler krypterne mekanisk ved at skrabe slimhinden fast med et mikroskopglas.
      BEMÆRK: Under et mikroskop kontrolleres tilstedeværelsen af epitelkrypter i PBS (figur 2A) .
    10. Opsug kryptopløsningen med en serologisk pipet og filtrer gennem en 100 μm cellesi i et 50 ml konisk rør.
    11. Pipet 10 μL af opløsningen og kontroller tilstedeværelsen af krypter under et mikroskop. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    12. Under et sterilt biosikkerhedskabinet kasseres supernatanten, og kryptpelletten resuspenderes i 10 ml kold DMEMc suppleret med 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer.
    13. 10 μL kryptopløsningen pipetteres i en plade med 48 huller. Tæl manuelt antallet af krypter under et mikroskop med en 10x forstørrelse, og beregn koncentrationen af krypter pr. ml opløsning.
      BEMÆRK: De isolerede krypter kan bruges direkte til dyrkning af tarmorganoider. Det er dog ofte mere bekvemt at kryopræservere et stort parti krypter fra hver grise og bruge dem senere til organoid kultur.
  3. Frysning af epitelkrypter
    1. Overfør et volumen svarende til 900 krypter i et 15 ml konisk rør. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    2. Supernatanten kasseres, og kryptpellets opslæmmes igen i 1 ml fryseopløsning. Overfør til et kryorør og anbring hætteglasset i en cellefrysebeholder.
    3. Opbevar cellefrysebeholderen ved -80 °C i 24 timer, og overfør derefter hætteglassene til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.

2. Etablering af pattegrise intestinal 3D organoider fra frosne epitelkrypter

BEMÆRK: Pattegrises intestinale 3D-organoider dyrkes i et kommercielt dyrkningsmedium, der er formuleret til vækst af humane organoider, suppleret med 1% P/S og 100 μg/ml af et antimikrobielt middel til primære celler og opbevares ved 4 °C i op til 1 uge. En tumorafledt ekstracellulær matrix (ECM) anvendes til dyrkning af 3D-organoider. Alle referencer til kommercielle produkter er præsenteret i materialefortegnelsen.

  1. Forberedelse af materialer
    1. Placer pipetspidserne ved -20 °C (mindst natten over).
    2. De frosne delprøver af ECM (500 μL) anbringes ved 4 °C mindst 1 time i forvejen.
    3. Forvarm en 48-brønds plade i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
    4. Placer kulturmediet på RT.
    5. Forvarm et vandbad ved 37 °C.
    6. Placer en lille isspand under emhætten under aseptiske forhold.
  2. Optøning af frosne epitelkrypter
    1. Optø hurtigt et hætteglas indeholdende 900 frosne krypter i vandbad ved 37 °C (mindre end 5 min).
    2. Overfør kryptopløsningen til et 15 ml konisk rør.
    3. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved RT. Supernatanten fjernes
    4. Der tilsættes 150 μL ECM med afkølede spidser for at opnå en slutkoncentration på 150 krypter pr. 25 μL ECM. Pipet op og ned 10 gange for at opnå en homogen suspension af krypter i ECM.
      BEMÆRK: Hold altid ECM på is for at undgå polymerisation. Brug altid forkølede pipetspidser ved -20 °C til at manipulere ECM. Pipet langsomt for at undgå at lave luftbobler i ECM. En ufortyndet ECM anvendes på dette trin for at forhindre de små dråber i at kollapse.
    5. Frø seks brønde med et fald på 25 μL pr. brønd med afkølede spidser i en forvarmet plade med 48 brønde.
      BEMÆRK: Hold spidsen lodret, i midten af brønden, og pipet langsomt uden at indføre luft for at opnå en kuppel. Her anvendes 48-brøndplader, da organoidnummeret normalt er lavt, når man starter fra frosne krypter.
    6. Der inkuberes i 30 minutter i en 5% CO2 inkubator på 37 °C til polymerisation af ECM.
    7. Der tilsættes 250 μL pr. hul dyrkningsmedium ved RT. Der inkuberes i en 5 % CO2 -inkubator på 37 °C, og dyrkningsmediet udskiftes hver 2.-3. dag
      BEMÆRK: Krypterne er normalt ikke synlige efter optøningsproceduren, og de fleste celler er dissocieret i ECM (figur 2B).

3. Passage af pattegrise intestinal 3D-organoider afledt af frosne krypter

BEMÆRK: Tiden til at opnå organoider fra frosne krypter er normalt længere end når man starter fra friske krypter. Organoider er normalt klar til opdeling 10 dage efter optøning (figur 2B).

  1. Forberedelse af materialer
    1. De frosne delprøver af ECM (500 μL) anbringes ved 4 °C i mindst 1 time.
    2. Forvarm pladerne med 24 brønde ved 37 °C.
    3. PBS og enzymdissociationsreagenset forvarmes suppleret med 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer i vandbad ved 37 °C.
    4. Placer kulturmediet på RT.
    5. Placer en lille isspand under emhætten under aseptiske forhold.
  2. Passage af 3D-organoider afledt af frosne krypter
    1. Kulturmediet fjernes og vaskes med 250 μL forvarmet PBS ved 37 °C.
    2. Der tilsættes 250 μL forvarmet enzymdissociationsreagens suppleret med 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer ved 37 °C i hvert hul.
      BEMÆRK: På grund af det lave antal organoider udføres dissociationen af organoider direkte i hver brønd.
    3. Afmonter organoiderne i ECM ved at skrabe med en P1000-pipette og homogeniser forsigtigt ved pipettering fem gange.
    4. Der inkuberes i 5 minutter i en 5 % CO2 inkubator på 37 °C. Dissocier cellerne ved at pipettere op og ned 10 gange ved hjælp af en P1000-pipør.
      BEMÆRK: Målet er at opnå isolerede celler eller små celleklynger (<10 celler). Kontroller dissociationen under et mikroskop. Hvis der stadig observeres store fragmenter af organoider, gentages trin 3.2.4.
    5. Der tilsættes 500 μL DMEMc i hvert hul, der indeholder dissocierede celler, og puljen op til 12 huller i et 15 ml konisk rør indeholdende 3 ml koldt DMEMc.
    6. Der centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 1 ml kold DMEMc.
    7. Tæl cellerne med en fortynding på 1:2 i trypanblå med en celletæller.
      BEMÆRK: Den automatiske celletæller kan tælle cellerne i små klynger, hvis de findes.
    8. Det nødvendige volumen af celleopløsningen centrifugeres, så der er 3 000 levende celler pr. kuppel (én kuppel pr. hul på 24-brøndspladen) ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    9. Resuspender cellerne med 17 μL kold DMEMc pr. 3.000 levende celler på is. Juster lydstyrken til det krævede antal brønde.
    10. Tilsæt langsomt 33 μL kold ECM med afkølede spidser pr. 3.000 levende celler og homogeniser på is uden at lave bobler. Juster lydstyrken til det krævede antal brønde.
      BEMÆRK: Cellerne resuspenderes i en opløsning indeholdende 1/3 DMEMc og 2/3 ECM. For hver kuppel er der brug for 50 μL af denne opløsning. Fortyndet ECM er billigere og lettere at pipet.
    11. Hullerne udledes med 50 μL ECM-cellesuspension pr. brønd med afkølede spidser i en forvarmet 24 brøndplade.
    12. Der inkuberes i 30 minutter i en 5% CO2 inkubator på 37 °C til polymerisation af ECM.
    13. Der tilsættes 500 μL af dyrkningsmediet pr. hul. Inkuber i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator og skift kulturmediet hver2-3 dage
      BEMÆRK: Organoiderne kan enten bruges direkte til i) eksperimenter, ii) vedligeholdelse af 3D-organoidkulturen, iii) frysning eller iv) såning af organoidcellemonolagene (figur 1). Kontroller organoidernes vækst med et mikroskop hver dag for at vælge den optimale timing for opdeling af organoiderne. Organoiderne skal have et klart og tomt lumen og veldefinerede kanter. Modne organoider med sort snavs i lumen bør ikke anvendes til opdeling (figur 3).

4. Vedligeholdelse af organoidkultur i 3D

BEMÆRK: Til passaging skal organoider fremstå klare med et tomt lumen. Sort affald vises i lumen ca. 5 dage efter opdeling og indikerer tilstedeværelsen af døde celler. Begrænsning af antallet af døde celler på tidspunktet for passering foretrækkes for optimal vedligeholdelse af kulturen. Tidsplanen bør derfor tilpasses for at undgå at nå dette modenhedsstadium.

  1. Forberedelse af materiale
    1. ECM-delprøverne (500 μL) anbringes ved 4 °C til optøning i mindst 1 time.
    2. Forvarm en plade med 24 brønde ved 37 °C.
    3. Forvarm enzymdissociationsreagenset suppleret med 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer i et vandbad ved 37 °C.
    4. Placer kulturmediet på RT.
    5. Placer en lille isspand under emhætten under aseptiske forhold.
  2. Passage af intestinale 3D-organoider
    1. Afmonter organoiderne med ECM ved at skrabe med en P1000-pipør. Homogeniser omhyggeligt ved pipettering i dyrkningsmediet, og overfør til et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml kold DMEMc på is.
      BEMÆRK: Der kræves et 15 ml konisk rør til en pool med 12 brønde af organoider dyrket i 50 μL kupler i 24-brøndplader.
    2. De opsamlede organoider centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
      BEMÆRK: Organoiderne danner en hvid pellet i bunden af røret. Hvis organoiderne stadig er i suspensionen i ECM efter centrifugering, suges den øvre supernatant forsigtigt (uden at røre ECM-laget), homogeniseres ved pipettering 10 gange med en P1000-pipette og centrifugeringstrinnet gentages. ECM-laget bør ikke være synligt efter denne procedure.
    3. Supernatanten suges forsigtigt, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml forvarmet enzymdissociationsreagens suppleret med 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer. Pipet op og ned 10 gange for at indlede dissociation af organoiderne.
    4. Der inkuberes i 5 minutter i et 37 °C vandbad til enzymatisk nedbrydning.
    5. Organoiderne forstyrres mekanisk ved pipettering 10 gange med en P1000-pipør. Kontroller cellesuspensionen under mikroskopet.
      BEMÆRK: Målet er at opnå isolerede celler eller små celleklynger. Hvis der stadig observeres store organoide fragmenter, gentages inkubationen (trin 4.2.4) og den mekaniske forstyrrelse (trin 4.2.5).
    6. Tilsæt 4 ml iskold DMEMc. Der centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C
    7. Supernatanten kasseres, og organoidcellepelletsen resuspenderes i 1 ml DMEMc.
    8. Der fortsættes som beskrevet ovenfor (trin 3.2.7 til 3.2.13) med at tælle cellerne og frø organoidcellerne i 50 μL ECM-kupler indeholdende 3000 levende celler i forvarmede plader med 24 brønde.

5. Frysning af 3D-organoider

  1. Forbered det nødvendige volumen (1 ml til en pulje af to kupler) fryseopløsning indeholdende DMEMc suppleret med 10% FBS, 10% DMSO og 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer og opbevar på is (den endelige FBS-koncentration er 18%).
  2. Fjern kulturmediet fra brøndene, der skal fryses.
  3. Tilsæt 1 ml fryseopløsning til det første hul, der skal fryses, løsn ECM ved skrabning og homogeniser med pipetspidsen.
  4. Organoidsuspensionen overføres fra den første brønd til den anden brønd, der skal fryses.
  5. Overfør puljen af de to huller til et kryorør og læg hætteglasset i en cellefrysebeholder.
  6. Opbevar cellefrysebeholderen ved -80 °C i 24 timer, og overfør derefter hætteglassene til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.

6. Kultur af cellemonolag afledt af 3D-organoider

BEMÆRK: Monolag af svineorganoidceller dyrkes i et 2D-medium sammensat af det dyrkningsmedium, der anvendes til 3D-organoider suppleret med 20% FBS.

  1. Forberedelse af materialer
    1. Forbered 2D-mediet, og opbevar det på RT.
    2. Forvarm enzymdissociationsreagenset suppleret med 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer i et vandbad ved 37 °C.
  2. Belægning af kulturindsatsen
    1. Steriliser en pincet og overfør dem til biosikkerhedsskabet.
    2. Anbring cellekulturindsatserne (0,33 cm2) i en plade med 24 brønde med pincetten.
    3. Forbered overfladebehandlingsopløsningen indeholdende kollagen IV fortyndet ved 50 μg/ml i kold PBS. Pipet op og ned for at blande
    4. Der tilsættes 150 μL af den fortyndede kollagen IV-opløsning til hver cellekulturindsats, hvilket svarer til 22,7 μg/cm2.
      BEMÆRK: Vend forsigtigt pipetten lodret ind i midten af den permeable membran, og kontroller, at kollagenopløsningen dækker hele membranen.
    5. Pladen anbringes i en 5 % CO2 -kuvøse ved 37 °C og lades stå natten over (eller i mindst 3 timer).
  3. Såning af 3D-organoidceller i cellekulturindsatser
    1. Der fremstilles en cellesuspension fra 3D-organoiderne som beskrevet i trin 4.2.1 til 4.2.7.
    2. Tæl cellerne med en fortynding på 1:2 i trypanblå med en celletæller, og beregn det nødvendige volumen til såning af 2,5 x 10 5 celler pr. kulturindsats, svarende til 7,6 x 105 celler/cm2.
    3. Det nødvendige volumen af cellesuspensionen centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    4. Under centrifugering suges belægningsopløsningen forsigtigt fra kulturindsatserne og lades tørre ved RT under emhætten uden låg i 5 min.
    5. Efter centrifugering kasseres supernatanten, og cellepellet resuspenderes i det nødvendige volumen 2D-medium suppleret med 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer. Et volumen på 200 μL 2D-medium indeholdende cellerne er nødvendigt for hver indsats.
    6. Der tilsættes 200 μL af cellesuspensionen (2,5 x 105 celler) på den coatede permeable membran (apikal side) (figur 4A).
      BEMÆRK: Pipet langsomt i midten af membranen og hold spidsen lodret.
    7. Der tilsættes 500 μL af 2D-mediet suppleret med 10 μM Y27632 ROCK-hæmmer til det nederste rum (basalsiden). Inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
    8. En dag efter såning udskiftes det apikale og basale medie med frisk 2D-medium uden Y27632 ROCK-hæmmeren.
    9. Skift 2D-mediet hver dag. Monolaget bliver sammenflydende 1 dag efter såning og kan derefter bruges til forsøg.
      BEMÆRK: En TEER-værdi (transepitelial elektrisk modstand) over blindprøven (indsæt uden celler) bekræfter, at sammenløbet er nået (figur 4B).

7. Immunfarvning af organoidcellemonolag

  1. Fremstilling af opløsninger
    BEMÆRK: Juster mængden af opløsninger i henhold til antallet af brønde, der skal farves; Der kræves 200 μL af opløsningen ved hvert trin for en brønd. Henvisninger til alle kommercielle produkter findes i materialetabellen.
    1. Forbered en 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning under en kemisk hætte ved at tilsætte 5 ml 32% PFA til 35 ml PBS. Der tilberedes 10 ml alikvoter og opbevares ved -20 °C.
      FORSIGTIG: Manipuler altid PFA under kemikaliehætten, mens du bærer nitrilhandsker.
    2. Forbered en opløsning af 0,2% Triton X100-PBS ved at tilsætte 2 μL Triton X100 til 1 ml PBS umiddelbart før brug. Hold på RT.
    3. Forbered en 10% bovin serumalbumin (BSA)-PBS-opløsning ved at tilsætte 100 mg BSA til 1 ml PBS. Hold på RT.
    4. Forbered en 1% BSA-PBS opløsning ved at tilføje 10 mg BSA til 1 ml PBS. Hold på RT.
    5. Der fremstilles en opløsning af det primære occludin-antistof fortyndet ved 1:200 ved at tilsætte 5 μl primært antistof til 995 μl 1 % PBS BSA. Opbevar opløsningen på is.
    6. Der fremstilles en opløsning af det sekundære antistof fortyndet ved 1:1.000 ved tilsætning af 1 μL sekundært antistof til 999 μL 1% BSA-PBS. Hold opløsningen på is, beskyttet mod lys.
    7. Der fremstilles en opløsning af phalloidin TRITC ved 10 μg/ml ved tilsætning af 10 μl TRITC ved 1 mg/ml til 990 μl PBS. Hold på is, beskyttet mod lys.
  2. Immunfarvning
    BEMÆRK: Medmindre andet er angivet, udføres alle inkubationer ved RT under langsom omrøring på en gyngeplatform (30 o / min). Immunfarvningen udføres direkte i cellekulturindsatsen.
    1. Fjern det basale og apikale medium. Placer pladen under den kemiske hætte.
    2. Monolagene vaskes to gange med 200 μL PBS ved RT og inkuberes i 5 min.
    3. Fastgør cellemonolagene med 200 μL 4% PFA ved RT og inkuber i 20 minutter ved RT.
    4. Monolagene vaskes to gange med 200 μL PBS ved RT og inkuberes i 5 min.
      BEMÆRK: Efter fikserings- og vasketrinnene kan monolaget opbevares ved 4 °C i PBS i 1 uge.
    5. PBS fjernes, permeabiliseres med 200 μL 0,2% Triton X100-PBS, og inkuberes i 20 min.
    6. Monolagene vaskes to gange med 200 μL PBS ved RT og inkuberes i 5 min.
    7. Der tilsættes 200 μL primær antistofopløsning i 1 % BSA-PBS, og der inkuberes natten over ved 4 °C under langsom omrøring på en gyngeplatform. Inkluder en negativ kontrolbrønd ved kun at tilføje 1% BSA-PBS uden det primære antistof.
    8. Monolagene vaskes tre gange med 200 μL PBS ved RT og inkuberes i 5 min.
    9. Der tilsættes 200 μL sekundært antistof i 1% BSA-PBS og inkuberes ved RT i 2 timer, beskyttet mod lyset.
    10. Monolagene vaskes tre gange med 200 μL PBS ved RT og inkuberes i 5 min.
    11. Der tilsættes 200 μL phalloidin TRITC ved 10 μg/ml og inkuberes i 10 minutter.
    12. Monolagene vaskes to gange med 200 μL PBS ved RT og inkuberes i 5 min.
    13. Fjern PBS og skær membranen med en skalpel.
    14. Gendan membranen med en pincet og læg den på et mikroskopglas med den apikale side opad.
    15. Tilsæt 15 μL af monteringsmediet suppleret med DAPI ved 1:1.000 direkte på membranen. Anbring en dæksel og forsegling.
    16. Opbevares ved 4 °C, beskyttet mod lys, indtil billeddannelse.

Representative Results

I henhold til protokollen beskrevet ovenfor opnås epitelkrypter fra svinetarmen og kryopræserveres til langtidsopbevaring i flydende nitrogen (figur 1 og figur 2A). Efter optøning podes kryptstamcellerne i ECM (figur 2B). Kryptstrukturen går normalt tabt efter dette trin på grund af opløsningen af kryptstrukturen i ECM. Organoiderne kan observeres inden for 3-4 dage og vokser derefter hurtigt og udvikler spirende strukturer (figur 2B). Vi opnåede med succes organoider efter optøning af frosne krypter i >80% af forsøgene. Ca. 10 dage efter optøning (ifølge organoidernes væksthastighed) udføres en passage af organoider for at udvide kulturen (figur 3). Organoiderne vokser hurtigere efter opdeling, og de præsenterer forskellige morfologier, med nogle cystiske og et flertal af spirende organoider. For optimal vedligeholdelse af kulturen skal organoiderne, der anvendes til passage, have et klart og tomt lumen og veldefinerede kanter (eksempler angivet med grønne pile) uden sort snavs i lumen (angivet med røde pile), som observeret hos modne organoider (figur 3). Vi fandt ud af, at sorte cellerester begynder at akkumulere omkring dag 6 efter passering. Således anbefales opdeling eller frysning af organoiderne på dag 4-5 efter passering.

Organoidernes modenhedsstadium er også et vigtigt punkt i opnåelsen af cellemonolag. Organoider med avanceret modenhed (indikeret ved tilstedeværelsen af sorte cellerester i lumen) er ikke optimale til frø monolag. Vi dissocierer normalt 3D-organoider 4 dage efter passage for at indsamle celler til 2D-kultur. Ca. en til tre brønde med 3D-organoider dyrket ved 3.000 celler pr. 50 μL kuppel på ECM er nødvendige til såning af en kulturindsats med 2,5 x 105 celler. Celler binder sig og danner et fuldt sammenflydende monolag inden for 1 dag (figur 4A), hvilket bekræftes af den høje TEER på ca. 700 Ω· cm2 (figur 4B). Imidlertid er cellekanterne vanskelige at visualisere ved brightfieldmikroskopi på dette tidlige tidspunkt, sandsynligvis på grund af et lavt differentieringsniveau. TEER forbliver høj i 3 dage (figur 4B).

Actinfarvning indikerer, at den apikale side af epitelcellerne er orienteret mod lumen i 3D-organoider (figur 5A). Organoidceller podet i kulturindsats danner et sammenflydende enkeltlag af epitelceller med den apikale side orienteret mod det øverste rum (figur 4B, C). Okklusionfarvning afslører tilstedeværelsen af tætte kryds på den apikale side af epitelcellerne i 3D-organoider og i cellemonolag (figur 5A-C).

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af de metoder, der anvendes til dyrkning af 3D-organoider og cellemonolag afledt af organoider. Epitelkrypter isoleres fra smågrisetarmen. Disse krypter kan i) bruges straks til dyrkning af 3D-organoider eller ii) fryses og opbevares i en biobank i flydende nitrogen. Kryopræserverede krypter kan optøs og bruges til dyrkning af 3D-organoider. 3D-organoidkulturen kan opretholdes med successiv opdeling eller fryses og opbevares i biobanken. Cellemonolag kan opnås fra 3D-organoidkulturen for at give adgang til den apikale side af cellerne og studere epitelbarrierefunktionen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Dyrkning af svinetarm 3D-organoider fra kryopræserverede epitelkrypter. (A) Repræsentativt mikroskopisk billede af nyligt isolerede jejunale krypter. (B) Repræsentative mikroskopiske billeder af 3D-organoider opnået efter optøning af jejunalkrypterne. Organoiderne blev dyrket i en 25 μL kuppel af ECM i en 48-brønds plade. Figuren viser billeder af 3D-organoiderne 4, 7, 8, 9 og 10 dage efter såning. Skalabjælken repræsenterer 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Morfologi af svinetarm 3D-organoider afledt af kryopræserverede epitelkrypter efter den første passage. Repræsentative mikroskopiske billeder, der viser udviklingen af organoider afledt af kryopræserverede jejunumkrypter efter den første passage fra dag 4 til dag 7. Grønne pile angiver klare organoider, der er egnede til passage eller såning af monolag. Røde pile angiver modne organoider, der ikke er egnede til opdeling eller såning af monolag; Således bør brønde anvendes før fremkomsten af denne morfologi. Skalabjælken repræsenterer 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Karakteristik af cellemonolag afledt af svins intestinale 3D-organoider . (A) Repræsentative mikroskopiske billeder af monolagsmorfologien over 3 dage. Jejunum organoidceller blev podet ved 2,5 x 105 celler i 0,33 cm2 cellekulturindsatser belagt med kollagen IV ved 50 ng / ml. Skalabjælken repræsenterer 500 μm. (B) Transepitelial elektrisk modstand (TEER) af organoidcellemonolag over 3 dage. Prikker forbundet med en linje svarer til den samme brønd på forskellige tidspunkter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Billeddannelse af svinejejunumorganoider dyrket i 3D eller 2D. Konfokal mikroskopibilleddannelse af (A) 3D-organoider 5 dage efter opdeling og (B,C) organoidcellemonolag 3 dage efter såning (B: XZ-sektion; C: XY sektion). DNA (blå) blev farvet med DAPI. Actin (rød) blev farvet med phalloidin. Occludin (grøn) blev farvet med et polyklonalt antistof. Hvide pile angiver okklusion lokaliseret ved det stramme kryds. Skalabjælken repræsenterer 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne protokol beskriver en metode, der anvendes til at kryopræservere epitelkrypter fra smågrisetarmen til langtidsopbevaring og efterfølgende dyrkning af 3D-organoider. Denne protokol bruger en fryseopløsning, der indeholder DMSO, FBS, Y27632 ROCK-hæmmeren, DMEM og antibiotika. En anden undersøgelse hos svin opnåede organoider fra krypter, der var kryopræserveret i en lignende fryseopløsning, men uden ROCK-hæmmeren15. Y27632 ROCK-hæmmeren blev inkluderet for at forhindre apoptose og opretholde stamcellepuljen, da epitelkryptceller efter optøning dissocieres, hvilket kan føre til celledød ('anoikis')27,28. Interessant nok er hesteenteroider opnået fra epitelkrypter frosset i et dyrkningsmedium, der kun indeholder DMEM og DMSO16; Denne enkle metode er endnu ikke testet for svineepitelkrypter. Andre metoder er blevet offentliggjort til dyrkning af humane og svineorganoider fra frosne væv eller biopsier i stedet for epitelkrypter 4,17. Fordelen ved denne metode er evnen til direkte at kryopræservere tarmvævene uden at udføre kryptisoleringsproceduren, hvilket kræver tid og laboratorieudstyr. Dette kan være praktisk, når vævene skal indsamles langt fra laboratoriet. Ved isolering af krypterne umiddelbart efter slagtning kan store dele af tarmen imidlertid behandles for at opnå et meget højt antal krypter, hvilket ikke er tilfældet, når man starter fra små frosne vævsfragmenter. Efter optøning af epitelkrypter blev organoider observeret fra 3-4 dage efter såning og opdelt efter 10 dage. Dette er en langsommere væksthastighed end ved start af kulturen fra friske epitelkrypter, for hvilke organoiderne blev opnået fra dag 1 efter såning og kan normalt opdeles omkring dag 511. Khalil et al. rapporterede også en forsinket vækst af svineenteroider, når de startede fra frosne krypter15, hvilket tyder på, at stamceller kan kræve tid til at genvinde deres proliferative kapacitet. Vi opnåede også et lavere antal organoider, når vi startede fra frosne krypter sammenlignet med friske krypter, hvilket kan skyldes stamcellernes død under fryseprocessen. I nogle forsøg på optøning af krypter (<20%) fik vi ikke organoider fra frosne krypter, sandsynligvis på grund af en suboptimal kryopræserveringsprocedure (f.eks. forsinket frysning efter kryptisolering på sandsynligvis mere end 1 time). Derfor anbefaler vi at holde krypterne på is, indtil de tæller, og fryse dem så hurtigt som muligt.

Til 3D-organoider valgte vi at bruge et kommercielt organoidkulturmedium formuleret til mennesker. Faktisk har tidligere rapporter vist, at svins tarmorganoider vokser effektivt med dette medium 8,11,14,19,25,26,29,30. Det er af interesse for dette dyrkningsmedium at være klar til brug og have en standardiseret koncentration af vækstfaktorer inden for en batch. Dette kulturmedium er imidlertid dyrt, dets sammensætning er ikke afsløret, og det er således ikke muligt at modulere dets sammensætning. I modsætning hertil har andre undersøgelser dyrket svinetarmorganoider i tilpassede medier indeholdende farmakologiske hæmmere, rekombinant vækstfaktor og / eller konditionerede medier 5,6,7,21. Selv om denne metode er meget fleksibel og billigere, er den tidskrævende til fremstilling af konditionerede medier og kan mangle reproducerbarhed på grund af potentiel variation i koncentrationen af vækstfaktorer i konditionerede medier. Kvaliteten af hver batch af konditionerede medier bør således valideres ved måling af organoidvækst eller markørgenekspression31.

En undersøgelse har vist, at svinejejunalorganoider dyrket i det samme kommercielle organoidkulturmedium, der anvendes her, voksede hurtigere og syntes mindre differentieret sammenlignet med enteroider dyrket med medier, der indeholdt rekombinant vækstfaktor og / eller konditionerede medier23. En høj proliferativ tilstand letter kulturen af 3D-organoider, men kan kræve inducerende differentiering for at være mere repræsentativ for intestinale fysiologiske egenskaber. I denne protokol, for passage af 3D-organoider, er cellerne fuldt dissocieret til tælling, hvilket gør det muligt at kontrollere antallet af celler podet i ECM. Dette øger reproducerbarheden af fænotypen af organoider, som er stærkt påvirket af deres densitet. Desuden undgår man at tælle cellerne for at opnå for lav eller en overfyldt kultur, der kræver tilpasning af kulturplanen. De fleste andre undersøgelser forberedte organoidfragmenter, der ikke var fuldt dissocieret til enkeltceller, og anvendte et fortyndingsforhold til passering. Denne metode er mere ligetil, men kan fremkalde variabilitet i henhold til kulturens organoidtæthed.

Til kulturen i monolag podes organoidceller i kulturindsatser, der er forbelagt med et tyndt lag ECM, der tillader fastgørelse af celler, men undgår vækst af organoider i 3D. Denne protokol anvendte kollagen type IV som et ECM-protein, som beskrevet tidligere hos svin23. Andre undersøgelser med svineorganoide monolag brugte den samme tumorafledte ECM, der blev brugt her, til dyrkning af 3D-organoider 6,8,9,21,25,30. Fordelen ved at anvende kollagen er evnen til at standardisere proteinkoncentrationen med en fuldt defineret sammensætning, hvilket ikke er tilfældet i den tumorafledte ECM. Et kritisk skridt for succesen med kulturen af cellemonolag er at være opmærksom på det visuelle udseende af forløberen 3D-organoider, som skal have veldefinerede kanter og et tomt lumen uden sort affald. Faktisk er organoider med et højt modningsniveau og en lav proliferativ hastighed ikke en passende kilde til celler til 2D-kultur. Således er tidspunktet for dissociation af 3D-organoider i enkeltceller afgørende for succesen med dette trin.

Kulturen af 2D-monolag fra enkeltceller tillader standardisering af antallet af frøede celler, hvilket er vanskeligere, når man starter fra organoidfragmenter, som udført i nogle andre metoder. Vi såede 7,6 x 10 5 celler pr. cm 2, hvilket er højt sammenlignet med de fleste andre undersøgelser 21,22,23 hos svin, der brugte en lavere celletæthed, der spænder fra0,25 x 10 5 celler pr. cm 2 til 1,78 x 10 5 celler pr. cm 2. Kravet om et stort antal organoidceller udgør en begrænsning af denne protokol, men det tillod os hurtigt at opnå et sammenflydende monolag, der fuldt ud dækker kulturindsatsen efter 1 dag. I modsætning hertil opnåede Vermeire et al.23 sammenløb efter 4-7 dage med en lavere tæthed af celler podet (fra 0,25 x 10 5 celler / cm 2 til 0,4 x 105 celler /cm 2). Nogle undersøgelser har også brugt svineorganoidcellemonolag, der ikke fuldt ud dækkede dyrkningsoverfladen for infektioner med vira 8,30. Under disse forhold er den apikale side af epitelceller tilgængelig til behandlinger, men fuldt sammenflydende monolag er påkrævet, hvis målet er at studere næringsstofabsorption eller epitelpermeabilitet.

Til organoidcellemonolag blev der anvendt et kommercielt organoidkulturmedium suppleret med 20% FBS, baseret på en nylig undersøgelse af bovin enteroidafledte monolag32. I vores test var tilskuddet med 20% FBS nødvendigt for at opnå fuldt sammenflydende monolag, sandsynligvis på grund af et højt vækstfaktorkrav. Tværtimod har andre undersøgelser, der bruger det samme kommercielle medium, etableret monolag uden yderligere FBS 8,25,30, men uden at nå fuld sammenløb. Andre undersøgelser har også brugt tilskud med 20% FBS i et tilpasset medium til dyrkning af svineorganoidcellemonolag21,22. I vores eksperimenter er TEER høj 1 dag efter såning (ca. 700 Ω·cm 2) og forbliver høj indtil dag 3 (ca. 1.500 Ω·cm2; dette er i overensstemmelse med dannelsen af tætte kryds, som indikeret ved ekspressionen af okklusion. Van der Hee et al. opnåede lignende TEER-værdier over 72 timer for jejunum organoidcellemonolag21. De viste også, at monolag kan opretholdes indtil dag 12-15 med daglige medieændringer. I modsætning hertil har andre undersøgelser rapporteret meget lavere TEER-værdier (ca. 200 Ω·cm2) for svineorganoidcellemonolag 6,22. Disse forskelle mellem undersøgelser kan være relateret til det undersøgte tarmsegment eller til de anvendte medier, der påvirker epiteldifferentiering.

Afslutningsvis letter ovennævnte protokol til dyrkning af svineintestinale 3D-organoider fra frosne epitelkrypter tilrettelæggelsen af kulturarbejdet. Det reducerer behovet for frisk væv, der skal opnås fra levende dyr. Vi forklarer også, hvordan man etablerer fuldt sammenflydende cellemonolag afledt af svineorganoider på mindre end 3 dage. Således kan vores protokoller være nyttige ressourcer for forskere, der studerer svinets tarmepitel til veterinær eller biomedicinsk forskning.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Institut Carnot France Futur Elevage ("OrganoPig" -projektet) og af INRAE HOLOFLUX ("Holopig" -projektet). Forfatterne er taknemmelige for Genotoul kernefaciliteter (TRI). Vi anerkender Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) for omhyggelig korrekturlæsning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G Store at room temperature.
15 mL conical tube Sarstedt 62.554.502
24-well cell culture plate Corning 003526
48-well cell culture plate Corning 003548
50 mL polypropylene conical tube Falcon 352070
Bovine Serum Albumine (BSA) Euromedex A6003 Store at 4 °C.
Centrifuge Universal 320 R Hettich 1406
Collagene type IV from human placenta Sigma C5533 Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C.
CoolCell LX Cell Freezing Container Corning 432003 Used to cryopreserve crypts and organoids.
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific 16842556
Coverslips, 22 mm x 50 mm VWR 630-1845
Cryotube ClearLine 1 mL Clear line 390706 Used to cryopreserve crypts and organoids.
DAPI Invitrogen D1306 Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C
Dithiothreitol (DTT) Merck 10197777001 Store at 4 °C.
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 31966047 Store at 4 °C.
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Corning 25-950-CQC Store at room temperature.
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide VWR 631-9483
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106 Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Fisherbrand Sterile Cell Strainers Thermo Fisher Scientific 22363549 Used for crypt isolation.
Fixed Tilt 3D Platform Rotator VWR 97025-564 Used for incubations in the immunostaining protocol.
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010015 Store at 4 °C.
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher Scientific 12605-010 Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008 Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell Technology 6010 Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week.
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Corning 353095
Inverted microscope Nikon Eclipse TS2
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C.
Mounting medium for fluorescence with DAPI Vectashield H1250 Store at 4 °C.
Occludin polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 71-1500 Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200.
Paraformaldehyde 32% Electron microscopy science 15714 Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Phalloidin TRITC Sigma P1951 Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C.
Primocin InvivoGen ant-pm-05 Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C.
ROCK Inhibitor (Y27632) ATCC ACS-3030 Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C.
Rotating shaker mix XL Clear line 062646CL Used for crypt isolation.
Stripette Serological Pipets 10 mL Corning 4488
Tissue Culture Dish TPP 93100
Triton X100 Sigma 8787 Store at room temperature.
Trypan Blue stain 0.4% Thermo Fisher Scientific T10282 Store at room temperature.
Vacuum system Vacusip Integra 159000 Used to remove the medium of organoid wells.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).
  5. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).
  6. Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).
  7. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  8. Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).
  9. vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).
  10. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).
  11. Mussard, E., et al. The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).
  12. Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  13. Wang, Z., et al. Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells. Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).
  14. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
  15. Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).
  16. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).
  17. Tsai, Y. -H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
  18. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  19. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  20. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  21. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  22. Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).
  23. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut. Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).
  24. Luo, H., et al. Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro. Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).
  25. Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2. Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).
  26. Engevik, A. C., et al. Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters. Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).
  29. Ferrandis Vila, M., et al. Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum. PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).
  30. Li, L., et al. IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia. Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).
  31. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  32. Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).

Tags

Biologi nr. 192
Kultur af pattegrise Intestinal 3D organoider fra kryopræserverede epitelkrypter og etablering af cellemonolag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mussard, E., Lencina, C., Boudry,… More

Mussard, E., Lencina, C., Boudry, G., Achard, C. S., Klotz, C., Combes, S., Beaumont, M. Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (192), e64917, doi:10.3791/64917 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter