Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה. אנו מתארים גם שיטה להקמת חד-שכבות תאים הנגזרות מאורגנואידים תלת-ממדיים, המאפשרים גישה לצד האפי של תאי אפיתל.
Abstract
אורגנואידים של המעי משמשים יותר ויותר לחקר אפיתל המעי לצורך מידול מחלות עיכול, או כדי לחקור אינטראקציות עם תרופות, חומרים מזינים, מטבוליטים, פתוגנים והמיקרוביוטה. שיטות לתרבית אורגנואידים במעיים זמינות כיום עבור מינים רבים, כולל חזירים, שהוא מין בעל עניין רב הן כחיית משק והן כמודל תרגום לבני אדם, למשל, לחקר מחלות זואונוטיות. כאן, אנו נותנים תיאור מעמיק של הליך המשמש לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר מקריפטים אפיתל קפואים. הפרוטוקול מתאר כיצד לשמר בהקפאה קריפטות אפיתל ממעי החזיר ואת ההליכים הבאים לתרבית אורגנואידים תלת ממדיים במעי. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם: (i) הדיסוציאציה הטמפורלית של בידוד הקריפטות מהתרבות של אורגנואידים תלת-ממדיים, (ii) הכנת מלאי גדול של קריפטים שמורים בהקפאה שמקורם במקטעי מעיים מרובים וממספר בעלי חיים בבת אחת, ובכך (iii) הפחתת הצורך לדגום רקמות טריות מבעלי חיים חיים. אנו גם מפרטים פרוטוקול ליצירת חד-שכבות תאיות שמקורן באורגנואידים תלת-ממדיים כדי לאפשר גישה לצד האפי של תאי אפיתל, שהוא האתר של אינטראקציות עם חומרי מזון, מיקרובים או תרופות. בסך הכל, הפרוטוקולים המתוארים כאן הם משאב שימושי לחקר אפיתל מעיים חזיר במחקר וטרינרי וביו-רפואי.
Introduction
אפיתל המעי נוצר על ידי monolayer של תאים המכסים את רירית העיכול בממשק עם הסביבה הלומינלית. מיקום זה קשור לתפקודים מגוונים, כגון ספיגת חומרי מזון ותפקוד המחסום, הנתמכים על ידי נוכחות תאי גזע וסוגי תאי אפיתל ממוינים מרובים (תאי ספיגה, אנטרואנדוקרינית, פאנת וגביע)1. קווי תאים אימורטליים המשמשים באופן מסורתי לחקר תאי אפיתל יש מגבלות גדולות, שכן הם אינם משקפים את המורכבות התאית של אפיתל המעי ומציגים הפרעות גנומיות2. הפיתוח של אורגנואידים תלת מימדיים (3D) על ידי Sato et al.3 סיפק מודל חדש לחקר אפיתל המעי עם רלוונטיות פיזיולוגית משופרת. ואכן, אורגנואידים במעיים נגזרים מתאי גזע שלא עברו טרנספורמציה, מורכבים מסוגי תאים מרובים, ומשחזרים את הפונקציונליות של אפיתל המעי. אורגנואידי מעיים משמשים יותר ויותר להבנת ההתפתחות והתפקודים של אפיתל המעי והאינטראקציות שלו עם פתוגנים, חומרים מזינים, רעלים, תרופות, המיקרוביוטה והמטבוליטים שלה2.
השיטות שפותחו בתחילה עבור בני אדם ועכברים, המשמשות לתרבית אורגנואידים במעיים הותאמו לאחרונה למינים אחרים, כולל חזירים4. גונזלס ואחרים 5 היו הראשונים לגדל אורגנואידים חזירים מהג'ג'ונום; מאז, אורגנואידים חזיריים תוארו עבור מקטעי מעיים אחרים (תריסריון, איליאום ומעי גס)6,7,8, והוכחו כשומרים על פנוטיפ ספציפי למיקום 9,10,11. אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר משמשים כיום בדרך כלל לחקר ההשפעה של חומרים מזינים12,13 או זיהומים אנטריים 6,8,14.
רוב המחקרים תיארו את התרבית של אורגנואידי מעיים החל מקריפטות אפיתל מבודדות טריות. עם זאת, זה לא תמיד אפשרי מסיבות לוגיסטיות, במיוחד כאשר עובדים עם בעלי חיים גדולים כגון חזירים. ואכן, מתקנים לבעלי חיים לחזירים יכולים להיות ממוקמים הרחק מהמעבדה שבה מתורבתים אורגנואידים, מה שמסבך את ארגון העבודה. יתר על כן, תרבות אורגנואידים גוזלת זמן; לכן, אין זה מעשי לגדל בו זמנית קווי אורגנואידים מרובים, למשל, ממקטעי מעיים שונים או מכמה בעלי חיים. כדי לעקוף בעיות אלה, כמה מחקרים בבני אדם, סוסים וחזירים תיארו שיטות לתרבית אורגנואידים מרקמות מעי קפואות (או ביופסיות) או מקריפטות אפיתל מבודדות 4,15,16,17. שיטות אלה מאפשרות שימור בהקפאה של תאי גזע אפיתל מעיים ממקטעי מעיים מרובים של חיה אחת, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי לגדל אורגנואידים בעת הצורך. יתר על כן, זה מאפשר הפחתה חזקה במספר בעלי החיים המשמשים כתורמים של תאי גזע, שכן מלאי גדול של crypts cryopreserved ניתן ליצור (עקרונות של 3R). יתרון נוסף של שיטה זו הוא גידול אורגנואידים במעיים רק מבעלי חיים בעלי עניין לאחר קבלת תוצאות פנוטיפיות או גנוטיפיות, וזה חסכוני מאוד.
In vivo, תאי אפיתל המעי מקוטבים, כאשר הצד האפי מופנה לכיוון הלומן. במבחנה, באורגנואידים תלת-ממדיים, הצד האפי של תאי אפיתל פונה גם הוא אל הלומן (כלומר, בתוך האורגנואידים)4. ארגון זה מונע גישה לצד האפיקאלי, דבר המהווה בעיה כאשר חוקרים את ההשפעות של רכיבים לומינליים (למשל, חומרי מזון, חיידקים, מטבוליטים) על תאי אפיתל. כדי לעקוף חיסרון זה, פותחו מספר שיטות, כגון תרבית תאי אורגנואידים כחד-שכבות דו-ממדיות, מיקרו-הזרקה והיפוך קוטביות ("אורגנואידים אפיקליים")18,19. התרבית של חד-שכבות תאים אורגנואידים מסתמנת כמערכת היעילה והגמישה ביותר. העיקרון הוא לנתק אורגנואידים תלת-ממדיים לתאים בודדים ולזרוע אותם על כלי תרבית תאים שהיה מצופה בעבר בשכבה דקה של מטריצה חוץ-תאית (ECM)20. בתנאי תרבית אלה, הצד האפי של תאי האפיתל פונה כלפי מעלה, ולכן נגיש לטיפולים ניסיוניים20. התרבית של חד-שכבות תאים אורגנואידים הותאמה לאחרונה למעי החזיר21,22; חד-שכבות תאיות שמקורן באורגנואידים תלת-ממדיים של חזירים שימשו ליישומים רבים, כולל מחקר של זיהומים אנטריים 6,23,24,25, הובלת חומרים מזינים9 ומידול מחלות עיכול 26.
כאן, המחקר הזה מציג לראשונה פרוטוקול מפורט לתרבית ולתחזוקה של אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר שמקורם בקריפטות אפיתל שמורות בהקפאה (איור 1). לאחר מכן, מתואר פרוטוקול ליצירת מונושכבות תאים מאורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר. השיטות המתוארות כאן מספקות כלים ניסיוניים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את אפיתל מעי החזיר להובלת חומרי מזון, תפקוד מחסום ואינטראקציות בין מיקרואורגניזם מארח.
Protocol
פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (N°TOXCOM/0136/PP) בהתאם לדירקטיבה האירופית להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות (2010/63/EU). פרוטוקול זה מתואר עבור jejunum כדוגמה, אבל זה יכול לשמש עבור כל קטע של המעי הדק והגס (תריסריון, jejunum, ileum, המעי הגס).
1. בידוד של crypts אפיתל מן המעי חזרזיר
הערה: הכינו מלאי של מדיום עיט מעובד מלא של דולבקו (DMEMc) עם DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S). הכינו 50 מ"ל aliquots ולאחסן אותם ב 4 °C במשך חודש 1.
- הכנת פתרונות (שייעשה ביום בידוד הקריפטה)
- הכינו את תמיסת הדיסוציאציה המכילה מלח חוצץ פוספט (PBS), 3 mM dithiothreitol (DTT), 9 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 10 μM Y27632 ROCK inhibitor, ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) ואחסנו על קרח.
- הכינו את תמיסת ההקפאה המכילה DMEMc, 10% FBS, 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) ומעכב סלע Y27632 10 μM ואחסנו על קרח (ריכוז FBS הסופי הוא 18%).
- הכינו את תמיסת ההובלה המכילה PBS קר בתוספת מכפיל רווח של 1% ואחסנו אותה על קרח.
- בידוד של קריפטות אפיתל
- לשחוט חזרזיר על ידי electronarcosis ואחריו exsanguination.
- מיד לאחר השחיטה, לפתוח את הבטן של חזרזיר עם אזמל ולהסיר את כל המעי.
- לאסוף כ 2 ס"מ של קטע מעיים ולאחסן אותו בתמיסת הובלה קרה. שומרים את המקטע על קרח עד לבידוד הקריפטה (עד שעתיים).
- מניחים את הרקמה בצלחת פטרי. פתח את קטע המעי לאורך, ובזהירות לשטוף את הרקמה PBS קר בתוספת 1% P / S כדי להסיר את תוכן המעי.
- העבירו את הרקמה לצלחת פטרי חדשה מלאה ב-10 מ"ל של PBS קר בתוספת 1% P/S.
- החזיקו את הרקמה בפינצטה והסירו את הווילי ואת הריר שנותר על ידי גירוד עם שקופית מיקרוסקופ.
הערה: הסרת הווילי (המבנה בצורת הלשון) יכולה להיבדק על ידי תצפית מיקרוסקופית של הסופרנטנט. - מעבירים את הרקמה לצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה קרה כקרח ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר מסתובב (15 סל"ד).
- מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי חדשה ומוסיפים 10 מ"ל PBS קר בתוספת 1% P/S.
- בודד את הקריפטות באופן מכני על ידי גירוד חזק של הרירית עם שקופית מיקרוסקופ.
הערה: תחת מיקרוסקופ, אמת את נוכחותם של קריפטים אפיתליאליים ב-PBS (איור 2A). - שואפים את תמיסת הקריפטה עם צינור סרולוגי ומסננים דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
- Pipet 10 μL של הפתרון ולאמת את נוכחותם של crypts תחת מיקרוסקופ. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- תחת ארון בטיחות ביולוגית סטרילי, השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את גלולת הקריפטות ב-10 מ"ל של DMEMc קר בתוספת מעכב רוק 10 מיקרומטר Y27632.
- Pipet 10 μL של פתרון הקריפטה לתוך צלחת 48 באר. ספירה ידנית של מספר הקריפטים תחת מיקרוסקופ עם הגדלה של פי 10, וחישוב ריכוז הקריפטים למ"ל של תמיסה.
הערה: ניתן להשתמש בקריפטות המבודדות ישירות לתרבית אורגנואידים במעי. עם זאת, לעתים קרובות נוח יותר להקפיאלשמר אצווה גדולה של קריפטות מכל חזרזיר ולהשתמש בהם מאוחר יותר לתרבות אורגנואידים.
- הקפאת קריפטים אפיתליאליים
- העברת נפח המתאים 900 crypts בצינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת הקריפטות ב -1 מ"ל של תמיסת ההקפאה. מעבירים לצינור הקפאה ומניחים את הבקבוקון במיכל להקפאת תאים.
- אחסנו את מיכל הקפאת התאים בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות ולאחר מכן העבירו את הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
2. הקמת אורגנואידים תלת ממדיים במעי חזרזיר מקריפטות אפיתל קפואות
הערה: אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזרזיר מגודלים בתרבית מסחרית שפותחה לגידול אורגנואידים אנושיים, בתוספת 1% P/S ו-100 מיקרוגרם/מ"ל של חומר אנטי-מיקרוביאלי לתאים ראשוניים, ומאוחסנים ב-4°C למשך עד שבוע. מטריצה חוץ-תאית שמקורה בגידול (ECM) משמשת לתרבית של אורגנואידים תלת-ממדיים. כל ההפניות של מוצרים מסחריים מוצגות בטבלת החומרים.
- הכנת חומרים
- מניחים את קצות הפיפט על -20 מעלות צלזיוס (לפחות לילה).
- מניחים את aliquots קפוא של ECM (500 μL) ב 4 °C לפחות 1 שעה מראש.
- מחממים מראש צלחת 48 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .
- מקם את מדיום התרבות ב- RT.
- מראש לחמם אמבט מים ב 37 °C (77 °F).
- הניחו דלי קרח קטן מתחת למכסה המנוע בתנאים אספטיים.
- הפשרת קריפטות אפיתל קפואות
- הפשיר במהירות בקבוקון המכיל 900 crypts קפואים באמבט מים ב 37 ° C (פחות מ 5 דקות).
- העבר את פתרון הקריפטה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להסיר את supernatant
- הוסף 150 μL של ECM עם טיפים מקוררים כדי לקבל ריכוז סופי של 150 crypts לכל 25 μL של ECM. Pipet למעלה ולמטה 10 פעמים כדי להשיג השעיה הומוגנית של crypts ב ECM.
הערה: תמיד לשמור את ECM על קרח כדי למנוע פילמור. השתמש תמיד בקצות פיפט מקוררים מראש ב -20 ° C כדי לתפעל את ECM. פיפט לאט כדי למנוע יצירת בועות אוויר ב- ECM. ECM לא מדולל משמש בשלב זה כדי למנוע את קריסת הטיפות הקטנות. - זרעו שש בארות עם טיפה של 25 μL לכל באר עם קצוות מקוררים בצלחת 48 בארות שחוממה מראש.
הערה: שמרו על קצה אנכי, במרכז הבאר, ופיזרמו לאט מבלי להכניס אוויר לקבלת כיפה. כאן, לוחות 48 באר משמשים, שכן מספר אורגנואיד הוא בדרך כלל נמוך כאשר מתחילים crypts קפוא. - דגירה במשך 30 דקות באינקובטור 37°C, 5% CO2 לפילמור של ECM.
- הוסף 250 μL לכל באר של מדיום תרבית ב- RT. דגירה בחממה של 37 ° C, 5% CO 2 ושנה את מדיום התרבית כל2-3 ימים
הערה: הקריפטים בדרך כלל אינם נראים לאחר הליך ההפשרה, ורוב התאים מנותקים ב-ECM (איור 2B).
3. מעבר של אורגנואידים תלת ממדיים במעי חזרזיר שמקורם בקריפטות קפואות
הערה: הזמן להשגת אורגנואידים מקריפטים קפואים הוא בדרך כלל ארוך יותר מאשר כאשר מתחילים מקריפטים טריים. אורגנואידים בדרך כלל מוכנים לפיצול 10 ימים לאחר ההפשרה (איור 2B).
- הכנת חומרים
- מניחים את aliquots קפוא של ECM (500 μL) ב 4 °C במשך לפחות 1 שעות.
- מראש לחמם את צלחות 24 באר ב 37 ° C.
- לחמם מראש את PBS ואת מגיב דיסוציאציה אנזים בתוספת 10 μM Y27632 מעכב סלע באמבט מים ב 37 ° C.
- מקם את מדיום התרבות ב- RT.
- הניחו דלי קרח קטן מתחת למכסה המנוע בתנאים אספטיים.
- מעבר אורגנואידים תלת ממדיים שמקורם בקריפטים קפואים
- הסר את אמצעי התרבית ושטוף עם 250 μL של PBS שחומם מראש ב 37 ° C.
- הוסף 250 μL של מגיב דיסוציאציה אנזים שחומם מראש בתוספת 10 μM Y27632 מעכב ROCK ב 37 ° C בכל באר.
הערה: בשל המספר הנמוך של אורגנואידים, הדיסוציאציה של אורגנואידים מבוצעת ישירות בכל באר. - נתק את האורגנואידים ב- ECM על ידי גירוד עם פיפט P1000, והומוגניזציה בזהירות על ידי פיפטינג חמש פעמים.
- יש לדגור במשך 5 דקות באינקובטור של 37°C, 5% CO2 . נתק את התאים על-ידי פיפטציה למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפט P1000.
הערה: המטרה היא להשיג תאים מבודדים או צבירי תאים קטנים (<10 תאים). אמת את הדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ. אם עדיין נצפים שברים גדולים של אורגנואידים, חזור על שלב 3.2.4. - הוסף 500 μL של DMEMc בכל באר המכילה תאים מנותקים, ואגר עד 12 בארות בצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל DMEMc קר.
- צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של DMEMc קר.
- ספרו את התאים עם דילול של 1:2 בכחול טריפאן עם מונה תאים.
הערה: מונה התאים האוטומטי יכול לספור את התאים בתוך אשכולות קטנים, אם קיימים. - צנטריפוגה את הנפח הדרוש של תמיסת התא כדי לקבל 3,000 תאים חיים לכל כיפה (כיפה אחת לכל באר של צלחת 24 בארות) ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- השהה מחדש את התאים עם 17 מיקרוליטר DMEMc קר לכל 3,000 תאים חיים על קרח. התאם את עוצמת הקול למספר הבארות הנדרש.
- הוסיפו באיטיות 33 מיקרוליטר של ECM קר עם קצוות מקוררים לכל 3,000 תאים חיים וצרו הומוגניות על קרח מבלי ליצור בועות. התאם את עוצמת הקול למספר הבארות הנדרש.
הערה: התאים מושעים מחדש בתמיסה המכילה 1/3 DMEMc ו- 2/3 ECM. עבור כל כיפה, 50 μL של פתרון זה נדרש. ECM מדולל הוא זול יותר וקל יותר pipet. - זרעו את הבארות עם 50 μL של תרחיף תאי ECM לכל באר עם קצוות מקוררים בצלחת 24 שחוממה מראש.
- דגירה במשך 30 דקות באינקובטור 37°C, 5% CO2 לפילמור של ECM.
- מוסיפים 500 μL של מדיום התרבות לכל באר. דוגרים בחממה של 37°C, 5% CO 2 ומשנים את מדיום התרבית כל2-3 ימים
הערה: ניתן להשתמש באורגנואידים ישירות עבור i) ניסויים, ii) תחזוקה של תרבית אורגנואידים תלת-ממדית, iii) הקפאה, או iv) זריעה של חד-שכבות התא האורגנואידי (איור 1). בדוק את צמיחת האורגנואידים במיקרוסקופ מדי יום כדי לבחור את העיתוי האופטימלי לפיצול האורגנואידים. האורגנואידים חייבים להיות לומן ברור וריק וקצוות מוגדרים היטב. אורגנואידים בוגרים עם פסולת שחורה בלומן לא צריכים לשמש לפיצול (איור 3).
4. תחזוקת תרבית אורגנואידים בתלת מימד
הערה: עבור עוברים, אורגנואידים צריכים להיראות ברורים עם לומן ריק. פסולת שחורה מופיעה בלומן כ -5 ימים לאחר הפיצול ומציינת נוכחות של תאים מתים. הגבלת מספר התאים המתים בזמן המעבר עדיפה לתחזוקה מיטבית של התרבית. לפיכך יש להתאים את לוח הזמנים כדי להימנע מהגעה לשלב זה של בגרות.
- הכנת חומר
- מניחים את aliquots של ECM (500 μL) ב 4 ° C עבור הפשרה לפחות 1 שעה.
- מחממים מראש צלחת 24 בארות ב 37 מעלות צלזיוס.
- מחממים מראש את מגיב הדיסוציאציה של האנזים בתוספת מעכב רוק Y27632 של 10 מיקרומטר באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
- מקם את מדיום התרבות ב- RT.
- הניחו דלי קרח קטן מתחת למכסה המנוע בתנאים אספטיים.
- מעבר של אורגנואידים 3D המעי
- נתק את האורגנואידים עם ECM על ידי גירוד עם פיפט P1000. הומוגניזציה בזהירות על ידי pipetting בתווך התרבית, ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של DMEMc קר על קרח.
הערה: צינור חרוטי אחד של 15 מ"ל נדרש לבריכה עם 12 בארות של אורגנואידים שגודלו בכיפות 50 μL בלוחות של 24 בארות. - צנטריפוגה את האורגנואידים שנאספו ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
הערה: האורגנואידים יוצרים גלולה לבנה בתחתית הצינור. אם האורגנואידים עדיין נמצאים במתלה ב-ECM לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט העליון (מבלי לגעת בשכבת ה-ECM), בצעו הומוגניות על ידי פיפטציה 10 פעמים עם פיפט P1000, וחזרו על שלב הצנטריפוגה. שכבת ECM לא אמורה להיות גלויה לאחר הליך זה. - בזהירות לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה מגיב מחומם מראש בתוספת 10 μM Y27632 מעכב רוק. פיפט למעלה ולמטה 10 פעמים כדי ליזום דיסוציאציה של האורגנואידים.
- יש לדגור במשך 5 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול אנזימטי.
- משבש מכנית את האורגנואידים על ידי פיפטינג 10 פעמים עם פיפט P1000. בדוק את תרחיף התא מתחת למיקרוסקופ.
הערה: המטרה היא להשיג תאים מבודדים או צבירי תאים קטנים. אם עדיין נצפים שברי אורגנואידים גדולים, חזור על הדגירה (שלב 4.2.4) ועל השיבוש המכני (שלב 4.2.5). - הוסף 4 מ"ל של DMEMc קר כקרח. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C
- השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא האורגנואיד ב-1 מ"ל של DMEMc.
- המשך כמתואר לעיל (שלבים 3.2.7 עד 3.2.13) כדי לספור את התאים ולזרוע את תאי האורגנואיד ב 50 μL של כיפות ECM המכילות 3000 תאים חיים בצלחות 24 בארות שחוממו מראש.
- נתק את האורגנואידים עם ECM על ידי גירוד עם פיפט P1000. הומוגניזציה בזהירות על ידי pipetting בתווך התרבית, ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של DMEMc קר על קרח.
5. הקפאה של אורגנואידים תלת ממדיים
- הכינו את הנפח הדרוש (1 מ"ל לבריכה של שתי כיפות) של תמיסת הקפאה המכילה DMEMc בתוספת 10% FBS, 10% DMSO ומעכב ROCK 10 μM Y27632 ואחסנו על קרח (ריכוז FBS הסופי הוא 18%).
- הוציאו את מדיום התרבית מהבארות להקפאה.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת ההקפאה לבאר הראשונה להיות קפוא, לנתק את ECM על ידי גירוד, הומוגניזציה עם קצה פיפט.
- מעבירים את תרחיף האורגנואיד מהבאר הראשונה לבאר השנייה להקפאה.
- מעבירים את הבריכה של שתי הבארות לצינור הקפאה ומניחים את הבקבוקון במיכל להקפאת תאים.
- אחסנו את מיכל הקפאת התאים בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות, ולאחר מכן העבירו את הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
6. תרבית של חד-שכבות תאים שמקורן באורגנואידים תלת-ממדיים
הערה: חד-שכבות של תאי אורגנואיד חזיר מגודלות בתרבית במדיום דו-ממדי המורכב ממדיום התרבית המשמש לאורגנואידים תלת-ממדיים בתוספת 20% FBS.
- הכנת חומרים
- הכינו את המדיום הדו-ממדי ושמרו אותו ב-RT.
- מחממים מראש את מגיב הדיסוציאציה של האנזים בתוספת מעכב רוק Y27632 של 10 מיקרומטר באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
- ציפוי תוספת התרבית
- מעקרים זוג פינצטות ומעבירים אותם לארון הבטיחות הביולוגית.
- מניחים את תרבית התאים (0.33 ס"מ2) לתוך צלחת 24 בארות עם פינצטה.
- הכינו את תמיסת הציפוי המכילה קולגן IV מדולל ב-50 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS קר. פיפט למעלה ולמטה כדי לערבב
- הוסף 150 μL של תמיסת קולגן IV מדולל לכל תוספת תרבית תאים, אשר מתאים 22.7 מיקרוגרם / ס"מ2.
הערה: כוונו בזהירות את הפיפט אנכית למרכז הממברנה החדירה ובדקו שתמיסת הקולגן מכסה את כל הממברנה. - מניחים את הצלחת באינקובטור של 37°C, 5% CO2 ומשאירים למשך הלילה (או למשך 3 שעות לפחות).
- זריעה של תאי אורגנואיד תלת-ממדיים לתוך תוספות תרבית תאים
- הכן תרחיף תאים מהאורגנואידים התלת-ממדיים, כמתואר בשלבים 4.2.1 עד 4.2.7.
- ספרו את התאים עם דילול של 1:2 בכחול טריפאן עם מונה תאים, וחשבו את הנפח הדרוש לזרע 2.5 x 10 5 תאים לכל תוספת תרבית, המקביל ל 7.6 x 105 תאים לס"מ2.
- צנטריפוגה את הנפח הדרוש של השעיית התא ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- במהלך הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את תמיסת הציפוי מתוספות התרבית, והניחו להתייבש ב- RT מתחת למכסה המנוע ללא המכסה למשך 5 דקות.
- לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא בנפח הדרוש של מדיום דו-ממדי בתוספת מעכב סלע Y27632 של 10 מיקרומטר. נפח של 200 μL של מדיום דו-ממדי המכיל את התאים נדרש עבור כל תוספת.
- זרעו 200 μL של תרחיף התא (2.5 x 10,5 תאים) על הממברנה החדירה המצופה (הצד האפיקאלי) (איור 4A).
הערה: פיפט לאט במרכז הממברנה ולשמור על קצה אנכי. - הוסף 500 μL של המדיום הדו-ממדי בתוספת מעכב ROCK Y27632 של 10 μM לתא התחתון (הצד הבסיסי). דגירה באינקובטור 37°C, 5% CO2 .
- יום לאחר הזריעה, החליפו את המדיה האפיקלית והבזאלית בתווך דו-ממדי טרי ללא מעכב הסלע Y27632.
- שנה את המדיום הדו-ממדי בכל יום. החד-שכבה הופכת למשתלבת יום אחד לאחר הזריעה, ולאחר מכן ניתן להשתמש בה לניסויים.
הערה: ערך התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) מעל הריק (הכנסה ללא תאים) מאשר שהושגה התמזגות (איור 4B).
7. Immunostaining של monolayers תא אורגנואיד
- הכנת פתרונות
הערה: התאמת נפח התמיסות בהתאם למספר הבארות שיש להכתים; 200 μL של הפתרון נדרש בכל שלב עבור באר אחת. הפניות לכל המוצרים המסחריים מובאות בטבלת החומרים.- הכינו תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) מתחת למכסה מנוע כימי על ידי הוספת 5 מ"ל של 32% PFA ל-35 מ"ל PBS. להכין 10 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 °C.
אזהרה: יש לתפעל תמיד את ה-PFA מתחת למכסה המנוע הכימי, תוך לבישת כפפות ניטריל. - הכינו תמיסה של 0.2% Triton X100-PBS, על ידי הוספת 2 μL של Triton X100 ל-1 מ"ל PBS מיד לפני השימוש. הישאר ב- RT.
- הכינו תמיסת אלבומין 10% בסרום בקר (BSA)-PBS על ידי הוספת 100 מ"ג BSA ל-1 מ"ל PBS. הישאר ב- RT.
- הכינו תמיסת BSA-PBS 1% על ידי הוספת 10 מ"ג BSA ל-1 מ"ל PBS. הישאר ב- RT.
- הכינו תמיסה של נוגדן ראשוני סמוי מדולל בשעה 1:200 על ידי הוספת 5 μL של נוגדן ראשוני ל 995 μL של 1% PBS BSA. שמור את הפתרון על קרח.
- הכינו תמיסה של הנוגדן המשני המדולל בקנ"מ 1:1,000 על ידי הוספת 1 μL של נוגדן משני ל-999 μL של 1% BSA-PBS. שמור את התמיסה על קרח, מוגן מפני אור.
- הכינו תמיסה של פאלואדין TRITC ב-10 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של TRITC ב-1 מ"ג/מ"ל ל-990 מיקרוליטר PBS. שמור על קרח, מוגן מפני אור.
- הכינו תמיסת 4% פרפורמלדהיד (PFA) מתחת למכסה מנוע כימי על ידי הוספת 5 מ"ל של 32% PFA ל-35 מ"ל PBS. להכין 10 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 °C.
- אימונוסטיין
הערה: אלא אם צוין אחרת, כל הדגירות מבוצעות ב-RT, תחת תסיסה איטית על משטח נדנדה (30 סל"ד). ההכתמה החיסונית מבוצעת ישירות בעלון תרבית התא.- הסר את המדיום הבסיסי והאפי. מניחים את הצלחת מתחת למכסה המנוע הכימי.
- שטפו את החד-שכבות פעמיים עם 200 μL של PBS ב-RT ודגרו במשך 5 דקות.
- תקן את חד-שכבות התא עם 200 μL של 4% PFA ב- RT ודגור במשך 20 דקות ב- RT.
- שטפו את החד-שכבות פעמיים עם 200 μL של PBS ב-RT ודגרו במשך 5 דקות.
הערה: לאחר שלבי הקיבוע והשטיפה, ניתן לשמור את השכבה החד-שכבתית ב-4°C ב-PBS למשך שבוע אחד. - הסר את PBS, חדיר עם 200 μL של 0.2% Triton X100-PBS, ודגר במשך 20 דקות.
- שטפו את החד-שכבות פעמיים עם 200 μL של PBS ב-RT ודגרו במשך 5 דקות.
- הוסף 200 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית ב- 1% BSA-PBS ודגור למשך הלילה ב- 4 מעלות צלזיוס, תחת תסיסה איטית על פלטפורמת נדנדה. כלול באר בקרה שלילית על ידי הוספת 1% BSA-PBS בלבד ללא הנוגדן הראשוני.
- שטפו את החד-שכבות שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS ב-RT ודגרו במשך 5 דקות.
- הוסף 200 μL של נוגדן משני ב 1% BSA-PBS ודגור ב RT במשך 2 שעות, מוגן מפני האור.
- שטפו את החד-שכבות שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר PBS ב-RT ודגרו במשך 5 דקות.
- מוסיפים 200 μL של phalloidin TRITC ב-10 מיקרוגרם/מ"ל ודגורים למשך 10 דקות.
- שטפו את החד-שכבות פעמיים עם 200 μL של PBS ב-RT ודגרו במשך 5 דקות.
- הסר את PBS לחתוך את הממברנה עם אזמל.
- לשחזר את הממברנה עם זוג פינצטה ולהניח אותו על שקופית מיקרוסקופ, עם הצד apical פונה כלפי מעלה.
- הוסף 15 μL של אמצעי ההרכבה בתוספת DAPI בקנ"מ 1:1,000 ישירות על הממברנה. יש להניח מכסה ולאטום.
- יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C, מוגן מפני אור, עד להדמיה.
Representative Results
בהתאם לפרוטוקול שתואר לעיל, קריפטים אפיתליאליים מתקבלים ממעי החזיר ונשמרים בהקפאה לאחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי (איור 1 ואיור 2A). לאחר ההפשרה, תאי הגזע של הקריפטה נזרעים ב-ECM (איור 2B). מבנה הקריפטה הולך לאיבוד בדרך כלל לאחר שלב זה, עקב התפוררות מבנה הקריפטה ב- ECM. ניתן לצפות באורגנואידים תוך 3-4 ימים, ואז לגדול במהירות ולפתח מבנים ניצנים (איור 2B). השגנו בהצלחה אורגנואידים לאחר הפשרת קריפטות קפואות ב->80% מהניסיונות. כ-10 ימים לאחר ההפשרה (בהתאם לקצב הגדילה של אורגנואידים), מתבצע מעבר של אורגנואידים כדי להרחיב את התרבית (איור 3). האורגנואידים גדלים מהר יותר לאחר הפיצול, והם מציגים מורפולוגיות מגוונות, עם כמה ציסטיים ורוב אורגנואידים ניצנים. לתחזוקה אופטימלית של התרבית, האורגנואידים המשמשים למעבר חייבים להציג לומן ברור וריק וקצוות מוגדרים היטב (דוגמאות מסומנות על-ידי חיצים ירוקים) ללא פסולת שחורה בלומן (מסומנת על-ידי חיצים אדומים), כפי שנצפה באורגנואידים בוגרים (איור 3). מצאנו שפסולת תאים שחורים מתחילה להצטבר סביב יום 6 לאחר המעבר. לכן, מומלץ לפצל או להקפיא את האורגנואידים ביום 4-5 לאחר המעבר.
שלב הבשלות של האורגנואידים הוא גם נקודה חשובה בהשגת חד-שכבות תאים. אורגנואידים עם בגרות מתקדמת (מסומנת על ידי נוכחות של פסולת תאים שחורים בלומן) אינם אופטימליים לזרעים monolayers. בדרך כלל אנו מנתקים אורגנואידים תלת-ממדיים 4 ימים לאחר המעבר כדי לאסוף תאים לתרבית דו-ממדית. כבאר אחת עד שלוש בארות של אורגנואידים תלת-ממדיים בתרבית של 3,000 תאים לכל כיפה של 50 מיקרוליטר של ECM דרושים לזריעת תוספת תרבית אחת עם 2.5 x 105 תאים. תאים מתחברים ויוצרים שכבה חד-שכבתית מלאה תוך יום אחד (איור 4A), אשר מאושר על-ידי TEER גבוה של כ-700 Ω·cm2 (איור 4B). עם זאת, קשה לדמיין את קצוות התא במיקרוסקופ שדה בהיר בנקודת זמן מוקדמת זו, כנראה בשל רמת התמיינות נמוכה. ה-TEER נשאר גבוה במשך 3 ימים (איור 4B).
צביעת אקטין מצביעה על כך שהצד האפי של תאי האפיתל מכוון לכיוון הלומן באורגנואידים תלת-ממדיים (איור 5A). תאי אורגנואיד שנזרעו בתרבית יוצרים שכבה אחת של תאי אפיתל, כאשר הצד האפי מכוון לכיוון התא העליון (איור 4B,C). צביעת אוקלודין חושפת נוכחות של צמתים הדוקים בצד האפי של תאי האפיתל באורגנואידים תלת-ממדיים ובחד-שכבות של תאים (איור 5A-C).
איור 1: ייצוג סכמטי של השיטות ששימשו לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים וחד-שכבות של תאים שמקורם באורגנואידים. קריפטים אפיתל מבודדים ממעי חזרזיר. קריפטים אלה יכולים לשמש באופן מיידי לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים או ii) להיות מוקפאים ומאוחסנים בביובנק בחנקן נוזלי. ניתן להפשיר קריפטות בהקפאה ולהשתמש בהן לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים. ניתן לתחזק את תרבית האורגנואידים התלת-ממדית באמצעות פיצול עוקב, או להקפיא ולאחסן בביו-בנק. ניתן לקבל חד-שכבות של תאים מתרבית אורגנואידים תלת-ממדית כדי לאפשר גישה לצד האפי של התאים ולחקור את תפקוד מחסום האפיתל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרבית של אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה. (A) תמונה מיקרוסקופית מייצגת של קריפטים ג'ג'ונליים שזה עתה בודדו. (B) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של אורגנואידים תלת-ממדיים שהתקבלו לאחר הפשרת הקריפטות הג'ג'ונליות. האורגנואידים תורבתו בכיפה של 25 μL של ECM בצלחת של 48 בארות. האיור מציג תמונות של אורגנואידים תלת-ממדיים ב-4, 7, 8, 9 ו-10 ימים לאחר הזריעה. סרגל קנה המידה מייצג 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מורפולוגיה של אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר שמקורם בקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה לאחר המעבר הראשון. תמונות מיקרוסקופיות מייצגות המראות את התפתחות האורגנואידים שמקורם בקריפטות ג'ג'ונום שמורים בהקפאה לאחר המעבר הראשון מהיום הרביעי ליום השביעי. חיצים ירוקים מציינים אורגנואידים ברורים המתאימים למעבר או זריעה של חד-שכבות. חיצים אדומים מציינים אורגנואידים בוגרים שאינם מתאימים לפיצול או זריעה של חד-שכבות; לפיכך, יש להשתמש בוולס לפני הופעת מורפולוגיה זו. סרגל קנה המידה מייצג 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מאפיינים של חד-שכבות תאיות שמקורן באורגנואידים תלת-ממדיים של מעי חזיר . (A) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של המורפולוגיה החד-שכבתית במשך 3 ימים. תאי אורגנואיד ג'ג'ונום נזרעו בגודל 2.5 x 105 תאים לתוך 0.33 ס"מ2 תוספות תרבית תאים מצופות קולגן IV ב 50 ng / mL. סרגל קנה המידה מייצג 500 מיקרומטר. (B) התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) של חד-שכבות תאי אורגנואיד במשך 3 ימים. נקודות המחוברות על ידי קו מתאימות לאותה באר בזמנים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הדמיה של אורגנואידים של חזיר ג'ג'ונום שגודלו בתרבית תלת-ממדית או דו-ממדית. הדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי של (A) אורגנואידים תלת-ממדיים 5 ימים לאחר הפיצול ו-(B,C) חד-שכבות של תאים אורגנואידים 3 ימים לאחר הזריעה (B: XZ section; ג: סעיף XY). DNA (כחול) הוכתם ב-DAPI. אקטין (אדום) היה מוכתם בפלואידין. Occludin (ירוק) היה מוכתם עם נוגדן רב שבטי. חיצים לבנים מציינים אוקלודין הממוקם בצומת ההדוק. סרגל קנה המידה מייצג 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה המשמשת לשימור קריפטות אפיתל ממעי החזרזיר לאחסון לטווח ארוך ולתרבית עוקבת של אורגנואידים תלת-ממדיים. פרוטוקול זה משתמש בתמיסת הקפאה המכילה DMSO, FBS, מעכב ROCK Y27632, DMEM ואנטיביוטיקה. מחקר אחר בחזירים השיג אורגנואידים מקריפטות שנשמרו בהקפאה בתמיסת הקפאה דומה, אך ללא מעכב ROCK15. מעכב Y27632 ROCK נכלל כדי למנוע אפופטוזיס ולשמור על מאגר תאי הגזע מכיוון שלאחר ההפשרה, תאי קריפטת אפיתל מנותקים, מה שעלול להוביל למוות תאי ('אנואיקיס')27,28. מעניין, אנטרואידים סוסים התקבלו מקריפטות אפיתל שהוקפאו במדיום תרבית המכיל רק DMEM ו- DMSO16; שיטה פשוטה זו עדיין לא נבדקה עבור קריפטים אפיתל חזיר. שיטות אחרות פורסמו לגידול אורגנואידים אנושיים וחזירים מרקמות קפואות או ביופסיות במקום קריפטות אפיתל 4,17. היתרון של שיטה זו הוא היכולת ישירות cryoלשמר את רקמות המעי מבלי לבצע את הליך בידוד קריפטה, אשר דורש זמן וציוד מעבדה. זה עשוי להיות נוח כאשר הרקמות צריכות להיאסף הרחק מהמעבדה. עם זאת, כאשר מבודדים את הקריפטים מיד לאחר השחיטה, חלקים גדולים של המעי ניתן לעבד כדי להשיג מספר גבוה מאוד של crypts, וזה לא המקרה כאשר מתחילים משברי רקמות קפואים קטנים. לאחר הפשרת קריפטים אפיתליאליים, אורגנואידים נצפו מ 3-4 ימים לאחר הזריעה ופיצול לאחר 10 ימים. זהו קצב גדילה איטי יותר מאשר כאשר מתחילים את התרבית מקריפטות אפיתל טריות, שעבורן האורגנואידים התקבלו מהיום הראשון שלאחר הזריעה, ובדרך כלל ניתן לפצל אותם בסביבות יום 511. חליל ועמיתיו דיווחו גם על עיכוב בגדילה של אנטרואידים של חזירים כאשר הם מתחילים מקריפטיםקפואים 15, דבר המצביע על כך שתאי גזע עשויים לדרוש זמן כדי לשחזר את יכולת ההתרבות שלהם. השגנו גם מספר נמוך יותר של אורגנואידים כאשר התחלנו מקריפטים קפואים בהשוואה לקריפטים טריים, אשר עשויים לנבוע ממוות של תאי גזע במהלך תהליך ההקפאה. בחלק מהניסיונות להפשיר קריפטים (<20%), לא השגנו אורגנואידים מקריפטות קפואות, כנראה בגלל הליך שימור קריוגני לא אופטימלי (למשל, הקפאה מאוחרת לאחר בידוד קריפטה של יותר משעה אחת). לכן, אנו ממליצים לשמור את הקריפטות על קרח עד הספירה, ולהקפיא אותם מהר ככל האפשר.
עבור אורגנואידים תלת-ממדיים, בחרנו להשתמש במדיום תרבית אורגנואידים מסחרי שפותח עבור בני אדם. ואכן, דיווחים קודמים הראו כי אורגנואידים במעיים חזיר גדלים ביעילות עם מדיום זה 8,11,14,19,25,26,29,30. זה מעניין עבור מדיום תרבות זה להיות מוכן לשימוש יש ריכוז סטנדרטי של גורמי צמיחה בתוך אצווה. עם זאת, מדיום תרבות זה הוא יקר, הרכבו אינו ידוע, ולכן לא ניתן לווסת את הרכבו. לעומת זאת, מחקרים אחרים תרבו אורגנואידים של מעי חזיר במדיה מותאמת אישית המכילה מעכבים פרמקולוגיים, גורם גדילה רקומביננטי ו/או מדיה מותנית 5,6,7,21. למרות שהיא גמישה מאוד וזולה יותר, שיטה זו גוזלת זמן רב לייצור מדיה מותנית ועלולה להיות חסרת יכולת שחזור בשל שונות פוטנציאלית בריכוז גורמי הצמיחה במדיה מותנית. לפיכך, יש לאמת את האיכות של כל אצווה של מדיה מותנית על ידי מדידת גידול אורגנואידים או ביטוי גנים סמן31.
מחקר הראה כי אורגנואידים ג'ג'ונליים של חזירים שגודלו באותו מדיום תרבית אורגנואידים מסחרי המשמש כאן גדלו מהר יותר ונראו פחות מובחנים, בהשוואה לאנטרואידים שתורבתו עם מדיה המכילה גורם גדילה רקומביננטי ו / או מדיה מותנית23. מצב שגשוג גבוה מאפשר את התרבות של אורגנואידים תלת-ממדיים, אך עשוי לדרוש גרימת התמיינות כדי לייצג יותר את המאפיינים הפיזיולוגיים של המעי. בפרוטוקול זה, עבור המעבר של אורגנואידים 3D, התאים מנותקים לחלוטין לספירה, המאפשר לשלוט במספר התאים זרע ECM. זה מגדיל את יכולת השחזור של הפנוטיפ של אורגנואידים, אשר מושפע מאוד על ידי צפיפותם. יתר על כן, ספירת התאים מונעת קבלת תרבית נמוכה מדי או צפופה מדי, הדורשת התאמת לוח הזמנים של התרבית. רוב המחקרים האחרים הכינו מקטעי אורגנואידים שלא נותקו לחלוטין לתאים בודדים, והשתמשו ביחס דילול למעבר. שיטה זו פשוטה יותר, אך עשויה לגרום לשונות בהתאם לצפיפות האורגנואידים של התרבית.
עבור התרבית בחד-שכבות, תאי אורגנואיד נזרעים בתוספות תרבית מצופות מראש בשכבה דקה של ECM, המאפשרת התקשרות של תאים אך מונעת צמיחה של אורגנואידים בתלת-ממד. פרוטוקול זה השתמש בקולגן מסוג IV כחלבון ECM, כפי שתואר קודם לכן בחזירים23. מחקרים אחרים עם חד-שכבות אורגנואידים חזיריות השתמשו באותו ECM שמקורו בגידול המשמש כאן לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים 6,8,9,21,25,30. היתרון בשימוש בקולגן הוא היכולת לתקנן את ריכוז החלבון בהרכב מוגדר במלואו, מה שלא קורה ב-ECM שמקורו בגידול. צעד קריטי להצלחת התרבות של monolayers התא הוא לשים לב המראה החזותי של מבשר 3D אורגנואידים, אשר צריך להיות קצוות מוגדרים היטב לומן ריק ללא פסולת שחורה. ואכן, אורגנואידים בעלי רמת התבגרות גבוהה וקצב התרבות נמוך אינם מקור מתאים לתאים לתרבית דו-ממדית. לפיכך, העיתוי של דיסוציאציה של אורגנואידים תלת-ממדיים לתאים בודדים הוא קריטי להצלחת שלב זה.
התרבות של monolayers 2D מתאים בודדים מאפשר סטנדרטיזציה של מספר התאים זרע, וזה קשה יותר כאשר מתחילים מקטעים אורגנואידים, כפי שבוצע בכמה שיטות אחרות. זרענו 7.6 x 10 5 תאים לס"מ 2, שזה גבוה בהשוואה לרוב המחקרים האחרים 21,22,23 בחזירים שהשתמשו בצפיפות תאים נמוכה יותר, שנעה בין 0.25 x 10 5 תאים לס"מ 2 ל 1.78 x 10 5 תאים לס"מ 2. הדרישה למספר גבוה של תאים אורגנואידים מהווה מגבלה של פרוטוקול זה, אך היא אפשרה לנו להשיג במהירות מונושכבה קונפלואנטית, המכסה במלואה את עלון התרבית לאחר יום אחד. לעומת זאת, Vermeire et al.23 השיגו מפגש לאחר 4-7 ימים עם צפיפות נמוכה יותר של תאים שנזרעו (מ 0.25 x 10 5 תאים / ס"מ 2 ל 0.4 x 105 תאים / ס"מ2). מחקרים מסוימים השתמשו גם בחד-שכבות של תאי אורגנואיד חזירים שלא כיסו באופן מלא את משטח התרבית לזיהומים בנגיפים 8,30. במצבים אלה, הצד האפי של תאי אפיתל נגיש לטיפולים, אך יש צורך בחד-שכבות מתמזגות לחלוטין אם המטרה היא לחקור ספיגת חומרים מזינים או חדירות אפיתל.
עבור חד-שכבות של תאים אורגנואידים, נעשה שימוש במדיום תרבית אורגנואידים מסחרי בתוספת 20% FBS, בהתבסס על מחקר שנערך לאחרונה על מונושכבות32 שמקורן באנטרואידים בקר. בבדיקות שלנו, תוספת עם 20% FBS היה הכרחי כדי להשיג monolayers confluent מלא, כנראה בשל דרישה גורם גדילה גבוהה. להיפך, מחקרים אחרים המשתמשים באותו מדיום מסחרי ביססו מונושכבות ללא FBS 8,25,30 נוספים, אך מבלי להגיע למפגש מלא. מחקרים אחרים השתמשו גם בתוסף עם 20% FBS במדיום מותאם אישית לתרבית של חד-שכבות תאי אורגנואיד חזיר21,22. בניסויים שלנו, TEER גבוה יום אחד לאחר הזריעה (סביב 700 Ω·cm 2), ונשאר גבוה עד יום 3 (סביב 1,500 Ω·cm2; זה עקבי עם היווצרות של צמתים הדוקים, כפי שמצוין על ידי ביטוי של occludin. Van der Hee et al. השיגו ערכי TEER דומים מעל 72 שעות עבור חד-שכבות של תאי אורגנואיד ג'ג'ונום21. הם גם הראו כי ניתן לשמור על חד-שכבות עד היום ה-12-15 עם שינויי מדיה יומיים. לעומת זאת, מחקרים אחרים דיווחו על ערכי TEER נמוכים בהרבה (בסביבות 200 Ω·cm2) עבור חד-שכבות של תאי אורגנואיד חזירים 6,22. הבדלים אלה בין מחקרים עשויים להיות קשורים למקטע המעיים שנחקר או למדיה המשמשת המשפיעה על התמיינות אפיתל.
לסיכום, הפרוטוקול הנ"ל לגידול אורגנואידים תלת ממדיים במעי חזיר מקריפטות אפיתל קפואות מקל על ארגון עבודת התרבית. זה מפחית את הצורך רקמות טריות להתקבל מבעלי חיים חיים. אנו גם מסבירים כיצד להקים מונושכבות תאים מתמזגות לחלוטין שמקורן באורגנואידים חזירים תוך פחות משלושה ימים. לפיכך, הפרוטוקולים שלנו יכולים להיות משאבים שימושיים עבור מדענים החוקרים את אפיתל מעי החזיר למחקר וטרינרי או ביו-רפואי.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Institut Carnot France Futur Elevage (פרויקט "OrganoPig") ועל ידי INRAE HOLOFLUX (פרויקט "Holopig"). המחברים אסירי תודה למתקני הליבה של Genotoul (TRI). אנו מודים לכריסטל קנודסן (GenPhySE, INRAE, Toulouse) על הגהה קפדנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | Store at room temperature. |
| 15 mL conical tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 24-well cell culture plate | Corning | 003526 | |
| 48-well cell culture plate | Corning | 003548 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Euromedex | A6003 | Store at 4 °C. |
| Centrifuge Universal 320 R | Hettich | 1406 | |
| Collagene type IV from human placenta | Sigma | C5533 | Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C. |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | 432003 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | 16842556 | |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm | VWR | 630-1845 | |
| Cryotube ClearLine 1 mL | Clear line | 390706 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C |
| Dithiothreitol (DTT) | Merck | 10197777001 | Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31966047 | Store at 4 °C. |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25-950-CQC | Store at room temperature. |
| Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide | VWR | 631-9483 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | Used for crypt isolation. |
| Fixed Tilt 3D Platform Rotator | VWR | 97025-564 | Used for incubations in the immunostaining protocol. |
| Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | Store at 4 °C. |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature. |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000. |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technology | 6010 | Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week. |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Corning | 353095 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS2 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C. |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectashield | H1250 | Store at 4 °C. |
| Occludin polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 71-1500 | Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200. |
| Paraformaldehyde 32% | Electron microscopy science | 15714 | Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
| Phalloidin TRITC | Sigma | P1951 | Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C. |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C. |
| ROCK Inhibitor (Y27632) | ATCC | ACS-3030 | Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C. |
| Rotating shaker mix XL | Clear line | 062646CL | Used for crypt isolation. |
| Stripette Serological Pipets 10 mL | Corning | 4488 | |
| Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| Triton X100 | Sigma | 8787 | Store at room temperature. |
| Trypan Blue stain 0.4% | Thermo Fisher Scientific | T10282 | Store at room temperature. |
| Vacuum system Vacusip | Integra | 159000 | Used to remove the medium of organoid wells. |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Beaumont, M., et al.
- Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).
- Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).
- vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).
- Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).
- Mussard, E., et al. The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).
- Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).
- Wang, Z., et al. Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells. Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
- Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).
- Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).
- Tsai, Y. -H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
- Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
- Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).
- Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut. Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).
- Luo, H., et al. Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro. Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).
- Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2. Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).
- Engevik, A. C., et al. Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters. Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).
- Ferrandis Vila, M., et al. Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum. PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).
- Li, L., et al. IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia. Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).
