Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att odla gristarm 3D-organoider från kryokonserverade epitelkrypter. Vi beskriver också en metod för att etablera cellmonolager härledda från 3D-organoider, vilket möjliggör åtkomst till den apikala sidan av epitelceller.
Abstract
Intestinala organoider används alltmer för att studera tarmepitelet för modellering av matsmältningssjukdomar, eller för att undersöka interaktioner med läkemedel, näringsämnen, metaboliter, patogener och mikrobiotan. Metoder för att odla tarmorganoider finns nu tillgängliga för flera arter, inklusive grisar, vilket är en art av stort intresse både som husdjur och som en translationell modell för människor, till exempel för att studera zoonotiska sjukdomar. Här ger vi en fördjupad beskrivning av ett förfarande som används för att odla gristarm 3D-organoider från frysta epitelkrypter. Protokollet beskriver hur man kryokonserverar epitelkrypter från gristarmen och de efterföljande procedurerna för att odla 3D-tarmorganoider. De främsta fördelarna med denna metod är (i) den tidsmässiga dissociationen av isoleringen av krypter från kulturen av 3D-organoider, (ii) beredningen av stora lager av kryokonserverade krypter härrörande från flera tarmsegment och från flera djur samtidigt, och därmed (iii) minskningen av behovet av att ta prov på färsk vävnad från levande djur. Vi beskriver också ett protokoll för att etablera cellmonolager härledda från 3D-organoider för att möjliggöra åtkomst till den apikala sidan av epitelceller, vilket är platsen för interaktioner med näringsämnen, mikrober eller läkemedel. Sammantaget är de protokoll som beskrivs här en användbar resurs för att studera gristarmepitelet i veterinärmedicinsk och biomedicinsk forskning.
Introduction
Tarmepitelet bildas av ett monolager av celler som täcker matsmältningsslimhinnan vid gränssnittet med den luminala miljön. Denna position är förknippad med olika funktioner, såsom näringsabsorption och barriärfunktion, som stöds av närvaron av stamceller och flera differentierade epitelcelltyper (absorptiva, enteroendokrina, Paeth- och bägarceller)1. Odödliga cellinjer som traditionellt används för att studera epitelceller har stora begränsningar, eftersom de inte återspeglar tarmepitelets cellulära komplexitet och uppvisar genomiska abnormiteter2. Utvecklingen av tredimensionella (3D) organoider av Sato et al.3 gav en ny modell för att studera tarmepitelet med förbättrad fysiologisk relevans. Faktum är att intestinala organoider härrör från icke-transformerade stamceller, består av flera celltyper och rekapitulerar funktionaliteten hos tarmepitelet. Intestinala organoider används alltmer för att förstå utvecklingen och funktionerna i tarmepitelet och dess interaktioner med patogener, näringsämnen, toxiner, läkemedel, mikrobioten och dess metaboliter2.
Ursprungligen utvecklades för människor och möss, de metoder som används för att odla tarmorganoider har nyligen anpassats till andra arter, inklusive grisar4. Gonzales et al.5 var de första som odlade grisorganoider från jejunum; Sedan dess har svinorganoider beskrivits för andra tarmsegment (tolvfingertarmen, ileum och kolon)6,7,8, och har visat sig behålla en platsspecifik fenotyp 9,10,11. Gristarm 3D-organoider används nu ofta för att studera effekten av näringsämnen 12,13 eller enteriska infektioner 6,8,14.
De flesta av studierna har beskrivit kulturen av intestinala organoider som börjar från nyligen isolerade epitelkryptor. Detta är dock inte alltid möjligt av logistiska skäl, särskilt när man arbetar med stora djur som grisar. Faktum är att djuranläggningar för grisar kan placeras långt ifrån laboratoriet där organoider odlas, vilket komplicerar arbetsorganisationen. Dessutom är organoidkulturen tidskrävande; Således är det inte praktiskt att samtidigt odla flera organoidlinjer, till exempel från olika tarmsegment eller flera djur. För att kringgå dessa problem har några studier på människor, hästar och grisar beskrivit metoder för att odla organoider från frysta tarmvävnader (eller biopsier) eller från isolerade epitelkrypter 4,15,16,17. Dessa metoder möjliggör kryokonservering av tarmepitelstamceller från flera tarmsegment av ett enda djur, som sedan kan användas för att odla organoider vid behov. Dessutom möjliggör detta en kraftig minskning av antalet levande djur som används som donatorer av stamceller, eftersom stora lager av kryokonserverade krypter kan skapas (principerna för 3R). En annan fördel med denna metod är tillväxten av intestinala organoider endast från djur av intresse efter att ha erhållit fenotypiska eller genotypiska resultat, vilket är mycket kostnadseffektivt.
In vivo polariseras intestinala epitelceller, med den apikala sidan riktad mot lumen. In vitro, i 3D-organoider, är den apikala sidan av epitelceller också vänd mot lumen (dvs inuti organoiderna)4. Denna organisation förhindrar åtkomst till den apikala sidan, vilket är ett problem när man studerar effekterna av luminala komponenter (t.ex. näringsämnen, mikrober, metaboliter) på epitelceller. För att kringgå denna nackdel har flera metoder utvecklats, såsom odling av organoidceller som 2D-monolager, mikroinjektion och polaritetsomvandling ("apikala organoider")18,19. Kulturen av organoidcellmonolager framträder som det mest effektiva och lätthanterliga systemet. Principen är att dissociera 3D-organoider i enskilda celler och frö dem på ett cellodlingskärl som tidigare belagts med ett tunt lager av extracellulär matris (ECM)20. Under dessa odlingsbetingelser är den apikala sidan av epitelcellerna vänd uppåt och är därmed tillgänglig för experimentella behandlingar20. Kulturen av organoidcellmonolager anpassades nyligen för gristarmen21,22; cellmonolager härrörande från gris 3D-organoider har använts för flera applikationer, inklusive studier av enteriska infektioner 6,23,24,25, transport av näringsämnen9 och modellering av matsmältningssjukdomar 26.
Här presenterar denna studie först ett detaljerat protokoll för odling och underhåll av gristarm 3D-organoider härrörande från kryokonserverade epitelkrypter (figur 1). Därefter beskrivs ett protokoll för att etablera cellmonolager från gristarmens 3D-organoider. Metoderna som beskrivs här ger experimentella verktyg som kan användas för att studera gristarmepitelet för näringstransport, barriärfunktion och värd-mikroorganisminteraktioner.
Protocol
Detta protokoll godkändes av den lokala etikkommittén (N°TOXCOM/0136/PP) i enlighet med det europeiska direktivet om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål (2010/63/EU). Detta protokoll beskrivs för jejunum som ett exempel, men det kan användas för varje segment av tunntarmen och tjocktarmen (tolvfingertarmen, jejunum, ileum, kolon).
1. Isolering av epitelkrypter från gristarmen
OBS: Förbered ett lager av komplett Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEMc) med DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (P / S). Bered 50 ml alikvoter och förvara dem vid 4 °C i 1 månad.
- Förberedelse av lösningar (som ska göras på dagen för kryptisoleringen)
- Bered dissociationslösningen innehållande fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 3 mM ditiotreitol (DTT), 9 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 10 μM Y27632 ROCK-hämmare och 1% penicillin-streptomycin (P / S) och förvara på is.
- Bered fryslösningen innehållande DMEMc, 10% FBS, 10% dimetylsulfoxid (DMSO) och 10 μM Y27632 ROCK-hämmare och lagra på is (den slutliga FBS-koncentrationen är 18%).
- Bered transportlösningen som innehåller kall PBS kompletterad med 1% P/S och förvara den på is.
- Isolering av epitelkrypter
- Slakta en gris genom elektronarkos följt av exsanguination.
- Omedelbart efter slakt, öppna smågrisens buk med en skalpell och ta bort hela tarmen.
- Samla ca 2 cm av ett tarmsegment och förvara det i kalltransportlösning. Håll segmentet på is tills kryptisolering (upp till 2 timmar).
- Lägg vävnaden i en petriskål. Öppna tarmsegmentet i längdriktningen och tvätta försiktigt vävnaden i kallt PBS kompletterat med 1% P/S för att avlägsna tarminnehållet.
- Överför vävnaden till en ny petriskål fylld med 10 ml kall PBS kompletterad med 1% P / S.
- Håll vävnaden med pincett och ta bort villi och återstående slem genom att skrapa med ett mikroskopglas.
OBS: Avlägsnandet av villi (den tungformade strukturen) kan kontrolleras genom mikroskopisk observation av supernatanten. - Överför vävnaden till ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml iskall dissociationslösning och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur (RT) i en roterande skakapparat (15 rpm).
- Överför vävnaden till en ny petriskål och tillsätt 10 ml kall PBS kompletterad med 1% P / S.
- Isolera kryptorna mekaniskt genom att skrapa slemhinnan ordentligt med ett mikroskopglas.
OBS: Under ett mikroskop, verifiera förekomsten av epitelkrypter i PBS (figur 2A). - Aspirera kryptlösningen med en serologisk pipett och filtrera genom en 100 μm cellsil i ett 50 ml koniskt rör.
- Pipet 10 μL av lösningen och kontrollera förekomsten av krypter under ett mikroskop. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
- Under ett sterilt biosäkerhetsskåp, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten av krypter i 10 ml kall DMEMc kompletterad med 10 μM Y27632 ROCK-hämmare.
- Pipettera 10 μL av kryptlösningen till en 48-brunnsplatta. Räkna manuellt antalet krypter under ett mikroskop med en 10x förstoring och beräkna koncentrationen av krypter per ml lösning.
OBS: De isolerade kryptorna kan användas direkt för att odla tarmorganoider. Det är emellertid ofta bekvämare att kryokonservera ett stort parti krypter från varje gris och använda dem senare för organoidodling.
- Frysning av epitelkrypter
- Överför en volym motsvarande 900 krypter i ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och suspendera pelleten av krypter i 1 ml av fryslösningen. Överför till ett kryorör och placera injektionsflaskan i en cellfrysningsbehållare.
- Förvara cellfrysbehållaren vid -80 °C i 24 timmar och överför sedan injektionsflaskorna till flytande kväve för långtidsförvaring.
2. Etablering av 3D-organoider från frysta epitelkrypter
OBS: Smågristarmens 3D-organoider odlas i ett kommersiellt odlingsmedium formulerat för tillväxt av humana organoider, kompletterat med 1% P / S och 100 μg / ml av ett antimikrobiellt medel för primära celler och lagras vid 4 ° C i upp till 1 vecka. En tumör-härledd extracellulär matris (ECM) används för odling av 3D-organoider. Alla referenser till kommersiella produkter presenteras i materialförteckningen.
- Beredning av material
- Placera pipettspetsarna vid -20 °C (minst över natten).
- Placera de frysta alikvoterna av ECM (500 μL) vid 4 °C minst 1 timme i förväg.
- Förvärm en platta med 48 brunnar i en 37 °C, 5% CO2-inkubator .
- Placera odlingsmediet vid RT.
- Förvärm ett vattenbad vid 37 °C.
- Placera en liten ishink under huven under aseptiska förhållanden.
- Upptining av frusna epitelkrypter
- Tina snabbt en injektionsflaska med 900 frysta kryptor i vattenbad vid 37 °C (mindre än 5 min).
- Överför kryptlösningen till ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten
- Tillsätt 150 μL ECM med kylda spetsar för att erhålla en slutlig koncentration av 150 krypter per 25 μL ECM. Pipettera upp och ner 10 gånger för att erhålla en homogen suspension av krypter i ECM.
OBS: Håll alltid ECM på is för att undvika polymerisation. Använd alltid förkylda pipettspetsar vid -20 °C för att manipulera ECM. Pipettera långsamt för att undvika att göra luftbubblor i ECM. En outspädd ECM används i detta steg för att förhindra att de små dropparna kollapsar. - Frö sex brunnar med en droppe på 25 μL per brunn med kylda spetsar i en förvärmd platta med 48 brunnar.
OBS: Håll spetsen vertikal, i mitten av brunnen, och pipet långsamt utan att införa luft för att få en kupol. Här används 48-brunnsplattor, eftersom organoidantalet vanligtvis är lågt när man startar från frysta krypter. - Inkubera i 30 minuter i en 37 °C, 5% CO2-inkubator för polymerisation av ECM.
- Tillsätt 250 μl per brunn odlingsmedium vid RT. Inkubera i en 37 °C, 5 % CO2-inkubator och byt odlingsmedium varannan 3-3 dag
OBS: Krypterna är vanligtvis inte synliga efter upptiningsproceduren, och de flesta cellerna dissocieras i ECM (figur 2B).
3. Passage av smågrisar, intestinala 3D-organoider härrörande från frysta krypter
OBS: Tiden för att erhålla organoider från frysta krypter är vanligtvis längre än när man startar från färska krypter. Organoider är vanligtvis redo för splittring 10 dagar efter upptining (figur 2B).
- Beredning av material
- Placera de frysta alikvoterna av ECM (500 μL) vid 4 °C i minst 1 timme.
- Förvärm plattorna med 24 brunnar vid 37 °C.
- Förvärm PBS och enzymdissociationsreagenset kompletterat med 10 μM Y27632 ROCK-hämmare i vattenbad vid 37 °C.
- Placera odlingsmediet vid RT.
- Placera en liten ishink under huven under aseptiska förhållanden.
- Passage av 3D-organoider härledda från frysta krypter
- Ta bort odlingsmediet och tvätta med 250 μl förvärmd PBS vid 37 °C.
- Tillsätt 250 μL förvärmt enzymdissociationsreagens kompletterat med 10 μM Y27632 ROCK-hämmare vid 37 °C i varje brunn.
OBS: På grund av det låga antalet organoider utförs dissociationen av organoider direkt i varje brunn. - Lossa organoiderna i ECM genom att skrapa med en P1000-pipett och homogenisera försiktigt genom pipettering fem gånger.
- Inkubera i 5 minuter i en 37 °C, 5% CO2-inkubator . Dissociera cellerna genom pipettering upp och ner 10 gånger med en P1000-pipet.
OBS: Målet är att erhålla isolerade celler eller små cellkluster (<10 celler). Kontrollera dissociationen under ett mikroskop. Om stora fragment av organoider fortfarande observeras, upprepa steg 3.2.4. - Tillsätt 500 μL DMEMc i varje brunn som innehåller dissocierade celler och slå samman upp till 12 brunnar i ett 15 ml koniskt rör innehållande 3 ml kall DMEMc.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 1 ml kall DMEMc.
- Räkna cellerna med en utspädning av 1: 2 i Trypan blå med en cellräknare.
OBS: Den automatiserade cellräknaren kan räkna cellerna i små kluster, om de finns. - Centrifugera den nödvändiga volymen av celllösningen så att den har 3 000 levande celler per kupol (en kupol per brunn på 24-brunnsplattan) vid 500 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Resuspendera cellerna med 17 μL kall DMEMc per 3 000 levande celler på is. Justera volymen till önskat antal brunnar.
- Tillsätt långsamt 33 μL kall ECM med kylda spetsar per 3 000 levande celler och homogenisera på is utan att göra bubblor. Justera volymen till önskat antal brunnar.
OBS: Cellerna återsuspenderas i en lösning innehållande 1/3 DMEMc och 2/3 ECM. För varje kupol behövs 50 μL av denna lösning. Utspädd ECM är billigare och lättare att pipettera. - Frö brunnarna med 50 μL ECM-cellsuspension per brunn med kylda spetsar i en förvärmd platta med 24 brunnar.
- Inkubera i 30 minuter i en 37 °C, 5% CO2-inkubator för polymerisation av ECM.
- Tillsätt 500 μL odlingsmedium per brunn. Inkubera i en 37 °C, 5% CO 2 inkubator och byt odlingsmedium var2-3 : e dag
OBS: Organoiderna kan antingen användas direkt för i) experiment, ii) underhåll av 3D-organoidkulturen, iii) frysning eller iv) sådd av organoidcellmonolagren (figur 1). Kontrollera tillväxten av organoiderna med ett mikroskop varje dag för att välja den optimala tidpunkten för uppdelning av organoiderna. Organoiderna måste ha en klar och tom lumen och väldefinierade kanter. Mogna organoider med svart skräp i lumen bör inte användas för splittring (figur 3).
4. Underhåll av organoidkultur i 3D
OBS: För passaging, organoider bör visas klart med en tom lumen. Svart skräp uppträder i lumen ungefär 5 dagar efter splittring och indikerar närvaron av döda celler. Att begränsa antalet döda celler vid tidpunkten för passage är att föredra för optimalt underhåll av kulturen. Tidsplanen bör därför anpassas för att undvika att detta mognadsstadium uppnås.
- Beredning av material
- Placera alikvoterna av ECM (500 μL) vid 4 °C för upptining i minst 1 timme.
- Förvärm en platta med 24 brunnar vid 37 °C.
- Förvärm enzymdissociationsreagenset kompletterat med 10 μM Y27632 ROCK-hämmare i ett vattenbad vid 37 °C.
- Placera odlingsmediet vid RT.
- Placera en liten ishink under huven under aseptiska förhållanden.
- Passage av intestinala 3D-organoider
- Lossa organoiderna med ECM genom att skrapa med en P1000-pipett. Homogenisera försiktigt genom pipettering i odlingsmediet och överför till ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml kall DMEMc på is.
OBS: Ett 15 ml koniskt rör krävs för en pool med 12 brunnar av organoider odlade i 50 μL kupoler i 24-brunnsplattor. - Centrifugera de uppsamlade organoiderna vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
OBS: Organoiderna bildar en vit pellet i botten av röret. Om organoiderna fortfarande finns i suspensionen i ECM efter centrifugering, aspirera försiktigt den övre supernatanten (utan att vidröra ECM-skiktet), homogenisera genom pipettering 10 gånger med en P1000-pipett och upprepa centrifugeringssteget. ECM-skiktet ska inte vara synligt efter denna procedur. - Aspirera försiktigt supernatanten och suspendera cellpelleten i 1 ml förvärmt enzymdissociationsreagens kompletterat med 10 μM Y27632 ROCK-hämmare. Pipet upp och ner 10 gånger för att initiera dissociation av organoiderna.
- Inkubera i 5 minuter i ett 37 °C vattenbad för enzymatisk nedbrytning.
- Bryt organoiderna mekaniskt genom pipettering 10 gånger med en P1000-pipet. Kontrollera cellsuspensionen under mikroskopet.
OBS: Målet är att erhålla isolerade celler eller små cellkluster. Om stora organoidfragment fortfarande observeras, upprepa inkubationen (steg 4.2.4) och den mekaniska störningen (steg 4.2.5). - Tillsätt 4 ml iskall DMEMc. Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C
- Kassera supernatanten och suspendera organoidcellpelleten i 1 ml DMEMc.
- Fortsätt enligt beskrivningen ovan (steg 3.2.7 till 3.2.13) för att räkna cellerna och frö organoidcellerna i 50 μL ECM-kupoler innehållande 3000 levande celler i förvärmda 24-brunnsplattor.
- Lossa organoiderna med ECM genom att skrapa med en P1000-pipett. Homogenisera försiktigt genom pipettering i odlingsmediet och överför till ett 15 ml koniskt rör innehållande 5 ml kall DMEMc på is.
5. Frysning av 3D-organoider
- Förbered den nödvändiga volymen (1 ml för en pool med två kupoler) fryslösning innehållande DMEMc kompletterad med 10% FBS, 10% DMSO och 10 μM Y27632 ROCK-hämmare och lagra på is (den slutliga FBS-koncentrationen är 18%).
- Ta bort odlingsmediet från brunnarna som ska frysas.
- Tillsätt 1 ml fryslösning till den första brunnen som ska frysas, lossa ECM genom skrapning och homogenisera med pipettspetsen.
- Överför organoidsuspensionen från den första brunnen till den andra brunnen som ska frysas.
- Överför poolen av de två brunnarna till ett kryorör och placera injektionsflaskan i en cellfrysningsbehållare.
- Förvara cellfrysbehållaren vid -80 °C i 24 timmar och överför sedan injektionsflaskorna till flytande kväve för långtidsförvaring.
6. Odling av cellmonolager härledda från 3D-organoider
OBS: Monolager av grisorganoidceller odlas i ett 2D-medium bestående av odlingsmediet som används för 3D-organoider kompletterat med 20% FBS.
- Beredning av material
- Förbered 2D-mediet och håll det vid RT.
- Förvärm enzymdissociationsreagenset kompletterat med 10 μM Y27632 ROCK-hämmare i ett vattenbad vid 37 °C.
- Beläggning av kulturinsatsen
- Sterilisera en pincett och överför dem till biosäkerhetsskåpet.
- Placera cellodlingsinsatserna (0,33 cm2) i en 24-brunnsplatta med pincetten.
- Bered beläggningslösningen innehållande kollagen IV utspätt vid 50 μg/ml i kall PBS. Pipettera upp och ner för att blanda
- Tillsätt 150 μL av den utspädda intravenös kollagenlösningen till varje cellodlingsinsats, vilket motsvarar 22,7 μg/cm2.
OBS: Orientera försiktigt pipeten vertikalt i mitten av det permeabla membranet och kontrollera att kollagenlösningen täcker hela membranet. - Placera plattan i en 37 °C, 5% CO2 inkubator och låt stå över natten (eller i minst 3 timmar).
- Sådd av 3D-organoidceller i cellodlingsinsatser
- Bered en cellsuspension från 3D-organoiderna enligt beskrivningen i steg 4.2.1 till 4.2.7.
- Räkna cellerna med en utspädning av 1: 2 i Trypan-blått med en cellräknare och beräkna den nödvändiga volymen för att frö 2,5 x 10 5 celler per odlingsinsats, motsvarande 7,6 x 105 celler / cm2.
- Centrifugera den nödvändiga volymen av cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Under centrifugeringen, aspirera försiktigt beläggningslösningen från odlingsinsatserna och låt torka vid RT under huven utan lock i 5 minuter.
- Efter centrifugering kasseras supernatanten och suspenderas cellpelleten igen i den nödvändiga volymen 2D-medium kompletterat med 10 μM Y27632 ROCK-hämmare. En volym på 200 μL 2D-medium innehållande cellerna behövs för varje insats.
- Frö 200 μL av cellsuspensionen (2,5 x 105 celler) på det belagda permeabla membranet (apikala sidan) (figur 4A).
OBS: Pipettera långsamt i mitten av membranet och håll spetsen vertikal. - Tillsätt 500 μL av 2D-mediet kompletterat med 10 μM Y27632 ROCK-hämmare till det nedre facket (basalsidan). Inkubera i en 37 °C, 5% CO2-inkubator .
- En dag efter sådd, ersätt det apikala och basala mediet med färskt 2D-medium utan Y27632 ROCK-hämmaren.
- Ändra 2D-mediet varje dag. Monolagret blir sammanflytande 1 dag efter sådd och kan sedan användas för experiment.
OBS: Ett transepitelialt elektriskt motståndsvärde (TEER) ovanför blanksteget (infoga utan celler) bekräftar att sammanflödet har uppnåtts (figur 4B).
7. Immunfärgning av organoidcellmonolager
- Beredning av lösningar
OBS: Justera volymen av lösningar enligt antalet brunnar som ska färgas; 200 μL av lösningen krävs vid varje steg för en brunn. Referenser till alla kommersiella produkter finns i materialförteckningen.- Bered en 4% paraformaldehydlösning (PFA) under en kemisk huva genom att tillsätta 5 ml 32% PFA till 35 ml PBS. Bered 10 ml alikvoter och förvara vid -20 °C.
VARNING: Manipulera alltid PFA under den kemiska huven när du bär nitrilhandskar. - Bered en lösning av 0,2% Triton X100-PBS genom att tillsätta 2 μL Triton X100 till 1 ml PBS omedelbart före användning. Håll på RT.
- Bered en 10% bovint serumalbumin (BSA)-PBS-lösning genom att tillsätta 100 mg BSA till 1 ml PBS. Håll på RT.
- Bered en 1% BSA-PBS-lösning genom att tillsätta 10 mg BSA till 1 ml PBS. Håll på RT.
- Bered en lösning av den ockludinska primära antikroppen utspädd vid 1:200 genom att tillsätta 5 μL primär antikropp till 995 μL 1% PBS BSA. Håll lösningen på is.
- Bered en lösning av den sekundära antikroppen utspädd vid 1:1 000 genom tillsats av 1 μl sekundär antikropp till 999 μl 1 % BSA-PBS. Håll lösningen på is, skyddad mot ljus.
- Bered en lösning av falloidin TRITC vid 10 μg/ml genom att tillsätta 10 μl TRITC vid 1 mg/ml till 990 μl PBS. Håll på is, skyddad mot ljus.
- Bered en 4% paraformaldehydlösning (PFA) under en kemisk huva genom att tillsätta 5 ml 32% PFA till 35 ml PBS. Bered 10 ml alikvoter och förvara vid -20 °C.
- Immunfärgning
Om inte annat anges utförs alla inkubationer vid rumstemperatur under långsam omrörning på en gungplattform (30 varv per minut). Immunfärgningen utförs direkt i cellodlingsinsatsen.- Ta bort det basala och apikala mediet. Placera plattan under den kemiska huven.
- Tvätta monolagren två gånger med 200 μl PBS vid rumstemperatur och inkubera i 5 minuter.
- Fixera cellmonolagren med 200 μL 4% PFA vid RT och inkubera i 20 minuter vid RT.
- Tvätta monolagren två gånger med 200 μl PBS vid rumstemperatur och inkubera i 5 minuter.
OBS: Efter fixerings- och tvättstegen kan monolagret förvaras vid 4 °C i PBS i 1 vecka. - Ta bort PBS, permeabilisera med 200 μL 0,2% Triton X100-PBS och inkubera i 20 minuter.
- Tvätta monolagren två gånger med 200 μl PBS vid rumstemperatur och inkubera i 5 minuter.
- Tillsätt 200 μl primär antikroppslösning i 1 % BSA-PBS och inkubera över natten vid 4 °C under långsam omrörning på en gungplattform. Inkludera en negativ kontrollbrunn genom att endast lägga till 1% BSA-PBS utan den primära antikroppen.
- Tvätta mellanläggen tre gånger med 200 μl PBS vid rumstemperatur och inkubera i 5 minuter.
- Tillsätt 200 μL sekundär antikropp i 1% BSA-PBS och inkubera vid RT i 2 timmar, skyddad från ljuset.
- Tvätta mellanläggen tre gånger med 200 μl PBS vid rumstemperatur och inkubera i 5 minuter.
- Tillsätt 200 μl falloidin TRITC vid 10 μg/ml och inkubera i 10 minuter.
- Tvätta monolagren två gånger med 200 μl PBS vid rumstemperatur och inkubera i 5 minuter.
- Ta bort PBS och skär membranet med en skalpell.
- Återställ membranet med en pincett och placera det på ett mikroskopglas, med den apikala sidan uppåt.
- Tillsätt 15 μL av monteringsmediet kompletterat med DAPI vid 1:1 000 direkt på membranet. Placera en täckglasning och försegla.
- Förvaras vid 4 °C, skyddad från ljus, tills avbildning.
Representative Results
Enligt det ovan beskrivna protokollet erhålls epitelkrypter från gristarmen och fryses för långvarig lagring i flytande kväve (figur 1 och figur 2A). Efter upptining sås kryptstamcellerna i ECM (figur 2B). Kryptstrukturen går vanligtvis förlorad efter detta steg på grund av sönderdelningen av kryptstrukturen i ECM. Organoiderna kan observeras inom 3-4 dagar och växer sedan snabbt och utvecklar spirande strukturer (Figur 2B). Vi fick framgångsrikt organoider efter upptining av frysta krypter i >80% av försöken. Cirka 10 dagar efter upptining (enligt organoidernas tillväxthastighet) utförs en passage av organoider för att expandera kulturen (figur 3). Organoiderna växer snabbare efter delning, och de presenterar olika morfologier, med några cystiska och en majoritet av spirande organoider. För optimalt underhåll av kulturen måste organoiderna som används för passaging presentera en klar och tom lumen och väldefinierade kanter (exempel indikerade med gröna pilar) utan svart skräp i lumen (indikerat med röda pilar), vilket observeras i mogna organoider (figur 3). Vi fann att svarta blodkroppar börjar ackumuleras runt dag 6 efter passaging. Således rekommenderas delning eller frysning av organoiderna vid dag 4-5 efter passaging.
Organoidernas mognadsstadium är också en viktig punkt för att erhålla cellmonolager. Organoider med avancerad mognad (indikeras av närvaron av svarta cellskräp i lumen) är inte optimala för frömonolager. Vi dissocierar vanligtvis 3D-organoider 4 dagar efter passage för att samla celler för 2D-odling. Ungefär en till tre brunnar av 3D-organoider odlade vid 3 000 celler per 50 μL kupol av ECM behövs för sådd av en kulturinsats med 2,5 x 105 celler. Celler fäster och bildar ett helt sammanflytande monolager inom 1 dag (figur 4A), vilket bekräftas av den höga TEER på cirka 700 Ω cm2 (figur 4B). Cellkanterna är dock svåra att visualisera med ljusfältmikroskopi vid denna tidiga tidpunkt, troligen på grund av en låg differentieringsnivå. TEER förblir hög i 3 dagar (figur 4B).
Aktinfärgning indikerar att den apikala sidan av epitelcellerna är orienterad mot lumen i 3D-organoider (figur 5A). Organoidceller sådda i odlingsinsats bildar ett sammanflytande enda lager av epitelceller, med den apikala sidan orienterad mot det övre facket (figur 4B, C). Ockludinfärgning avslöjar närvaron av täta korsningar vid epitelcellernas apikala sida i 3D-organoider och i cellmonolager (figur 5A-C).
Figur 1: Schematisk representation av de metoder som används för att odla 3D-organoider och cellmonolager härledda från organoider. Epitelkrypter isoleras från gristarmen. Dessa kryptor kan i) användas omedelbart för att odla 3D-organoider eller ii) frysas och lagras i en biobank i flytande kväve. Kryokonserverade krypter kan tinas och användas för att odla 3D-organoider. 3D-organoidkulturen kan bibehållas med successiv klyvning, eller frysas och lagras i biobanken. Cellmonolager kan erhållas från 3D-organoidkulturen för att möjliggöra åtkomst till den apikala sidan av cellerna och studera epitelbarriärfunktionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Odling av 3D-organoider från grisintestinala epitelkrypter. (A) Representativ mikroskopisk bild av nyligen isolerade jejunala krypter. (B) Representativa mikroskopiska bilder av 3D-organoider erhållna efter upptining av jejunalkrypterna. Organoiderna odlades i en 25 μL kupol av ECM i en 48-brunnsplatta. Figuren visar bilder av 3D-organoiderna vid 4, 7, 8, 9 och 10 dagar efter sådd. Skalstapeln representerar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Morfologi hos 3D-organoider i gristarmar härledda från kryokonserverade epitelkrypter efter den första passagen. Representativa mikroskopiska bilder som visar utvecklingen av organoider härrörande från kryokonserverade jejunumkryptor efter den första passagen från dag 4 till dag 7. Gröna pilar indikerar tydliga organoider som är lämpliga för passage eller sådd av monolager. Röda pilar indikerar mogna organoider som inte är lämpliga för splittring eller sådd av monolager; Således bör brunnar användas före uppenbarelsen av denna morfologi. Skalstapeln representerar 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Egenskaper hos cellmonolager härledda från 3D-organoider i gristarmen . (A) Representativa mikroskopiska bilder av monolagermorfologin under 3 dagar. Jejunum organoidceller såddes vid 2,5 x 105 celler i 0,33 cm2 cellodlingsinsatser belagda med kollagen IV vid 50 ng / ml. Skalstapeln representerar 500 μm. (B) Transepitelialt elektriskt motstånd (TEER) hos organoidcellmonolager under 3 dagar. Prickar anslutna med en linje motsvarar samma brunn vid olika tidpunkter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Avbildning av gris jejunum organoider odlade i 3D eller 2D. Konfokalmikroskopiavbildning av (A) 3D-organoider 5 dagar efter klyvning och (B,C) monolager av organoidceller 3 dagar efter sådd (B: XZ-sektion; C: XY avsnitt). DNA (blått) färgades med DAPI. Actin (röd) färgades med falloidin. Occludin (grön) färgades med en polyklonal antikropp. Vita pilar indikerar ockludin lokaliserad vid den snäva korsningen. Skalstapeln representerar 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod som används för att kryokonservera epitelkrypter från gristarmen för långvarig lagring och efterföljande odling av 3D-organoider. Detta protokoll använder en fryslösning innehållande DMSO, FBS, Y27632 ROCK-hämmaren, DMEM och antibiotika. En annan studie på grisar erhöll organoider från krypter kryokonserverade i en liknande fryslösning men utan ROCK-hämmaren15. Y27632 ROCK-hämmaren inkluderades för att förhindra apoptos och upprätthålla stamcellspoolen eftersom epiteliala kryptceller dissocieras efter upptining, vilket kan leda till celldöd ("anoikis")27,28. Intressant nog har hästenteroider erhållits från epitelkrypter frysta i ett odlingsmedium innehållande endast DMEM och DMSO16; Denna enkla metod har inte testats för grisepitelkrypter ännu. Andra metoder har publicerats för att odla humana och grisorganoider från frysta vävnader eller biopsier istället för epitelkrypter 4,17. Fördelen med denna metod är förmågan att direkt kryokonservera tarmvävnaderna utan att utföra kryptisoleringsproceduren, vilket kräver tid och laboratorieutrustning. Detta kan vara praktiskt när vävnaderna måste samlas långt från labbet. Vid isolering av krypterna omedelbart efter slakt kan emellertid stora delar av tarmen bearbetas för att erhålla ett mycket stort antal krypter, vilket inte är fallet när man utgår från små frysta vävnadsfragment. Efter upptining av epitelkrypter observerades organoider från 3-4 dagar efter sådd och delades efter 10 dagar. Detta är en långsammare tillväxthastighet än vid start av kulturen från färska epitelkrypter, för vilka organoiderna erhölls från dag 1 efter sådd, och kan vanligtvis delas runt dag 511. Khalil et al. rapporterade också en fördröjd tillväxt av grisenteroider vid start från frysta krypter15, vilket tyder på att stamceller kan kräva tid för att återställa sin proliferativa kapacitet. Vi fick också ett lägre antal organoider när vi startade från frysta krypter jämfört med färska krypter, vilket kan bero på att stamceller dör under frysningsprocessen. I vissa försök att tina krypter (<20%) fick vi inte organoider från frysta krypter, troligen på grund av en suboptimal kryokonserveringsprocedur (t.ex. fördröjd frysning efter kryptisolering på förmodligen mer än 1 h). Därför rekommenderar vi att du håller krypterna på is tills du räknar och fryser dem så snabbt som möjligt.
För 3D-organoider valde vi att använda ett kommersiellt organoidodlingsmedium formulerat för människor. Faktum är att tidigare rapporter har visat att grisintestinala organoider växer effektivt med detta medium 8,11,14,19,25,26,29,30. Det är av intresse för detta odlingsmedium att vara färdigt att använda och ha en standardiserad koncentration av tillväxtfaktorer inom en sats. Detta odlingsmedium är emellertid dyrt, dess sammansättning är inte avslöjad och det är därför inte möjligt att modulera dess sammansättning. Däremot har andra studier odlat gristarmorganoider i skräddarsydda medier innehållande farmakologiska hämmare, rekombinant tillväxtfaktor och / eller konditionerade medier 5,6,7,21. Även om den är mycket flexibel och billigare, är denna metod tidskrävande för produktion av konditionerade medier och kan sakna reproducerbarhet på grund av potentiell variation i koncentrationen av tillväxtfaktorer i konditionerade medier. Således bör kvaliteten på varje sats av konditionerade medier valideras genom mätning av organoidtillväxt eller markörgenuttryck31.
En studie har visat att gris jejunala organoider odlade i samma kommersiella organoidodlingsmedium som används här växte snabbare och verkade mindre differentierade jämfört med enteroider odlade med media innehållande rekombinant tillväxtfaktor och / eller konditionerade medier23. Ett högt proliferativt tillstånd underlättar odlingen av 3D-organoider, men kan kräva inducerande differentiering för att vara mer representativ för tarmfysiologiska egenskaper. I detta protokoll, för passage av 3D-organoider, dissocieras cellerna fullständigt för räkning, vilket gör det möjligt att kontrollera antalet celler som ympas i ECM. Detta ökar reproducerbarheten av fenotypen av organoider, vilket påverkas starkt av deras densitet. Dessutom undviker man genom att räkna cellerna att få för låg eller en överfull kultur, vilket kräver anpassning av odlingsschemat. De flesta andra studier förberedde organoidfragment som inte var helt dissocierade till enskilda celler och använde ett utspädningsförhållande för passaging. Denna metod är enklare, men kan inducera variation beroende på kulturens organoiddensitet.
För odlingen i monolager sås organoidceller i odlingsinsatser förbelagda med ett tunt lager ECM, som möjliggör bindning av celler men undviker tillväxt av organoider i 3D. Detta protokoll använde kollagen typ IV som ett ECM-protein, som beskrivits tidigare hos grisar23. Andra studier med grisorganoidmonolager använde samma tumörhärledda ECM som används här för att odla 3D-organoider 6,8,9,21,25,30. Fördelen med att använda kollagen är förmågan att standardisera proteinkoncentrationen med en fullständigt definierad komposition, vilket inte är fallet i tumör-härledd ECM. Ett kritiskt steg för framgången med kulturen av cellmonolager är att uppmärksamma det visuella utseendet hos föregångaren 3D-organoider, som ska ha väldefinierade kanter och en tom lumen utan svarta skräp. Faktum är att organoider med hög mognadsnivå och låg proliferativ hastighet inte är en lämplig källa till celler för 2D-odling. Således är tidpunkten för dissociationen av 3D-organoider i enskilda celler avgörande för framgången med detta steg.
Kulturen av 2D-monolager från enskilda celler möjliggör standardisering av antalet celler som utsädes, vilket är svårare när man börjar från organoidfragment, som utförs i vissa andra metoder. Vi sådde 7,6 x 10 5 celler per cm 2, vilket är högt jämfört med de flesta andra studier 21,22,23 hos grisar som använde en lägre celldensitet, allt från0,25 x 10 5 celler per cm 2 till 1,78 x 10 5 celler per cm2. Kravet på ett stort antal organoidceller utgör en begränsning av detta protokoll, men det gjorde det möjligt för oss att snabbt få ett konfluent monolager som helt täcker odlingsinsatsen efter 1 dag. Däremot erhöll Vermeire et al.23 sammanflöde efter 4-7 dagar med en lägre densitet av celler sådda (från 0,25 x 10 5 celler / cm 2 till 0,4 x 105 celler / cm2). Vissa studier har också använt monolager av organoidceller från gris som inte helt täckte odlingsytan för infektioner med virus 8,30. Under dessa förhållanden är den apikala sidan av epitelceller tillgänglig för behandlingar, men helt sammanflytande monolager krävs om målet är att studera näringsabsorption eller epitelpermeabilitet.
För organoidcellmonolager användes ett kommersiellt organoidodlingsmedium kompletterat med 20% FBS, baserat på en nyligen genomförd studie på bovina enteroid-härledda monolager32. I våra tester var tillskottet med 20% FBS nödvändigt för att erhålla helt sammanflytande monolager, troligen på grund av ett högt tillväxtfaktorkrav. Tvärtom har andra studier som använder samma kommersiella medium etablerat monolager utan ytterligare FBS 8,25,30, men utan att nå full sammanflöde. Andra studier har också använt tillskott med 20% FBS i ett anpassat medium för odling av grisorganoidcellmonolager21,22. I våra experiment är TEER hög 1 dag efter sådd (cirka 700 Ω cm 2) och förblir hög fram till dag 3 (cirka 1 500 Ω cm2; detta överensstämmer med bildandet av snäva korsningar, vilket indikeras av uttrycket av ockludin. Van der Hee et al. erhöll liknande TEER-värden över 72 timmar för jejunumorganoidcellmonolager21. De visade också att monolager kan bibehållas fram till dag 12-15 med dagliga medieförändringar. Däremot har andra studier rapporterat mycket lägre TEER-värden (cirka 200 Ω·cm2) för grisorganoidcellmonolager 6,22. Dessa skillnader mellan studier kan vara relaterade till det studerade tarmsegmentet eller till de medier som används som påverkar epiteldifferentiering.
Sammanfattningsvis underlättar ovanstående protokoll för att odla gristarm 3D-organoider från frysta epitelkrypter organisationen av kulturarbetet. Det minskar behovet av färska vävnader som ska erhållas från levande djur. Vi förklarar också hur man etablerar helt sammanflytande cellmonolager härledda från grisorganoider på mindre än 3 dagar. Således kan våra protokoll vara användbara resurser för forskare som studerar gristarmepitelet för veterinärmedicinsk eller biomedicinsk forskning.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Institut Carnot France Futur Elevage ("OrganoPig" -projektet) och av INRAE HOLOFLUX ("Holopig" -projektet). Författarna är tacksamma för Genotoul core facilities (TRI). Vi tackar Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) för noggrann korrekturläsning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | Store at room temperature. |
| 15 mL conical tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 24-well cell culture plate | Corning | 003526 | |
| 48-well cell culture plate | Corning | 003548 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Euromedex | A6003 | Store at 4 °C. |
| Centrifuge Universal 320 R | Hettich | 1406 | |
| Collagene type IV from human placenta | Sigma | C5533 | Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C. |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | 432003 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | 16842556 | |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm | VWR | 630-1845 | |
| Cryotube ClearLine 1 mL | Clear line | 390706 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C |
| Dithiothreitol (DTT) | Merck | 10197777001 | Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31966047 | Store at 4 °C. |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25-950-CQC | Store at room temperature. |
| Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide | VWR | 631-9483 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | Used for crypt isolation. |
| Fixed Tilt 3D Platform Rotator | VWR | 97025-564 | Used for incubations in the immunostaining protocol. |
| Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | Store at 4 °C. |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature. |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000. |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technology | 6010 | Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week. |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Corning | 353095 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS2 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C. |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectashield | H1250 | Store at 4 °C. |
| Occludin polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 71-1500 | Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200. |
| Paraformaldehyde 32% | Electron microscopy science | 15714 | Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
| Phalloidin TRITC | Sigma | P1951 | Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C. |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C. |
| ROCK Inhibitor (Y27632) | ATCC | ACS-3030 | Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C. |
| Rotating shaker mix XL | Clear line | 062646CL | Used for crypt isolation. |
| Stripette Serological Pipets 10 mL | Corning | 4488 | |
| Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| Triton X100 | Sigma | 8787 | Store at room temperature. |
| Trypan Blue stain 0.4% | Thermo Fisher Scientific | T10282 | Store at room temperature. |
| Vacuum system Vacusip | Integra | 159000 | Used to remove the medium of organoid wells. |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Beaumont, M., et al.
- Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).
- Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).
- vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).
- Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).
- Mussard, E., et al. The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).
- Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).
- Wang, Z., et al. Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells. Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
- Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).
- Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).
- Tsai, Y. -H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
- Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
- Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).
- Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut. Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).
- Luo, H., et al. Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro. Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).
- Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2. Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).
- Engevik, A. C., et al. Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters. Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).
- Ferrandis Vila, M., et al. Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum. PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).
- Li, L., et al. IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia. Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).
