Summary
A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.
Abstract
A transcrição espacial temporal de genes é fortemente regulada por elementos regulatórios distais, como intensificadores e silenciadores, que dependem da proximidade física com seus promotores gênicos alvo para controlar a transcrição. Embora esses elementos regulatórios sejam fáceis de identificar, seus genes-alvo são difíceis de prever, uma vez que a maioria deles é específica do tipo celular e pode ser separada por centenas de quilobases na sequência linear do genoma, pulando sobre outros genes não-alvo. Por vários anos, o Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) tem sido o padrão-ouro para a associação de elementos regulatórios distais aos seus genes-alvo. No entanto, a PCHi-C depende da disponibilidade de milhões de células, proibindo o estudo de populações celulares raras, como as comumente obtidas de tecidos primários. Para superar essa limitação, foi desenvolvido o Low input Capture Hi-C (liCHi-C), um método econômico e personalizável para identificar o repertório de elementos regulatórios distais que controlam cada gene do genoma. O liCHi-C baseia-se em uma estrutura experimental e computacional semelhante à PCHi-C, mas empregando mudanças mínimas de tubo, modificando a concentração e os volumes do reagente e trocando ou eliminando etapas, ele é responsável por uma perda mínima de material durante a construção da biblioteca. Coletivamente, o liCHi-C possibilita o estudo da regulação gênica e da organização espaço-temporal do genoma no contexto da biologia do desenvolvimento e da função celular.
Introduction
A expressão gênica temporal impulsiona a diferenciação celular e, em última instância, o desenvolvimento do organismo, e sua alteração está intimamente relacionada a uma ampla gama de doenças1,2,3,4,5. A transcrição gênica é finamente regulada pela ação de elementos regulatórios, que podem ser classificados em proximais (i.e., promotores gênicos) e distais (e.g., intensificadores ou silenciadores), estes últimos frequentemente localizados distantes de seus genes-alvo e interagindo fisicamente com eles através de looping de cromatina para modular a expressão gênica 6,7,8.
A identificação de regiões reguladoras distais no genoma é uma questão amplamente consensual, uma vez que essas regiões abrigam modificações específicas de histonas 9,10,11 e contêm motivos específicos de reconhecimento de fatores de transcrição, atuando como plataformas de recrutamento para elas12,13,14. Além disso, no caso dos intensificadores e superpotencializadores 15,16, eles também apresentam baixa ocupação nucleossômica 17,18 e são transcritos em eRNAs não codificantes 19,20.
No entanto, os genes-alvo de cada elemento regulatório distal são mais difíceis de prever. Na maioria das vezes, as interações entre os elementos regulatórios distais e seus alvos são do tipo celular e estímulo específico 21,22, abrangem centenas de quilobases, fazendo ponte com outros genes em qualquer direção 23,24,25, podendo inclusive estar localizadas dentro de regiões intrônicas de seu gene alvo ou de outros genes não intervenientes 26,27. Além disso, elementos reguladores distais também podem controlar mais de um gene ao mesmo tempo, evice-versa28,29. Essa complexidade posicional dificulta a identificação de associações regulatórias entre eles e, portanto, a maioria dos alvos de cada elemento regulatório em cada tipo celular permanece desconhecida.
Durante os últimos anos, houve um boom significativo no desenvolvimento de técnicas de captura de conformação cromossômica (3C) para estudar interações com cromatina. O mais utilizado deles, o Hi-C, permite gerar um mapa de todas as interações entre cada fragmento do genoma de uma célula30. No entanto, para detectar interações significativas no nível de fragmento de restrição, o Hi-C depende de sequenciamento ultraprofundo, proibindo seu uso para estudar rotineiramente o cenário regulatório de genes individuais. Para superar essa limitação econômica, várias técnicas 3C baseadas em enriquecimento surgiram, como ChIA-PET31, HiChIP 32 e sua contraparte de baixa entrada HiCuT33. Essas técnicas dependem do uso de anticorpos para enriquecer interações genômicas mediadas por uma proteína específica. No entanto, a característica única dessas técnicas 3C é também a banalidade de sua aplicação; Os usuários contam com a disponibilidade de anticorpos de alta qualidade para a proteína de interesse e não podem comparar condições em que a ligação da proteína é dinâmica.
O Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) é outra técnica 3C baseada em enriquecimento que contorna essas limitações34,35. Ao empregar um sistema de enriquecimento de sonda de RNA biotinilado, o PCHi-C é capaz de gerar bibliotecas genômicas de alta resolução de regiões genômicas interagindo com 28.650 promotores de genes humanos ou 27.595 anotados em camundongos, também conhecidos como interactome promotor. Esta abordagem permite detectar interações significativas de longo alcance na resolução do nível de fragmento de restrição de promotores ativos e inativos, e comparar robustamente os interátomos promotores entre qualquer condição, independentemente da dinâmica de modificações de histonas ou ligação de proteínas. A PCHi-C tem sido amplamente utilizada nos últimos anos para identificar reorganizações interatomas promotoras durante a diferenciação celular 36,37, identificar o mecanismo de ação dos fatores de transcrição38,39 e descobrir novos potenciais genes e vias desreguladas na doença por variantes não codificantes 40,41,42,43,44,45,46,47,48, ao lado de novas mutações não codificadoras 49,50. Além disso, apenas modificando o sistema de captura, essa técnica pode ser personalizada de acordo com a questão biológica para interrogar qualquer interatoma (por exemplo, o interatoma intensificador 51 ou o interatoma de uma coleção de alterações não codificantes41,52).
No entanto, a PCHi-C depende de um mínimo de 20 milhões de células para realizar a técnica, o que impede o estudo de populações celulares escassas como as frequentemente usadas em biologia do desenvolvimento e aplicações clínicas. Por esta razão, desenvolvemos o Low input Capture Hi-C (liCHi-C), um novo método econômico e personalizável baseado na estrutura experimental do PCHi-C para gerar interatomas promotores de alta resolução com entrada de baixa célula. Realizando o experimento com trocas mínimas de tubo, trocando ou eliminando etapas do protocolo PCHi-C original, reduzindo drasticamente os volumes de reação e modificando as concentrações de reagentes, a complexidade da biblioteca é maximizada e é possível gerar bibliotecas de alta qualidade com apenas 50.000 células53.
O Low input Capture Hi-C (liCHi-C) tem sido comparado com PCHi-C e usado para elucidar a religação do interatoma promotor durante a diferenciação de células hematopoéticas humanas, descobrir potenciais novos genes e vias associadas à doença desreguladas por alterações não-codificantes e detectar anormalidades cromossômicas53. O passo-a-passo do protocolo e os diferentes controles de qualidade através da técnica são detalhados aqui até a geração final das bibliotecas e sua análise computacional.
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Protocol
Para garantir uma perda mínima de material, (1) trabalhar com tubos e pontas de baixa ligação de ADN (ver Tabela de Materiais), (2) colocar reagentes na parede do tubo em vez de introduzir a ponta no interior da amostra e, (3) se possível, misturar a amostra por inversão em vez de pipetar a amostra para cima e para baixo, e girar para baixo depois para recuperar a amostra.
1. Fixação celular
- Células crescendo em suspensão
- Colher 50.000 a um milhão de células e colocá-las em um tubo de DNA de baixa ligação de 1,5 mL.
NOTA: Os tipos celulares utilizados para o presente estudo estão detalhados na seção de resultados representativos. - Centrifugar as células durante 5 minutos a 600 x g (a 4 °C) utilizando uma centrífuga de rotor de ângulo fixo e remover o sobrenadante por pipetagem.
- Ressuspender as células em 1 mL de RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) à temperatura ambiente.
- Adicionar 143 μL de formaldeído a 16% sem metanol para atingir uma concentração de 2% e misturar.
- Incubar as células por 10 min enquanto gira à temperatura ambiente para fixar as células.
NOTA: Tente ser o mais preciso possível com a incubação de 10 min. A fixação excessiva ou insuficiente das células pode levar a uma diminuição da qualidade da biblioteca. - Atenuar a reacção adicionando 164 μL de glicina 1 M gelada e misturar. Incubar as células por 5 min, girando à temperatura ambiente.
- Incube ainda mais as células por 15 min no gelo, misturando por inversão a cada ~5 min.
- Centrifugar as células por 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) usando uma centrífuga de rotor de ângulo fixo e remover o sobrenadante.
- Lave as células ressuspendendo o pellet em 1 mL de solução salina 1x tamponada com fosfato (PBS) gelada.
- Centrifugar as células durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) e remover o sobrenadante.
NOTA: As células peletizadas podem ser congeladas em nitrogênio líquido ou gelo seco e armazenadas a -80 °C.
- Colher 50.000 a um milhão de células e colocá-las em um tubo de DNA de baixa ligação de 1,5 mL.
- Células aderentes
- Lave as células na placa de cultura com 1x PBS.
- Preparar RPMI 1640 suficiente suplementado com FBS 10% e formaldeído a 2% livre de metanol à temperatura ambiente para cobrir o prato de cultura.
- Adicione o meio suplementado à placa de cultura com as células e incube por 10 min, balançando à temperatura ambiente para fixar as células.
NOTA: Tente ser o mais preciso possível com a incubação de 10 min. A fixação excessiva ou insuficiente das células pode levar a uma diminuição da qualidade da biblioteca. - Atenuar a reação adicionando 1 M de glicina até 0,125 M e misturar por balanço.
- Incubar as células por 5 min, balançando à temperatura ambiente.
- Incubar ainda mais as células por 15 min a 4 °C, misturando balançando a cada 3-4 min.
- Retire o meio e lave as células com 1x PBS frio.
- Raspar as células e transferi-las para um tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL. Limpe a placa de cultura com 0,5-1 mL de PBS frio 1x.
- Centrifugar as células por 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) usando uma centrífuga de rotor de ângulo fixo e remover o sobrenadante. As células peletizadas podem ser congeladas em nitrogênio líquido ou gelo seco e armazenadas a -80 °C.
2. Lise e digestão
- Ressuspender as células em 1 mL de tampão de lise a frio (Tabela 1) para romper a membrana celular. A adição do tampão por si só deve ser suficiente para ressuspender as células, mas elas podem ser ressuspensas se necessário por vórtices leves.
- Incubar no gelo por 30 min, misturando por inversão a cada ~5 min. Centrifugar os núcleos durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressuspender os núcleos com 500 μL de tampão de restrição 2 a frio de 1,25x (ver Tabela de Materiais).
- Centrifugar os núcleos durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) e remover o sobrenadante. Ressuspender os núcleos em 179 μL de 1,25x tampão de restrição 2.
- Adicionar 5,5 μL de dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS; ver Tabela de Materiais) e misturar. As células podem formar aglomerados; Isso é normal e precisa ser desagregado o máximo possível por vórtice. Incubar a amostra durante 1 h a 37 °C num termobloco, agitando a 950 rpm.
- Temperar o SDS adicionando 37,5 μL de 10% Triton X-100 e misturar. Incubar a amostra durante 1 h a 37 °C num termobloco, agitando a 950 rpm.
- Digerir a cromatina adicionando 7,5 μL de HindIII (100 U/μL; ver Tabela de Materiais) e misturar. Incubar a amostra durante a noite a 37 °C num termobloco, agitando a 950 rpm.
- Na manhã seguinte, adicione mais 2,5 μL de HindIII (100 U/μL) e incube a amostra por 1 h a 37 °C em um termobloco, com agitação a 950 rpm para garantir a digestão adequada da cromatina.
NOTA: Como parte dos controlos da eficiência da digestão (ver passo 5.1), transfira o equivalente a 20.000 a 40.000 núcleos para outro tubo para representar o controlo não digerido. Após a digestão, transfira o mesmo número de células para outro tubo novamente para representar o controle digerido. Recomenda-se testar a eficiência da digestão como um experimento separado se a disponibilidade do material de partida for escassa.
3. Ligadura e descrosslinking
- Resfriar a amostra no gelo. Preparar um mastermix e adicionar os seguintes reagentes para preencher e biotinilar as saliências do fragmento de restrição: 3 μL de 10x tampão de restrição 2, 1 μL de água livre de nuclease, 0,75 μL de 10 mM dCTP, 0,75 μL de 10 mM dTTP, 0,75 μL de 10 mM dGTP, 18,75 μL de 0,4 mM de biotina-14-dATP e 5 μL de 5 U/μL de Klenow (ver Tabela de Materiais). Incubar a amostra por 75 min a 37 °C, misturando por inversão a cada ~15 min.
- Resfriar a amostra no gelo. Preparar um mastermix e adicionar os seguintes reagentes para ligar as extremidades preenchidas do DNA: 50 μL de tampão de ligadura 10x, 2,5 μL de albumina de soro bovino (BSA) 20 mg/mL, 12,5 μL de DNA ligase 1 U/μL T4 e 173 μL de água livre de nucleases (ver Tabela de Materiais).
- Incubar a amostra durante 4-6 h a 16 °C, misturando por inversão a cada ~1 h. Além disso, incubar a amostra por 30 min à temperatura ambiente. Descruzar a cromatina adicionando 30 μL de 10 mg/mL de proteinase K e misturar. Incubar a amostra durante a noite a 65 °C.
- Na manhã seguinte, adicionar mais 15 μL de 10 mg/mL de proteinase K e incubar a amostra por 2 h a 65 °C para garantir a desreticulação adequada da cromatina.
4. Purificação do DNA
- Arrefecer a amostra à temperatura ambiente e transferi-la para um tubo adequado para a purificação do fenol-clorofórmio.
- Adicionar 1 volume (545 μL) de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) para purificar o ADN e misturar agitando vigorosamente.
- Centrifugar a amostra durante 5 minutos a 12.000 x g à temperatura ambiente e transferir a fase aquosa superior (545 μL) para um tubo de ligação baixa de ADN de 2 ml.
- Adicionar os seguintes reagentes para precipitar o DNA: 1.362,5 μL de etanol 100% resfriado a -20 °C, 54,5 μL de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 2 μL de glicogênio 15 mg/mL como coprecipitante.
- Incubar durante 1 h a -80 °C ou durante a noite a -20 °C.
- Centrifugar a amostra durante 30 min a 16.000-21.000 x g a 4 °C e remover o sobrenadante. A pastilha de DNA deve ser visível.
- Lave o pellet adicionando 1 mL de etanol a 70%, vórtice e centrifugação por 10 min a 16.000-21.000 x g à temperatura ambiente.
- Retire o sobrenadante e deixe o pellet secar ao ar. Ressuspender a pastilha de DNA em 130 μL de água livre de nucleases.
- Avaliar a concentração por quantificação fluorométrica (ver Tabela de Materiais). Conservar o material 3C purificado a -20 °C durante vários meses antes de prosseguir com o protocolo.
5. Controles de qualidade opcionais
- Avaliar a eficiência da digestão. Efectuar a desreticulação e a purificação do ADN fenol:clorofórmio, conforme descrito anteriormente, para os controlos não digeridos e digeridos obtidos no passo 2.13. Ressuspender a pastilha de DNA em 10 μL de água livre de nucleases. Quantificar a concentração e diluir o ADN obtido, se necessário, para 4 ng/μL.
- Realizar PCR quantitativo com 4 ng de DNA dos controles não digerido e digerido, com primers abrangendo um locus aberto de cromatina com e sem um alvo HindIII (veja a Tabela 2 para o design do primer). Calcular a eficiência da digestão seguindo um relatório publicado anteriormente35.
NOTA: A eficiência da ligadura é calculada em percentagem utilizando a fórmula: digestão (%) = 100 -100/(2^[(Ct digerido com HindIII - Ctdigested sem HindIII) - (Ct não digerido com HindIII - Ct não digerido sem HindIII)]) (ver Tabela 3), que tem em conta o diferencial dos diferentes Cts obtidos para cada par de primers nos controlos não digerido e digerido. - Avaliar a sensibilidade da detecção de interação realizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional (0,2 mM dNTP, 0,4 μm ambos os primers F + R, 0,1 e U/μL polimerase de início a quente), com primers abrangendo interações invariantes celulares de longo e curto alcance (consulte a Tabela 2 para o design do primer). Use 50-100 ng de material 3C (para interações de curto e longo alcance, respectivamente) e amplie usando as seguintes condições: 98 °C por 15 min, seguido por 37 ciclos de 98 °C por 30 s, 60 °C por 1 min, 72 °C por 1 min e terminar por 72 °C por 10 min. Segure a 4 °C.
NOTA: Se a quantidade de DNA obtida for inferior a 2 μg, verifique apenas uma interação de longo e curto alcance em vez de todo o painel de interação. - Executar o produto em 1x tris-borato-EDTA (TBE) usando gel de agarose a 1,6% e procurar a presença do amplicon de PCR correspondente54.
NOTA: Devido ao imprevisível "recorte-e-colagem" do genoma, bandas inespecíficas podem aparecer. Desde que o tamanho correto da banda seja observado, ele é contado como correto. - Avaliar a eficiência do preenchimento e da ligadura de biotina digerindo diferencialmente um produto de PCR de curto alcance com HindIII, NheI (ver Tabela de Materiais), ambas as enzimas ou nenhuma (água), e executando o produto em um gel de agarose 1x TBE a 1,6%. Um correto preenchimento e ligadura eliminam o alvo HindIII anterior e criam um novo alvo NheI, de modo que o amplicon deve ser cortado apenas na presença de NheI.
NOTA: Para minimizar a perda de material, recupere 2,5 μL de um produto de PCR de curto alcance dos controles de interação e reamplie-o cinco vezes para realizar os controles de preenchimento e ligadura.
6. Sonicação
- Transfira os 130 μL da amostra (completar com água livre de nuclease, se alguma for usada para os controles) para uma cubeta adequada para sonicação.
- Configure um sonicador e sonicate em banho-maria usando os seguintes parâmetros (otimizados para o modelo e cubetas descritos na Tabela de Materiais): fator de trabalho: 20%; potência de incidência de pico: 50; ciclos por burst: 200; tempo: 65 s; e faixa de temperatura: 6-10 °C (8 °C ideal).
- Transfira a amostra para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL.
7. Reparo final
- Prepare um mastermix e adicione os seguintes reagentes para reparar as extremidades irregulares dos fragmentos de DNA criados durante a sonicação: 18 μL de tampão de ligadura 10x, 18 μL de mistura de 2,5 mM dNTP cada, 6,5 μL de 3 U/μL T4 DNA polimerase, 6,5 μL de 10 U/μL T4 PNK e 1,3 μL de 5 U/μL Klenow (ver Tabela de Materiais).
- Incubar a amostra durante 30 min a 20 °C e completar com tampão Tris-low EDTA (TLE) (ver quadro 1) até 300 μL.
8. Biotina pull-down
- Transfira 150 μL de contas de estreptavidina C1 (ver Tabela de Materiais) por amostra para um tubo de 1,5 mL, coloque-as em um ímã de tubo de 1,5 mL e aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede. Retire o sobrenadante, deixando as contas para trás.
- Lavar as contas com 400 μL de tampão 1x Tween (TB; ver Tabela 1). Para lavar as contas, adicione o tampão e ressuspenda-as por vórtice suave. Coloque o tubo de volta no ímã e aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede. Retire o sobrenadante, deixando as contas para trás.
- Lavar as esferas com 300 μL de tampão 1x sem Tween (NTB; ver Tabela 1). Ressuspender as contas em 300 μL de 2x NTB (ver Tabela 1).
NOTA: As contas podem formar uma camada empoeirada ao redor da parede do tubo ao lavar com tampões sem detergente. Isso é normal e não afeta o resultado do protocolo. - Combinar estes 300 μL de contas em 2x NTB com os 300 μL da amostra. Incubar por 15 min, girando à temperatura ambiente para puxar para baixo os fragmentos informativos de DNA com biotina. A biblioteca agora está presa às contas de estreptavidina C1.
- Lave as contas com 400 μL de 1x NTB. Lavar as esferas com 100 μL de tampão TLE e depois ressuspendê-las em 35,7 μL de tampão TLE.
9. dATP-tailing, ligadura do adaptador e amplificação por PCR
- Preparar um mastermix e adicionar os seguintes reagentes à amostra para dATP-cauda das extremidades dos fragmentos de DNA reparados: 5 μL de 10x tampão de restrição 2, 2,3 μL de 10 mM dATP e 7 μL de 5 U/μL de Klenow exo-. Incubar a amostra durante 30 min a 37 °C.
- Inative o exo- de Klenow incubando ainda mais a amostra durante 10 min a 65 °C. Resfriar a amostra no gelo. Lave as contas com 300 μL de 1x TB. Lave as contas com 300 μL de 1x NTB.
- Lavar as esferas com 100 μL de tampão de ligadura 1x e depois ressuspendê-las em 50 μL de tampão de ligadura 1x. Adicionar 4 μL de mistura de adaptadores pré-recozida de 15 μM (ver quadro 2) e 1 μL de 2.000 U/μL de liga de ADN T4 (ver Tabela de Materiais) à amostra.
- Incubar durante 2 h à temperatura ambiente. Lave as contas com 400 μL de 1x TB. Lave as contas com 200 μL de 1x NTB. Lave as contas com 100 μl de 1x tampão de restrição 2.
- Lave as esferas com 50 μL de 1x tampão de restrição 2 e depois as ressuspenda em 50 μL de 1x tampão de restrição 2.
- Misturar os seguintes reagentes para preparar a reação de PCR para amplificar a biblioteca: 50 μL de contas com a biblioteca, 250 μL de 2x PCR mastermix com enzima, 12 μL de primers F + R (25 μM cada; ver Tabela 2) e 188 μL de água livre de nucleases.
- Realizar a PCR com as seguintes condições (dividir a mistura de reagentes de PCR em reações de 50 μL): 98 °C por 40 s, seguido por ciclos X de 98 °C por 10 s, 65 °C por 30 s, 72 °C por 30 s e terminar em 72 °C por 10 min. Segure a 4 °C.
NOTA: Use o seguinte número de ciclos como ponto de partida para otimizar o protocolo em células diploides visando uma saída de 500-1.000 ng antes da captura da biblioteca: um milhão de células para oito ciclos; 250.000 células por 10 ciclos; 50.000 células por 12 ciclos. - Junte todas as reações de 50 μL da mesma amostra em um tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL, coloque-o em um ímã de tubo de 1,5 mL e aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede.
- Transferir o sobrenadante que contém a biblioteca (500 μL) para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL. Completar com tampão TLE para 500 μL se algum do sobrenadante foi perdido. As contas de estreptavidina C1 não são mais necessárias.
- Realizar uma seleção frente e verso55 usando purificação de esferas paramagnéticas (0,4-1 volume). Isso permite a eliminação seletiva de fragmentos muito grandes (>1.000 pb) e muito pequenos ou primers de PCR (<200 pb), dependendo da concentração de polietilenoglicol e sal das esferas paramagnéticas adicionadas.
- Adicione 200 μL (0,4 volumes) de contas de estoque à biblioteca e misture por vórtice. Incubar durante 10 minutos, girando à temperatura ambiente.
- Coloque em um ímã, aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede e transfira o sobrenadante que contém a biblioteca (sem os fragmentos maiores) para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL.
- Concentre as contas tomando 750 μL de contas de estoque, coloque-as em um tubo de 1,5 mL em um ímã, aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede, remova o sobrenadante e ressuspenda as contas por vórtice em 300 μL de novas contas de estoque.
- Adicione estes 300 μL de contas concentradas à amostra (1 volume) e misture por vórtice. Incubar durante 10 minutos, girando à temperatura ambiente. Coloque em um ímã, aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede e remova o sobrenadante (contendo os fragmentos menores e os primers de PCR).
- Lave as contas três vezes com 1 mL de etanol 70%. Para fazer isso, adicione o etanol enquanto o tubo com as contas ainda está no ímã, tentando não perturbar as contas, e aguarde 30-60 s. Depois, retire o sobrenadante sem atrapalhar as contas.
- Deixe as contas secarem ao ar e ressuspenda-as em 21 μL de tampão TLE por vórtice.
OBS: A secagem excessiva das contas pode reduzir o rendimento ao eluír o DNA. Procure ressuspendê-los em tampão TLE imediatamente após eles não estarem mais "brilhantes" do etanol. - Incubar a amostra durante 10 min a 37 °C num termobloco para retirar a biblioteca das contas. Coloque o tubo em um ímã e transfira o sobrenadante que contém a biblioteca para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL.
- Quantificar o tamanho e a concentração por eletroforese automatizada (ver Tabela de Materiais). O material Hi-C purificado pode ser armazenado a -20 °C por vários meses antes de prosseguir com o protocolo.
10. Captura de bibliotecas
- Trabalhar com 500-1.000 ng da biblioteca. Concentrar a biblioteca secando o DNA usando um concentrador a vácuo e ressuspendendo o material em 3,4 μL de água livre de nucleases.
- Adicione os seguintes bloqueadores do kit de enriquecimento de destino (consulte Tabela de Materiais) à amostra: 2,5 μL de Bloqueador 1, 2,5 μL de Bloqueador 2 e 0,6 μL de oligobloqueador personalizado para os adaptadores.
- Ressuspender completamente, transferir a solução para uma tira de PCR de 0,2 mL e incubar em um termociclador por 5 min a 95 °C, seguido de 5 min a 65 °C com uma tampa aquecida. Deixar o tubo incubado a 65 °C.
- Preparar a solução de hibridização combinando os seguintes reagentes do kit de enriquecimento alvo (ver Tabela de Materiais) por amostra (13 μL). Manter no banco à temperatura ambiente: 6,63 μL de Hyb 1, 0,27 μL de Hyb 2, 2,65 μL de Hyb 3 e 3,45 μL de Hyb 4.
- Diluir 0,5 μL do bloco de RNase do kit de enriquecimento alvo com 1,5 μL de água livre de nuclease por amostra. Descongelar 5 μL do RNA biotinilado por amostra no gelo e adicionar a ele os 2 μL do bloco de RNase diluído. Manter no banco à temperatura ambiente.
- Adicionar os 13 μL da solução de hibridização aos 7 μL do RNA biotinilado com RNase e misturar bem.
- Enquanto estiver no termociclador a 65 °C, transfira a solução de hibridização com o RNA biotinilado (20 μL) para a biblioteca bloqueada. Feche firmemente a tampa do tubo e incube no termociclador durante a noite a 65 °C.
NOTA: Para minimizar a evaporação da amostra (que pode levar à hibridização RNA-DNA subótima) ao realizar várias amostras ao mesmo tempo, use uma pipeta multicanal para transferir o RNA biotinilado para cada biblioteca ao mesmo tempo.
11. Pull-down de biotina e amplificação por PCR
- Transfira 50 μL de contas de estreptavidina T1 por amostra para um tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL, coloque-as em um ímã de tubo de 1,5 mL e aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede. Retire o sobrenadante, deixando as contas para trás. Lavar as contas três vezes com 200 μL do tampão de ligação do kit de enriquecimento alvo.
- Ressuspenda as esferas em 200 μL de buffer de ligação. Enquanto estiver no termociclador a 65 °C, transferir a amostra para as esferas de estreptavidina T1 ressuspensas e incubar por 30 min, girando à temperatura ambiente.
- Lave as contas com 200 μL do tampão de lavagem 1 do kit de enriquecimento alvo. Incubar durante 15 minutos, girando à temperatura ambiente. Lavar as contas três vezes com 200 μL do tampão de lavagem 2 do kit de enriquecimento alvo aquecido a 65 °C. Incubar durante 10 min a 65 °C num termobloco, agitando a 300 rpm entre as lavagens.
- Lavar as esferas com 200 μL de 1x tampão de restrição 2 e depois ressuspendê-las em 30 μL de 1x tampão de restrição 2.
- Misturar os seguintes reagentes para preparar a reação de PCR para amplificar a biblioteca: 30 μL de contas com a biblioteca, 150 μL de 2x PCR mastermix com enzima, 7,2 μL de primers F + R (25 μM cada; ver Tabela 2) e 112,8 μL de água livre de nucleases.
- Realizar a PCR com as seguintes condições (dividir a mistura de reagentes de PCR em reações de 50 μL): 98 °C por 40 s, seguido por quatro ciclos de 98 °C por 10 s, 65 °C por 30 s, 72 °C por 30 s e terminar com 72 °C por 10 min. Segure a 4 °C.
- Junte todas as reações de 50 μL da mesma amostra em um tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL, coloque-o em um ímã de tubo de 1,5 mL e aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede.
- Transfira o sobrenadante que contém a biblioteca (300 μL) para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL. Completar com tampão TLE para 300 μL se algum sobrenadante foi perdido. As contas de estreptavidina T1 não são mais necessárias.
- Realizar uma purificação de DNA usando esferas paramagnéticas (0,9 volumes; ver Tabela de Materiais). Adicionar 270 μL de contas de caldo à amostra e misturar por vórtice.
- Incubar durante 10 minutos, girando à temperatura ambiente.
- Coloque em um ímã, aguarde 2-3 min ou até que todas as contas estejam presas à parede e remova o sobrenadante.
- Lave as contas três vezes com 1 mL de etanol 70%. Para fazer isso, adicione o etanol enquanto o tubo com as contas ainda está no ímã, tentando não perturbar as contas, e aguarde 30-60 s. Depois, retire o sobrenadante sem atrapalhar as contas.
- Deixe as contas secarem ao ar e ressuspenda-as em 21 μL de tampão TLE por vórtice.
OBS: A secagem excessiva das contas pode reduzir o rendimento ao eluír o DNA. Procure ressuspendê-los em tampão TLE imediatamente após eles não estarem mais "brilhantes" do etanol. - Incubar a amostra durante 10 min a 37 °C num termobloco para retirar a biblioteca das contas.
- Coloque o tubo em um ímã e transfira o sobrenadante que contém a biblioteca para um novo tubo de baixa ligação de DNA de 1,5 mL.
- Quantificar o tamanho e a concentração por eletroforese automatizada.
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Representative Results
O liCHi-C oferece a possibilidade de gerar bibliotecas de interatoma promotor genômico de alta qualidade e resolução com apenas 50.000 células53. Isso é conseguido por – além da redução drástica dos volumes de reação e do uso de plástico de baixa ligação de DNA em todo o protocolo – removendo etapas desnecessárias do protocolo original, nas quais ocorrem perdas significativas de material. Estes incluem a purificação de fenol após a desreticulação, a remoção de biotina e subsequente purificação de fenol-clorofórmio e precipitação de etanol. Além disso, reorganizar as etapas de preparação da biblioteca Hi-C (pulldown de biotina, cauda A, ligadura do adaptador, amplificação por PCR e seleção de esferas paramagnéticas de dupla face - também como purificação do produto de PCR) nos permite remover mais uma etapa desnecessária de purificação do DNA. Uma visão geral do fluxo de trabalho experimental pode ser encontrada na Figura 1A.
Para avaliar a qualidade da biblioteca, vários controles ao longo do protocolo são realizados, o primeiro dos quais é o cálculo da eficiência da digestão do genoma; valores acima de 80% são considerados aceitáveis (Tabela 3). Sugere-se verificar a eficiência da digestão do tipo celular em um experimento separado para não perder uma quantidade significativa de material de um único experimento de liCHi-C. Em segundo lugar, antes da sonicação e do reparo final, recomenda-se verificar a sensibilidade da detecção de interação amplificando interações de cromatina invariante do tipo celular por PCR convencional (Figura 1B). Caso o produto específico seja detectado, um terceiro controle deve ser realizado, com foco na eficiência da biotinilação e ligadura por meio da digestão diferencial de um dos produtos de PCR previamente obtidos com HindIII e NheI (Figura 1C,D). Ao preencher um local de restrição HindIII digerido e ligá-lo com outro, um novo local de restrição de NheI é gerado em vez de regenerar o local de restrição HindIII original. Portanto, a digestão do amplicon da PCR só deve ser observada quando NheI está presente. Finalmente, imediatamente antes e após toda a captura, a concentração e a distribuição de tamanho devem ser verificadas por eletroforese automatizada. A amplificação da biblioteca pré-captura deve ter como objetivo obter 500-1.000 ng de material Hi-C, a quantidade exata necessária para realizar a captura da sonda de RNA, uma vez que a amplificação excessiva da biblioteca pré e pós-capturada leva a uma alta porcentagem de duplicatas de PCR e à consequente perda de leituras de sequenciamento durante a análise. As bibliotecas podem ser reamplificadas novamente nas mesmas condições se não for obtido material suficiente durante a primeira amplificação conservadora por PCR. A quantidade de material da biblioteca pós-capturado pode variar, mas, como regra geral, deve ser aproximadamente dez a 20 vezes menor do que antes da captura. A distribuição de tamanho da biblioteca deve cair em torno de 450-550 pb (Figura 2A,B), invariável entre bibliotecas pré e pós-capturadas. Coletivamente, os resultados corretos desses controles garantem a geração de excelentes bibliotecas liCHi-C.
As bibliotecas liCHi-C concluídas são então (pelo menos) 100 pb emparelhadas e analisadas. Os dados brutos de sequenciamento53 são processados usando o pipeline HiCUP56 para mapear e filtrar artefatos. O relatório HiCUP ideal mostra um aumento de cinco a dez vezes na distribuição de cis (dentro do mesmo cromossomo) em comparação com leituras trans (entre cromossomos diferentes) pareadas, como descrito anteriormente de acordo com a ligadura intra-núcleo Hi-C57 (Figura 3B). A obtenção de mais de 100 milhões de leituras únicas válidas após a remoção das duplicatas de PCR é suficiente para prosseguir para a etapa seguinte da análise (Figura 3B), que é avaliar a eficiência da captura. Leituras pareadas em que nenhuma de suas extremidades é mapeada em um fragmento de restrição capturado pelo sistema de enriquecimento de sonda de RNA, são descartadas, mantendo-se apenas aquelas que representam o interatoma promotor da célula (ou seja, aquelas leituras em que pelo menos uma de suas extremidades mapeia em fragmentos de restrição contendo um ou mais promotores gênicos [Figura 3C], idealmente mais de 60%).
Finalmente, interações significativas são chamadas com o pipeline CHiCAGO, conforme descrito em58,59. Duas ou mais réplicas biológicas são necessárias para o conjunto final de interações promotoras significativas. A qualidade dos dados também pode ser validada usando análise de componentes principais (PCA), uma vez que as réplicas biológicas devem se agrupar e os tipos celulares devem ser separados. Por exemplo, analisando conjuntos de dados de liCHi-C de quatro diferentes tipos de células primárias da árvore hematopoiética humana (progenitores mieloides comuns, monócitos, megacariócitos e eritroblastos), podemos observar em uma ACP que as bibliotecas liCHi-C se agrupam de forma a refletir a trajetória de desenvolvimento (Figura 3D). Um exame mais detalhado das interações significativas detectadas para os quatro tipos celulares revela que os interactomos promotores são específicos e dinâmicos durante o desenvolvimento celular. Por exemplo, o gene AHSP, uma chaperona chave sintetizada em precursores eritroides que supervisiona o enovelamento correto da hemoglobina60,61,62, mostra um ganho de interações com elementos reguladores potencialmente ativos (i.e., regiões enriquecidas com H3K27ac e H3K4me1) em eritroblastos, mas não em outros tipos celulares (Figura 4). Isso demonstra que o método liCHi-C pode revelar potenciais interações regulatórias em tipos celulares raros.
Figura 1: Visão geral do protocolo e controles de qualidade da amostra antes da sonicação . (A) Visão geral esquemática do protocolo liCHi-C dividida por dias. As mãos B e azul representam, respectivamente, moléculas de biotina e etapas nas quais se pode parar o protocolo com segurança por um grande período de tempo. (B) Resultados representativos dos controles de interação 3C. Ambos os conjuntos de interação para humano (esquerda) e mouse (direita) são mostrados. As faixas esperadas são marcadas em azul escuro, enquanto uma faixa inespecífica é marcada em azul claro. (C) Controles representativos de preenchimento e ligadura usando o par de primers de interação humana "Dekker". A faixa é cortada apenas nas faixas 2 e 3, onde NheI é adicionado. (D) Representação esquemática da geração de um novo sítio de restrição de NheI durante o preenchimento e ligadura de um sítio de restrição HindIII. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Perfis de eletroforese automatizados representativos de bibliotecas pré e pós-captura. (A) Perfil de eletroforese automatizado de uma biblioteca imediatamente antes da captura. A quantidade total de DNA obtida é de 994 ng (49,7 ng/μL em 20 μL). (B) Perfil de eletroforese automatizada de alta sensibilidade a partir de uma biblioteca liCHi-C acabada. A amostra é carregada semi-diluída para preservar o máximo de material possível. A quantidade total de DNA obtida é de 61,2 ng (1,53 ng/μL em 20 μL x2 para explicar a diluição). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Saída representativa do pipeline HiCUP e clustering de replicação de amostra por PCA . (A) Classificação da validade dos pares de leitura por porcentagens e contagens totais. Pares de leitura inválidos são subclassificados pelo tipo de artefato experimental. (B) Porcentagens de eliminação de duplicação e classificação dos tipos de interação. As interações Cis são subclassificadas em cis-close (menos de 10 kb) e cis-far (mais de 10 kb). (C) Percentual de eficiência de captura. Os pares de leitura capturados são subclassificados se uma extremidade, outra ou ambas contêm um ou mais promotores. (D) Análise de componentes principais de escores significativos de interação CHiCAGO de ambas as réplicas de bibliotecas liCHi-C de progenitores mieloides comuns (CMP), eritroblastos, megacariócitos e monócitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Paisagem de interação AHSP em células hematopoéticas humanas primárias. Exemplo representativo da paisagem de interação centrada no promotor AHSP em progenitores mieloides comuns (CMP), eritroblastos (Ery), megacariócitos (MK) e monócitos (Mon), como visto no WashU Epigenome Browser63. Arcos representam interações significativas. O tom azul escuro mostra o promotor do gene AHSP , enquanto os tons azuis claros se sobrepõem a potenciais elementos regulatórios ativos que interagem especificamente com o promotor AHSP em eritroblastos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Composição e preparação do tampão. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Primers de PCR e sequências adaptadoras. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: Exemplo do cálculo para a eficiência de digestão. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
O liCHi-C oferece a capacidade de gerar bibliotecas de interatoma promotor de alta resolução usando uma estrutura experimental semelhante à da PCHi-C, mas com um número de células muito reduzido. Isso é muito conseguido eliminando etapas desnecessárias, como purificação de fenol e remoção de biotina. No protocolo clássico de ligadura intranúcleo Hi-C57 e sua subsequente técnica derivada PCHi-C, a biotina é removida de fragmentos de restrição não ligados para evitar puxar para baixo fragmentos de DNA que são posteriormente desinformativos. Pular essa parte e sua subsequente purificação de DNA não se traduz em uma redução significativa na porcentagem de leituras válidas (Figura 3A) enquanto corta as etapas potenciais de perda de DNA, que são purificações de DNA. A reorganização da preparação da biblioteca Hi-C após a sonicação permite pular mais uma purificação desnecessária usando a seleção de dupla face como a própria etapa de purificação. Tudo isso melhora o desempenho de todo o protocolo, empregando trocas mínimas de tubo e, juntamente com a redução no volume de reação, mudanças na concentração de reagentes e o uso de plásticos de baixa ligação de DNA, é o que permite a geração de bibliotecas de alta qualidade usando apenas 50.000 células. É importante ter em mente que o número de célula inicial determina, em parte, o número de interações significativas devido à complexidade da biblioteca. Embora bibliotecas geradas com 50.000 células retenham as características topológicas específicas e invariantes do tipo celular de bibliotecas mais complexas53, nossa recomendação é usar, se possível, mais de 100.000 células por réplica biológica para capturar um número maior de interações promotoras significativas.
A resolução das interações detectadas nas técnicas de 3C é essencialmente dada pela enzima de restrição utilizada. Aqui, a aplicação de liCHi-C é descrita usando HindIII, uma enzima de corte de 6 pb que fornece uma resolução média teórica de 4.096 pb. O liCHi-C permite que a enzima de restrição seja substituída, por exemplo, por uma enzima de corte de 4 pb ou mesmo uma nuclease microcócica, aumentando assim a resolução das interações significativas detectadas. A geração de bibliotecas liCHi-C, trocando a enzima de restrição HindIII pela enzima MboI de corte de 4 pb, tem sido relatada como fornecendo excelentes resultados detectando quase o dobro das interações totais, embora com o deslocamento da distância linear média das interações detectadas até metade da distância53.
Em relação ao atual sistema de enriquecimento de sonda de RNA, uma das principais vantagens do uso desse tipo de captura sobre um baseado em anticorpos, como HiChIP32 ou HiCuT33, entre outros, é a capacidade de comparar condições independentemente da ligação da proteína, além de não depender da disponibilidade de um anticorpo funcional para a proteína de interesse. Além disso, o sistema de enriquecimento de RNA pode ser adaptado para capturar quaisquer regiões específicas do genoma para atender às necessidades de cada investigador (o desenho é discutido em35,64).
Além dos métodos de captura baseados em anticorpos, vários métodos de célula única (como scHi-C65, Dip-C 66 ou Sci-Hi-C 67, entre outros) ou métodos de baixa entrada (como Low-C 68 ou Easy Hi-C 69) para investigar a arquitetura do genoma 3D foram desenvolvidos nos últimos anos. Entretanto, estes geram mapas de contato esparsos e de baixa resolução que não permitem a identificação de contatos entre elementos regulatórios distais e genes-alvo. O liCHi-C é um método capaz de superar essa limitação, abrindo a possibilidade de estudar a arquitetura do genoma centrado no promotor em tipos celulares escassos e proporcionando a oportunidade de avançar na compreensão da biologia celular e do desenvolvimento e do desenvolvimento de doenças.
Apesar de todas as suas características, o liCHi-C não está isento de limitações. Primeiro, o processamento dos dados brutos de sequenciamento não é trivial, e habilidades computacionais justas são necessárias para analisar os dados e interpretar seus resultados. Além disso, o liCHi-C não discrimina entre interações funcionais e estruturais; é necessário que os dados do liCHi-C sejam integrados com dados epigenéticos e/ou análises funcionais para validar as potenciais interações funcionais dos promotores gênicos com seus elementos regulatórios alvo. Por fim, a complexidade da biblioteca é sacrificada ao trabalhar na extremidade inferior dos números de célula. Isso se reflete na quantidade de interações únicas detectadas em comparação com bibliotecas liCHi-C de número de células mais alto e sua taxa de deduplicação, que pode chegar a até 80%. No entanto, bibliotecas liCHi-C de baixo número de células mantêm as características topológicas de bibliotecas de maior número de células de maneira mais focal53, demonstrando que é viável realizar bibliotecas liCHi-C que recapitulam o interactoma promotor da célula com apenas 50.000 células.
Em geral, o liCHi-C é um método econômico e personalizável para gerar bibliotecas de interatoma promotor de alta qualidade e alta resolução em tipos de células escassas. É o primeiro método de baixa entrada para mapear o interatoma promotor e chamar loops significativos na resolução do fragmento de restrição. Prevemos que esta nova ferramenta, como sua antecessora PCHi-C, fornecerá novos insights sobre a diferenciação celular e o desenvolvimento de organismos, tanto na saúde quanto na doença.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao resto dos membros do laboratório Javierre por seu feedback sobre o manuscrito. Agradecemos ao Programa CERCA, à Generalitat de Catalunya e à Fundação Josep Carreras pelo apoio institucional. Este trabalho foi financiado pelo FEDER/Ministério da Ciência e Inovação da Espanha (RTI2018-094788-A-I00), pela Associação Europeia de Hematologia (4823998) e pela Associação Espanhola contra o Câncer (AECC) LABAE21981JAVI. O BMJ é financiado pelo projeto Líder Júnior da Fundação Bancária La Caixa (LCF/BQ/PI19/11690001), o LR é financiado por uma bolsa AGAUR FI (2019FI-B00017) e o LT-D é financiado por uma bolsa FPI (PRE2019-088005). Agradecemos ao programa de doutorado em bioquímica e biologia molecular da Universitat Autònoma de Barcelona pelo apoio. Nenhum dos financiadores esteve envolvido em nenhum momento do desenho experimental ou da redação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mM Biotin-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | |
| 10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| 20 mg/mL Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9000S | |
| 5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
| 5PRIME Phase Lock Gel Light tubes | Qiuantabio | 2302820 | For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube |
| Adapters and PCR primers for library amplification | Integrated DNA Technologies | - | Bought as individual primers with PAGE purification for NGS |
| Cell scrappers | Nunc | 179693 | Or any other brand |
| Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) | Any brand | ||
| CHiCAGO R package | 1.14.0 | ||
| CleanNGS beads | CleanNA | CNGS-0050 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | Or any other brand |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
| DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210L | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65002 | For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down) |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.321 | |
| FBS, qualified | Gibco | 10270-106 | Or any other brand |
| Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
| GlycoBlue Coprecipitant | Invitrogen | AM9515 | Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification) |
| HiCUP | 0.8.2 | ||
| HindIII, 100 U/µL | New England Biolabs | R0104T | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
| Klenow EXO- 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212L | |
| Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials | Covaris | 520045 | For sonication in section 6 (sonication) |
| NheI-HF, 100 U/µL | New England Biolabs | R3131M | |
| Nuclease-free molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| PCR primers for quality controls | Integrated DNA Technologies | - | |
| PCR strips and caps | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531L | For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
| Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit | Invitrogen | Q33230 | For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification) |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| rCutsmart buffer | New England Biolabs | B6004S | |
| RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | Or any other brand |
| SDS - Solution 10% for molecular biology | PanReac AppliChem | A0676 | |
| Sodium acetate pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
| SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | Custom designed mouse or human capture system, used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent Technologies | 5190-8645 | Used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter | Agilent Technologies | 931107 | Used for the capture |
| T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 15224025 | For ligation in section 3 (ligation and decrosslink) |
| T4 DNA ligase 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) |
| T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201L | |
| Tapestation 4200 instrument | Agilent Technologies | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
|
| Tapestation reagents | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
| Triton X-100 for molecular biology | PanReac AppliChem | A4975 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |
References
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