Summary
Экспрессия генов регулируется взаимодействием промоторов генов с дистальными регуляторными элементами. Здесь мы рассмотрим, как низкий входной захват Hi-C (liCHi-C) позволяет идентифицировать эти взаимодействия в редких типах клеток, которые ранее не поддавались измерению.
Abstract
Пространственно-временная транскрипция генов жестко регулируется дистальными регуляторными элементами, такими как энхансеры и глушители, которые полагаются на физическую близость к своим целевым промоторам генов для контроля транскрипции. Хотя эти регуляторные элементы легко идентифицировать, их гены-мишени трудно предсказать, поскольку большинство из них специфичны для клеточного типа и могут быть разделены сотнями килобаз в линейной последовательности генома, пропуская другие нецелевые гены. В течение нескольких лет Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) был золотым стандартом ассоциации дистальных регуляторных элементов с их генами-мишенями. Тем не менее, PCHi-C полагается на наличие миллионов клеток, что запрещает изучение редких клеточных популяций, таких как те, которые обычно получают из первичных тканей. Чтобы преодолеть это ограничение, был разработан низковходной захват Hi-C (liCHi-C), экономически эффективный и настраиваемый метод идентификации репертуара дистальных регуляторных элементов, контролирующих каждый ген генома. liCHi-C опирается на аналогичную экспериментальную и вычислительную структуру, что и PCHi-C, но, используя минимальные изменения трубок, изменяя концентрацию и объемы реагентов, а также заменяя или устраняя шаги, он учитывает минимальные потери материала при строительстве библиотеки. В совокупности liCHi-C позволяет изучать регуляцию генов и пространственно-временную организацию генома в контексте биологии развития и клеточной функции.
Introduction
Временная экспрессия генов стимулирует дифференцировку клеток и, в конечном счете, развитие организма, и ее изменение тесно связано с широким спектром заболеваний 1,2,3,4,5. Транскрипция генов тонко регулируется действием регуляторных элементов, которые можно классифицировать как проксимальные (т.е. промоторы генов) и дистальные (например, энхансеры или глушители), последние из которых часто расположены далеко от своих генов-мишеней и физически взаимодействуют с ними посредством петли хроматина для модуляции экспрессии генов 6,7,8.
Идентификация дистальных регуляторных областей в геноме является широко согласованным вопросом, поскольку эти области содержат специфические модификации гистонов 9,10,11 и содержат специфические мотивы распознавания факторов транскрипции, выступая в качестве рекрутинговых платформ для них12,13,14. Кроме того, в случае энхансеров и суперэнхансеров 15,16 они также имеют низконуклеосомную занятость 17,18 и транскрибируются в некодирующие эРНК 19,20.
Тем не менее, гены-мишени каждого дистального регуляторного элемента труднее предсказать. Чаще всего взаимодействия между дистальными регуляторными элементами и их мишенями являются клеточными и специфическими для стимула 21,22, охватывают сотни килооснований, соединяя другие гены в любом направлении 23,24,25, и даже могут быть расположены внутри интронных областей их гена-мишени или других непромежуточных генов 26,27. Кроме того, дистальные регуляторные элементы также могут контролировать более одного гена одновременно, и наоборот28,29. Эта позиционная сложность препятствует выявлению регуляторных ассоциаций между ними, и, следовательно, большинство мишеней каждого регуляторного элемента в каждом типе клеток остаются неизвестными.
В последние годы наблюдается значительный бум в развитии методов захвата конформации хромосом (3C) для изучения хроматиновых взаимодействий. Наиболее широко используемый из них, Hi-C, позволяет создать карту всех взаимодействий между каждым фрагментом геномаклетки 30. Однако для обнаружения значимых взаимодействий на уровне рестрикционных фрагментов Hi-C полагается на сверхглубокое секвенирование, запрещая его использование для рутинного изучения регуляторного ландшафта отдельных генов. Чтобы преодолеть это экономическое ограничение, появилось несколько методов 3C на основе обогащения, таких как ChIA-PET31, HiChIP32 и его аналог HiCuT33 с низким энергопотреблением. Эти методы зависят от использования антител для обогащения полногеномных взаимодействий, опосредованных специфическим белком. Тем не менее, уникальная особенность этих методов 3C также является проклятием их применения; Пользователи рассчитывают на наличие высококачественных антител к интересующему белку и не могут сравнивать условия, в которых связывание белка является динамическим.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) — это еще один метод 3C на основе обогащения, который обходит эти ограничения34,35. Используя систему обогащения биотинилированного зонда РНК, PCHi-C может генерировать полногеномные библиотеки геномных областей с высоким разрешением, взаимодействующих с 28 650 промоторами генов, аннотированными человеком или 27 595 промоторами генов, также известными как промоторный интерактом. Такой подход позволяет выявлять значимые дальние взаимодействия при разрешении на уровне рестрикционных фрагментов как активных, так и неактивных промоторов, а также надежно сравнивать промоторные интерактомы между любыми условиями независимо от динамики модификаций гистонов или связывания с белками. PCHi-C широко используется в последние годы для идентификации промоторных интерактомных реорганизаций во время дифференцировкиклеток 36,37, идентификации механизма действия транскрипционных факторов38,39 и обнаружения новых потенциальных генов и путей, дерегулированных при заболевании некодирующими вариантами 40,41,42,43,44,45,46,47,48, наряду с мутациями нового драйвера, не кодирующими49,50. Кроме того, просто модифицируя систему захвата, этот метод может быть настроен в соответствии с биологическим вопросом для опроса любого интерактома (например, энхансерного интерактома 51 или интерактома набора некодирующих изменений41,52).
Тем не менее, PCHi-C полагается как минимум на 20 миллионов клеток для выполнения этого метода, что предотвращает изучение дефицитных клеточных популяций, таких как те, которые часто используются в биологии развития и клинических приложениях. По этой причине мы разработали Capture Hi-C с низким входом (liCHi-C), новый экономичный и настраиваемый метод, основанный на экспериментальной структуре PCHi-C для создания промоторных интерактомов высокого разрешения с низким входом клеток. Выполняя эксперимент с минимальными изменениями пробирок, заменяя или исключая этапы из исходного протокола PCHi-C, резко сокращая объемы реакции и изменяя концентрации реагентов, сложность библиотеки максимизируется, и можно создавать высококачественные библиотеки всего с 50 000 ячеек53.
Низковходной захват Hi-C (liCHi-C) был протестирован с PCHi-C и использовался для выяснения перенастройки промоторного интерактома во время дифференцировки гемопоэтических клеток человека, обнаружения потенциальных новых генов и путей, связанных с заболеванием, дерегулированных некодирующими изменениями, и выявления хромосомных аномалий53. Пошаговый протокол и различные элементы контроля качества с помощью этой техники подробно описаны здесь до окончательного создания библиотек и их вычислительного анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Чтобы обеспечить минимальные потери материала, (1) работайте с пробирками и наконечниками с низким связыванием ДНК (см. Таблицу материалов), (2) поместите реагенты на стенку пробирки вместо того, чтобы вводить наконечник внутрь образца и, (3) если возможно, смешайте образец путем инверсии вместо пипетирования образца вверх и вниз, а затем вращайте вниз, чтобы восстановить образец.
1. Фиксация клеток
- Клетки, растущие в суспензии
- Соберите от 50 000 до одного миллиона клеток и поместите их в пробирку объемом 1,5 мл с низким связыванием ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типы клеток, используемые для настоящего исследования, подробно описаны в разделе репрезентативных результатов. - Центрифугируют клетки в течение 5 мин при 600 x g (при 4 °C) с помощью центрифуги с фиксированным ротором и удаляют надосадочную жидкость пипеткой.
- Ресуспендируют клетки в 1 мл RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) при комнатной температуре.
- Добавьте 143 мкл 16% формальдегида, не содержащего метанола, чтобы достичь концентрации 2%, и перемешайте.
- Инкубируйте клетки в течение 10 минут, вращая при комнатной температуре, чтобы зафиксировать клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Постарайтесь быть как можно более точными при 10-минутной инкубации. Чрезмерная или недостаточная фиксация ячеек может привести к снижению качества библиотеки. - Погасите реакцию, добавив 164 мкл ледяного 1 М глицина, и перемешайте. Инкубируют ячейки в течение 5 мин, вращая при комнатной температуре.
- Далее инкубируют клетки в течение 15 мин на льду, перемешивая инверсией каждые ~5 мин.
- Центрифугируют клетки в течение 10 мин при 1000 x g (при 4 °C) с помощью центрифуги с фиксированным ротором и удаляют надосадочную жидкость.
- Промойте клетки, ресуспендировав гранулу в 1 мл ледяного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
- Центрифугируют клетки в течение 10 мин при 1000 x g (при 4 °C) и удаляют надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулированные ячейки могут быть заморожены в жидком азоте или сухом льду и храниться при -80 °C.
- Соберите от 50 000 до одного миллиона клеток и поместите их в пробирку объемом 1,5 мл с низким связыванием ДНК.
- Адгезивные клетки
- Вымойте клетки в чашке для культивирования с помощью 1x PBS.
- Приготовьте достаточное количество RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и 2% формальдегида без метанола при комнатной температуре, чтобы покрыть чашку с культурой.
- Добавьте добавленную среду в культуральную чашку с клетками и выдерживайте в течение 10 минут, покачивая при комнатной температуре, чтобы зафиксировать клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Постарайтесь быть как можно более точными при 10-минутной инкубации. Чрезмерная или недостаточная фиксация ячеек может привести к снижению качества библиотеки. - Погасите реакцию, добавив 1 М глицина до 0,125 М, и перемешайте, покачивая.
- Инкубируют ячейки в течение 5 мин, покачивая при комнатной температуре.
- Далее инкубируют клетки в течение 15 мин при 4 °С, перемешивая качанием каждые 3-4 мин.
- Извлеките носитель и промойте ячейки холодным 1x PBS.
- Соскребите клетки и перенесите их в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл. Протрите культуральную чашку 0,5-1 мл холодного 1x PBS.
- Центрифугируют клетки в течение 10 мин при 1000 x g (при 4 °C) с помощью центрифуги с фиксированным ротором и удаляют надосадочную жидкость. Гранулированные ячейки могут быть заморожены в жидком азоте или сухом льду и храниться при температуре -80 °C.
2. Лизис и пищеварение
- Ресуспендируют клетки в 1 мл буфера холодного лизиса (таблица 1), чтобы разрушить клеточную мембрану. Одного добавления буфера должно быть достаточно для ресуспендирования клеток, но при необходимости они могут быть дополнительно ресуспендированы с помощью легкого вихря.
- Инкубировать на льду в течение 30 мин, перемешивая инверсией каждые ~5 мин. Центрифугируют ядра в течение 10 мин при 1000 x g (при 4 °C) и удаляют надосадочную жидкость. Ресуспендируют ядра 500 мкл холодного 1,25-кратного ограничительного буфера 2 (см. Таблицу материалов).
- Центрифугируют ядра в течение 10 мин при 1000 x g (при 4 °C) и удаляют надосадочную жидкость. Ресуспендировать ядра в 179 мкл 1,25-кратного рестрикционного буфера 2.
- Добавьте 5,5 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS; см. Таблицу материалов) и перемешайте. Клетки могут образовывать сгустки; Это нормально и должно быть максимально дезагрегировано путем вихря. Инкубировать образец в течение 1 ч при 37 °C в термоблоке, встряхивая при 950 об/мин.
- Погасите SDS, добавив 37,5 мкл 10% Triton X-100 и перемешайте. Инкубировать образец в течение 1 ч при 37 °C в термоблоке, встряхивая при 950 об/мин.
- Расщепите хроматин, добавив 7,5 мкл HindIII (100 ЕД / мкл; см. Таблицу материалов) и перемешайте. Инкубируйте образец в течение ночи при температуре 37 °C в термоблоке, встряхивая при 950 об/мин.
- На следующее утро добавьте дополнительные 2,5 мкл HindIII (100 ЕД/мкл) и далее инкубируйте образец в течение 1 часа при 37 ° C в термоблоке, встряхивая при 950 об/мин, чтобы обеспечить правильное переваривание хроматина.
ПРИМЕЧАНИЕ: В рамках контроля эффективности сбраживания (см. этап 5.1) перенесите эквивалент от 20 000 до 40 000 ядер в другую пробирку, чтобы представить непереваренный контроль. После переваривания снова перенесите то же количество клеток в другую трубку, чтобы представить переваренный контроль. Рекомендуется проверить эффективность сбраживания в качестве отдельного эксперимента, если доступность исходного материала недостаточна.
3. Лигирование и декросслинкинг
- Охладите образец на льду. Приготовьте мастермикс и добавьте следующие реагенты для заполнения и биотинилирования выступов рестрикционного фрагмента: 3 мкл 10-кратного рестрикционного буфера 2, 1 мкл безнуклеазной воды, 0,75 мкл 10 мМ дХТФ, 0,75 мкл 10 мМ дТТП, 0,75 мкл 10 мМ дГТФ, 18,75 мкл 0,4 мМ биотин-14-дАТФ и 5 мкл 5 ЕД/мкл Кленоу (см. Таблицу материалов). Инкубируют образец в течение 75 мин при 37 °C, перемешивая инверсией каждые ~15 мин.
- Охладите образец на льду. Приготовьте мастермикс и добавьте следующие реагенты для перевязки заполненных концов ДНК: 50 мкл 10-кратного лигирующего буфера, 2,5 мкл 20 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 12,5 мкл 1 ЕД/мкл ДНК-лигазы T4 и 173 мкл безнуклеазной воды (см. Таблицу материалов).
- Инкубируют образец в течение 4-6 ч при 16 °C, перемешивая инверсией каждые ~1 ч. Далее инкубируют образец в течение 30 мин при комнатной температуре. Декросслинкуйте хроматин, добавив 30 мкл протеиназы К 10 мг/мл и перемешайте. Инкубируйте образец в течение ночи при температуре 65 °C.
- На следующее утро добавьте дополнительные 15 мкл 10 мг/мл протеиназы К и продолжайте инкубацию образца в течение 2 ч при 65 ° C, чтобы обеспечить надлежащую деслинковку хроматина.
4. Очистка ДНК
- Охладите образец до комнатной температуры и перенесите его в подходящую пробирку для очистки фенол-хлороформом.
- Добавьте 1 объем (545 мкл) фенола:хлороформ:изоамилового спирта (25:24:1) для очистки ДНК и перемешайте, энергично встряхивая.
- Центрифугируют образец в течение 5 мин при 12 000 x g при комнатной температуре и переносят верхнюю водную фазу (545 мкл) в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 2 мл.
- Добавьте следующие реагенты для осаждения ДНК: 1 362,5 мкл 100% этанола, охлажденного до -20 ° C, 54,5 мкл 3 М ацетата натрия (pH 5,2) и 2 мкл 15 мг / мл гликогена в качестве соосаждителя.
- Инкубировать в течение 1 ч при -80 °C или в течение ночи при -20 °C.
- Центрифугируют образец в течение 30 мин при 16 000-21 000 x g при 4 ° C и удаляют надосадочную жидкость. Гранула ДНК должна быть видна.
- Вымойте гранулы, добавив 1 мл 70% этанола, встряхните и центрифугируйте в течение 10 минут при 16 000-21 000 x g при комнатной температуре.
- Удалите надосадочную жидкость и дайте грануле высохнуть на воздухе. Ресуспендировать гранулу ДНК в 130 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
- Оцените концентрацию с помощью флуорометрического количественного определения (см. Таблицу материалов). Храните очищенный материал 3C при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев, прежде чем приступить к протоколу.
5. Дополнительный контроль качества
- Оцените эффективность пищеварения. Выполните декросслинкинг и очистку фенол:хлороформ ДНК, как описано ранее, до непереваренного и переваренного контроля, полученного на шаге 2.13. Ресуспендировать гранулу ДНК в 10 мкл воды, не содержащей нуклеаз. Количественно определите концентрацию и при необходимости разбавьте полученную ДНК до 4 нг/мкл.
- Проведите количественную ПЦР с 4 нг ДНК как непереваренной, так и переваренной контрольной группы, с праймерами, охватывающими открытый локус хроматина с мишенью HindIII и без нее (см. Таблицу 2 для дизайна праймера). Рассчитайте эффективность пищеварения в соответствии с ранее опубликованным отчетом35.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность лигирования рассчитывается в процентах по формуле: переваривание (%) = 100 -100/(2^[(Ct переваренный с HindIII - Ct переваренный без HindIII) - (Ct непереваренный с HindIII - Ct непереваренный без HindIII)]) (см. Таблицу 3), которая учитывает дифференциал различных Cts, полученных для каждой пары праймеров в непереваренном и переваренном контроле. - Оцените чувствительность обнаружения взаимодействия, выполнив обычную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (0,2 мМ dNTP, 0,4 мкм оба праймера F + R, 0,1 и U/мкл полимеразы горячего старта), при этом праймеры охватывают как дальние, так и ближние клеточно-инвариантные взаимодействия (см. Таблицу 2 для дизайна праймера). Используйте 50-100 нг материала 3C (для ближних и дальних взаимодействий соответственно) и усиливайте с использованием следующих условий: 98 ° C в течение 15 мин, затем 37 циклов 98 ° C в течение 30 с, 60 ° C в течение 1 мин, 72 ° C в течение 1 мин и заканчивайте 72 ° C в течение 10 мин. Хранить при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если полученное количество ДНК составляет менее 2 мкг, проверяйте только дальнее и ближнее взаимодействие, а не всю панель взаимодействия. - Запустите продукт на 1x трис-борат-ЭДТА (TBE) с использованием 1,6% агарозного геля и найдите наличие соответствующего ампликонаПЦР 54.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за непредсказуемого «вырезания и вставки» генома могут появиться неспецифические полосы. До тех пор, пока соблюдается правильный размер полосы, он считается правильным. - Оцените эффективность заполнения и лигирования биотина путем дифференциального переваривания продукта ПЦР ближнего действия с HindIII, NheI (см. Таблицу материалов), обоими ферментами или без них (вода) и запуска продукта на 1x 1,6% агарозном геле TBE. Правильное заполнение и лигирование устраняют предыдущую мишень HindIII и создают новую мишень NheI, поэтому ампликон следует разрезать только в присутствии NheI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму потери материала, извлеките 2,5 мкл продукта ПЦР ближнего действия из средств контроля взаимодействия и повторно амплифицируйте его пять раз для выполнения контроля заполнения и лигирования.
6. Обработка ультразвуком
- Перенесите 130 мкл образца (долейте воду без нуклеазы, если некоторые из них использовались для контроля) в кювету, подходящую для обработки ультразвуком.
- Настройте ультразвуковой аппарат на водяной бане и ультразвук с использованием следующих параметров (оптимизированных для модели и кювет, описанных в Таблице материалов): Коэффициент заполнения: 20%; Мощность пикового падения: 50; циклов на серию: 200; время: 65 с; и диапазон температур: 6-10 °C (оптимально 8 °C).
- Перенесите образец в новую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл.
7. Конечный ремонт
- Подготовьте мастер-микс и добавьте следующие реагенты для восстановления неровных концов фрагментов ДНК, созданных во время обработки ультразвуком: 18 мкл 10-кратного лигирующего буфера, 18 мкл смеси 2,5 мМ dNTP каждый, 6,5 мкл 3 ЕД / мкл ДНК-полимеразы T4, 6,5 мкл 10 ЕД / мкл T4 PNK и 1,3 мкл 5 ЕД / мкл Кленова (см. Таблицу материалов).
- Инкубируйте образец в течение 30 минут при 20 ° C и долейте буфер с низким содержанием ЭДТА (TLE) (см. Таблицу 1) до 300 мкл.
8. Вытягивание биотина
- Перенесите 150 мкл шариков стрептавидина C1 (см. Таблицу материалов) на образец в пробирку объемом 1,5 мл, поместите их на магнит для пробирки объемом 1,5 мл и подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стене. Удалите надосадочную жидкость, оставив бусины.
- Промойте шарики 400 мкл 1x буфера для анимации (TB; см. Таблицу 1). Чтобы промыть бусины, добавьте буфер и ресуспендируйте их мягким вихрением. Поместите трубку обратно в магнит и подождите 2-3 минуты или пока все бусины не прилипнут к стене. Удалите надосадочную жидкость, оставив бусины.
- Промойте шарики 300 мкл 1x без буфера анимации (NTB; см. Таблицу 1). Ресуспендировать шарики в 300 мкл 2x NTB (см. Таблицу 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Шарики могут образовывать пыльный слой вокруг стенки трубки при стирке буферами без моющего средства. Это нормально и не влияет на результат протокола. - Объедините эти 300 мкл шариков в 2x NTB с 300 мкл образца. Инкубировать в течение 15 минут, вращая при комнатной температуре, чтобы вытащить информативные фрагменты ДНК с биотином. Библиотека теперь привязана к бусинам стрептавидина C1.
- Вымойте шарики 400 мкл 1x NTB. Промойте шарики 100 мкл буфера TLE, а затем ресуспендируйте их в 35,7 мкл буфера TLE.
9. дАТФ-хвост, лигирование адаптера и амплификация ПЦР
- Приготовьте мастермикс и добавьте в образец следующие реагенты для dATP-хвоста концов восстановленных фрагментов ДНК: 5 мкл 10-кратного рестрикционного буфера 2, 2,3 мкл 10 мМ дАТФ и 7 мкл 5 ЕД/мкл экзо-экзо-белка Кленова. Инкубировать образец в течение 30 мин при 37 °C.
- Инактивируйте экзо- Klenow путем дальнейшей инкубации образца в течение 10 минут при 65 °C. Охладите пробу на льду. Вымойте шарики 300 мкл 1x TB. Вымойте шарики 300 мкл 1x NTB.
- Промойте шарики 100 мкл 1x лигирующего буфера, а затем ресуспендируйте их в 50 мкл 1x лигирующего буфера. Добавьте в образец 4 мкл предварительно отожженной переходной смеси 15 мкМ (см. Таблицу 2) и 1 мкл 2,000 ЕД/мкл ДНК-лигазы T4 (см. Таблицу материалов).
- Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре. Вымойте шарики 400 мкл 1x TB. Вымойте шарики 200 мкл 1x NTB. Промойте шарики 100 мкл 1x ограничительного буфера 2.
- Промойте шарики 50 мкл 1x ограничительного буфера 2, а затем ресуспендируйте их в 50 мкл 1x ограничительного буфера 2.
- Смешайте следующие реагенты для приготовления реакции ПЦР для амплификации библиотеки: 50 мкл шариков с библиотекой, 250 мкл 2x мастер-микса для ПЦР с ферментом, 12 мкл праймеров F + R (по 25 мкМ каждый; см. Таблицу 2) и 188 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
- Выполняйте ПЦР при следующих условиях (разделите смесь реагентов ПЦР на реакции по 50 мкл): 98 °C в течение 40 с, затем X циклы 98 °C в течение 10 с, 65 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с и закончите 72 °C в течение 10 мин. Хранить при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующее количество циклов в качестве отправной точки для оптимизации протокола в диплоидных клетках, стремясь к выходу 500-1,000 нг до захвата библиотеки: один миллион клеток в течение восьми циклов; 250 000 ячеек за 10 циклов; 50 000 ячеек за 12 циклов. - Объедините все реакции 50 мкл из одного и того же образца в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл, поместите ее на магнит для пробирки объемом 1,5 мл и подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стенке.
- Перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку (500 мкл), в новую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл. Долейте буфер TLE до 500 мкл, если часть надосадочной жидкости была потеряна. Шарики стрептавидина C1 больше не нужны.
- Выполняют двусторонний отбор55 с помощью парамагнитной очистки шариков (0,4-1 объем). Это позволяет селективно устранять слишком большие (>1000.н.) и слишком маленькие фрагменты или праймеры ПЦР (<200.н.), в зависимости от концентрации полиэтиленгликоля и соли добавленных парамагнитных шариков.
- Добавьте 200 мкл (0,4 объема) бусин в библиотеку и перемешайте вихревым способом. Инкубировать 10 мин, вращая при комнатной температуре.
- Поместите на магнит, подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стене, и перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку (без более крупных фрагментов), в новую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл.
- Сконцентрируйте шарики, взяв 750 мкл бусин, поместите их в пробирку объемом 1,5 мл на магните, подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стене, удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте бусины, встряхнув 300 мкл новых бусин.
- Добавьте эти 300 мкл концентрированных шариков в образец (1 объем) и перемешайте вихревым способом. Инкубировать 10 мин, вращая при комнатной температуре. Поместите на магнит, подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стене, и удалите надосадочную жидкость (содержащую более мелкие фрагменты и праймеры для ПЦР).
- Промойте шарики три раза 1 мл 70% этанола. Для этого добавьте этанол, пока трубка с шариками еще находится на магните, стараясь не потревожить шарики, и подождите 30-60 с. После этого удалите надосадочную жидкость, не нарушая бусины.
- Дайте шарикам высохнуть на воздухе и ресуспендируйте их в 21 мкл буфера TLE путем вихреобразования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная сушка шариков может снизить выход при элюировании ДНК. Стремитесь ресуспендировать их в буфере TLE сразу после того, как они перестанут быть «блестящими» от этанола. - Инкубируйте образец в течение 10 мин при 37 °C в термоблоке, чтобы разбавить библиотеку от шариков. Поместите пробирку в магнит и перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку, в новую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл.
- Количественно определите размер и концентрацию с помощью автоматизированного электрофореза (см. Таблицу материалов). Очищенный материал Hi-C можно хранить при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев, прежде чем приступить к протоколу.
10. Захват библиотеки
- Работа с 500-1,000 нг библиотеки. Сконцентрируйте библиотеку, высушив ДНК с помощью вакуумного концентратора и ресуспендировав материал в 3,4 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
- Добавьте в образец следующие блокираторы из целевого набора для обогащения (см. Таблицу материалов): 2,5 мкл блокиратора 1, 2,5 мкл блокиратора 2 и 0,6 мкл специального олигоблокатора для адаптеров.
- Тщательно ресуспендировать, перенести раствор в полоску для ПЦР объемом 0,2 мл и инкубировать в термоциклере в течение 5 мин при 95 °C, а затем 5 мин при 65 °C с нагретой крышкой. Оставьте пробирку инкубироваться при температуре 65 °C.
- Приготовьте раствор для гибридизации, комбинируя следующие реагенты из набора для целевого обогащения (см. Таблицу материалов) на образец (13 мкл). Хранить на столе при комнатной температуре: 6,63 мкл Hyb 1, 0,27 мкл Hyb 2, 2,65 мкл Hyb 3 и 3,45 мкл Hyb 4.
- Разбавьте 0,5 мкл блока РНКазы из набора для обогащения мишени 1,5 мкл воды, не содержащей нуклеаз, на образец. Разморозьте 5 мкл биотинилированной РНК на образец на льду и добавьте к нему 2 мкл разбавленного блока РНКазы. Держать на скамейке при комнатной температуре.
- Добавьте 13 мкл гибридизационного раствора к 7 мкл биотинилированной РНК с РНКазой и хорошо перемешайте.
- Находясь на термоциклере при 65 °C, перенесите гибридизационный раствор с биотинилированной РНК (20 мкл) в заблокированную библиотеку. Плотно закройте крышку тюбика и выдержите в термоциклере в течение ночи при температуре 65 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму испарение образца (которое может привести к субоптимальной гибридизации РНК-ДНК) при одновременном проведении нескольких образцов, используйте многоканальную пипетку для одновременного переноса биотинилированной РНК в каждую библиотеку.
11. Вытягивание биотина и ПЦР-амплификация
- Перенесите 50 мкл шариков стрептавидина Т1 на образец в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл, поместите их на магнит для пробирки объемом 1,5 мл и подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стене. Удалите надосадочную жидкость, оставив бусины. Трижды промойте шарики 200 мкл связующего буфера из набора для обогащения мишени.
- Ресуспендируют шарики в 200 мкл связывающего буфера. Находясь на термоциклере при 65 °C, перенесите образец в ресуспендированные гранулы стрептавидина T1 и инкубируйте в течение 30 мин, вращая при комнатной температуре.
- Вымойте шарики 200 мкл буфера для стирки 1 из целевого набора для обогащения. Инкубировать 15 мин, вращая при комнатной температуре. Трижды промойте шарики 200 мкл буфера для стирки 2 из набора для целевого обогащения, нагретого до 65 °C. Инкубировать в течение 10 мин при 65 °C в термоблоке, встряхивая при 300 об/мин между стирками.
- Промойте шарики 200 мкл 1x ограничительного буфера 2, а затем ресуспендируйте их в 30 мкл 1x ограничительного буфера 2.
- Смешайте следующие реагенты, чтобы приготовить реакцию ПЦР для амплификации библиотеки: 30 мкл шариков с библиотекой, 150 мкл 2x мастер-микса для ПЦР с ферментом, 7,2 мкл праймеров F + R (по 25 мкМ каждый; см. Таблицу 2) и 112,8 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
- Проведите ПЦР при следующих условиях (разделите смесь реагентов ПЦР на реакции по 50 мкл): 98 °C в течение 40 с, затем четыре цикла 98 °C в течение 10 с, 65 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с и закончите 72 °C в течение 10 мин. Хранить при температуре 4 °C.
- Объедините все реакции 50 мкл из одного и того же образца в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл, поместите ее на магнит для пробирки объемом 1,5 мл и подождите 2-3 минуты или пока все шарики не прилипнут к стенке.
- Перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку (300 мкл), в новую низкосвязывающую пробирку ДНК объемом 1,5 мл. Долейте буфер TLE до 300 мкл, если часть надосадочной жидкости была потеряна. Шарики стрептавидина Т1 больше не нужны.
- Проведите очистку ДНК с помощью парамагнитных шариков (0,9 объема; см. Таблицу материалов). Добавьте в образец 270 мкл бусин и перемешайте вихревым способом.
- Инкубировать 10 мин, вращая при комнатной температуре.
- Поместите на магнит, подождите 2-3 минуты или пока все бусины не прилипнут к стене, и удалите надосадочную жидкость.
- Промойте шарики три раза 1 мл 70% этанола. Для этого добавьте этанол, пока трубка с шариками еще находится на магните, стараясь не потревожить шарики, и подождите 30-60 с. После этого удалите надосадочную жидкость, не нарушая бусины.
- Дайте шарикам высохнуть на воздухе и ресуспендируйте их в 21 мкл буфера TLE путем вихреобразования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная сушка шариков может снизить выход при элюировании ДНК. Стремитесь ресуспендировать их в буфере TLE сразу после того, как они перестанут быть «блестящими» от этанола. - Инкубируйте образец в течение 10 мин при 37 °C в термоблоке, чтобы разбавить библиотеку от шариков.
- Поместите пробирку в магнит и перенесите надосадочную жидкость, содержащую библиотеку, в новую пробирку с низким связыванием ДНК объемом 1,5 мл.
- Количественно определите размер и концентрацию с помощью автоматизированного электрофореза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
liCHi-C предлагает возможность создания высококачественных библиотек промоторных интерактомов с разрешением всего лишь 50 000клеток53. Это достигается за счет - помимо резкого сокращения объемов реакции и использования пластиковой посуды с низким связыванием ДНК во всем протоколе - удаления ненужных шагов из исходного протокола, в которых происходят значительные материальные потери. К ним относятся очистка фенола после сшивания, удаление биотина, а также последующая очистка фенол-хлороформа и осаждение этанола. Кроме того, реорганизация этапов подготовки библиотеки Hi-C (вытягивание биотина, А-хвост, лигирование адаптера, амплификация ПЦР и двусторонний выбор парамагнитных шариков - также как очистка продукта ПЦР) позволяет нам удалить еще один ненужный этап очистки ДНК. Обзор экспериментального рабочего процесса приведен на рисунке 1A.
Для оценки качества библиотеки выполняется несколько проверок по всему протоколу, первым из которых является расчет эффективности переваривания генома; допустимыми считаются значения свыше 80% (табл. 3). Предлагается проверить эффективность переваривания клеточного типа в отдельном эксперименте, чтобы не потерять значительное количество материала из одного эксперимента liCHi-C. Во-вторых, перед ультразвуком и концевым ремонтом рекомендуется проверить чувствительность обнаружения взаимодействия путем усиления инвариантных хроматиновых взаимодействий клеточного типа с помощью обычной ПЦР (рис. 1B). Если обнаружен конкретный продукт, следует провести третий контроль, сосредоточив внимание на эффективности биотинилирования и лигирования путем дифференциального переваривания одного из ранее полученных продуктов ПЦР с HindIII и NheI (рис. 1C, D). При заполнении переваренного рестрикционного сайта HindIII и перевязке его другим тупым концом генерируется новый рестрикционный сайт NheI вместо регенерации исходного сайта HindIII. Следовательно, переваривание ампликона ПЦР следует наблюдать только при наличии NheI. Наконец, непосредственно перед и после всего захвата следует проверить концентрацию и распределение по размерам с помощью автоматизированного электрофореза. Амплификация библиотеки перед захватом должна быть направлена на получение 500-1000 нг материала Hi-C, точного количества, необходимого для захвата зонда РНК, поскольку чрезмерная амплификация как до-, так и пост-захваченной библиотеки приводит к высокому проценту дубликатов ПЦР и, как следствие, потере считываний секвенирования во время анализа. Библиотеки могут быть повторно амплифицированы в тех же условиях, если во время первой консервативной ПЦР-амплификации получено недостаточно материала. Количество библиотечного материала после захвата может варьироваться, но, как правило, оно должно быть примерно в десять-20 раз меньше, чем до захвата. Распределение по размерам библиотеки должно составлять около 450-550.н. (рис. 2A, B), неизменно между библиотеками до и после захвата. В совокупности корректные результаты этих элементов управления обеспечивают генерацию превосходных библиотек liCHi-C.
Готовые библиотеки liCHi-C затем (по крайней мере) секвенируются и анализируются с парным концом 100.н. Необработанные данные53 секвенирования обрабатываются с использованием конвейера56 HiCUP для сопоставления и фильтрации артефактов. Идеальный отчет HiCUP показывает пятикратное-десятикратное увеличение распределения цис (внутри одной и той же хромосомы) по сравнению с транс (между разными хромосомами) парными концевыми чтениями, как описано ранее в соответствии с внутриядерным лигированием Hi-C57 (рис. 3B). Получения более 100 миллионов уникальных, действительных считываний после удаления дубликатов ПЦР достаточно, чтобы перейти к следующему этапу анализа (рис. 3B), который заключается в оценке эффективности захвата. Парные концевые чтения, в которых ни один из их концов не отображается в захваченный фрагмент рестрикции системой обогащения РНК-зонда, отбрасываются, оставляя только те, которые представляют промоторный интерактом клетки (т. е. те чтения, в которых по крайней мере один из их концов отображается в рестрикционные фрагменты, содержащие один или несколько промоторов генов [рис. 3C], в идеале более 60%).
Наконец, значимые взаимодействия называются с конвейером CHiCAGO, как описано в58,59. Две или более биологических репликации необходимы для окончательного набора значимых промоторных взаимодействий. Качество данных также может быть проверено с помощью анализа главных компонент (PCA), поскольку биологические реплики должны группироваться вместе, а типы клеток должны быть разделены. Например, анализируя наборы данных liCHi-C из четырех различных типов первичных клеток из гемопоэтического дерева человека (общие миелоидные предшественники, моноциты, мегакариоциты и эритробласты), мы можем наблюдать в PCA, что библиотеки liCHi-C группируются в соответствии с траекторией развития (рис. 3D). Более тщательное изучение значимых взаимодействий, обнаруженных для четырех типов клеток, показывает, что промоторные интерактомы специфичны для клеточного типа и динамичны во время развития клеток. Например, ген AHSP, ключевой шаперон, синтезируемый в эритроидных предшественниках, который контролирует правильное сворачивание гемоглобина60,61,62, показывает усиление взаимодействия с потенциально активными регуляторными элементами (т.е. областями, обогащенными H3K27ac и H3K4me1) в эритробластах, но не в других типах клеток (рис. 4). Это демонстрирует, что метод liCHi-C может выявить потенциальные регуляторные взаимодействия в редких типах клеток.
Рисунок 1: Обзор протокола и контроль качества образца перед ультразвуком . (A) Схематический обзор протокола liCHi-C, разделенный по дням. B и синие стрелки представляют, соответственно, молекулы биотина и этапы, на которых можно безопасно остановить протокол на большой промежуток времени. (B) Репрезентативные результаты контроля взаимодействия 3C. Показаны оба набора взаимодействий для человека (слева) и мыши (справа). Ожидаемые полосы отмечены темно-синим цветом, а неспецифическая полоса отмечена светло-синим цветом. (C) Репрезентативный контроль заполнения и лигирования с использованием пары грунтовок для взаимодействия с человеком «Деккер». Полоса разрезается только на полосах 2 и 3, где добавляется NheI. (D) Схематическое изображение генерации нового сайта рестрикции NheI во время заполнения и лигирования сайта рестрикции HindIII. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные автоматизированные профили электрофореза из библиотек до и после захвата . (A) Профиль автоматического электрофореза из библиотеки непосредственно перед захватом. Общее количество полученной ДНК составляет 994 нг (49,7 нг/мкл в 20 мкл). (B) Высокочувствительный автоматизированный профиль электрофореза из готовой библиотеки liCHi-C. Образец загружается полуразбавленным, чтобы сохранить как можно больше материала. Общее количество полученной ДНК составляет 61,2 нг (1,53 нг/мкл в 20 мкл x2 для учета разведения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные выходные данные конвейера HiCUP и кластеризация репликации выборки с помощью PCA . (A) Классификация достоверности считываемых пар по процентам и общему количеству. Недопустимые пары чтения подклассифицируются по типу экспериментального артефакта. (B) Процент дедупликации и классификация типов взаимодействия. Цис-взаимодействия далее подразделяются на цис-близкие (менее 10 кб) и цис-дальние (более 10 кб). (C) Процентная доля эффективности улавливания. Захваченные пары чтения далее подклассифицируются независимо от того, содержат ли один конец, другой или оба один или несколько промоторов. (D) Анализ главных компонент значимых оценок взаимодействия CHiCAGO из обеих репликаций библиотек liCHi-C из общих миелоидных предшественников (CMP), эритробластов, мегакариоцитов и моноцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Ландшафт взаимодействия AHSP в первичных кроветворных клетках человека. Репрезентативный пример ландшафта взаимодействия, ориентированного на промотор AHSP, в общих миелоидных предшественниках (CMP), эритробластах (Ery), мегакариоцитах (MK) и моноцитах (Mon), как показано в WashU Epigenome Browser63. Дуги представляют собой значимые взаимодействия. Темно-синий оттенок показывает промотор гена AHSP, в то время как светло-голубые оттенки перекрывают потенциальные активные регуляторные элементы, которые специфически взаимодействуют с промотором AHSP в эритробластах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Состав буфера и приготовление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: ПЦР-праймеры и последовательности адаптеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Пример расчета эффективности сбраживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
liCHi-C предлагает возможность создания библиотек промоторных интерактомов с высоким разрешением, используя аналогичную экспериментальную структуру PCHi-C, но со значительно уменьшенным числом клеток. Это в значительной степени достигается за счет устранения ненужных этапов, таких как очистка фенола и удаление биотина. В классическом внутриядерном лигировании Hi-C протокола57 и его последующем производном методе PCHi-C биотин удаляется из нелигированных рестрикционных фрагментов, чтобы избежать вытягивания фрагментов ДНК, которые впоследствии становятся неинформативными. Пропуск этой части и ее последующей очистки ДНК не приводит к значительному снижению процента действительных чтений (рис. 3A) при одновременном исключении потенциальных этапов истощения ДНК, которые являются очисткой ДНК. Реорганизация подготовки библиотеки Hi-C после обработки ультразвуком позволяет пропустить еще одну ненужную очистку, используя двусторонний выбор в качестве самого этапа очистки. Все это повышает производительность всего протокола за счет использования минимальных замен пробирок, и вместе с уменьшением объема реакции, изменениями концентрации реагентов и использованием пластиковой посуды с низким связыванием ДНК позволяет создавать высококачественные библиотеки с использованием всего 50 000 клеток. Важно иметь в виду, что начальный номер ячейки определяет, в частности, количество значимых взаимодействий из-за сложности библиотеки. Хотя библиотеки, сгенерированные с 50 000 клеток, сохраняют специфические и инвариантные топологические особенности более сложных библиотек53, мы рекомендуем использовать, если это возможно, более 100 000 клеток на биологическую реплику, чтобы захватить большее количество значимых промоторных взаимодействий.
Разрешение взаимодействий, обнаруженных в методах 3C, в основном определяется используемым ферментом рестрикции. Здесь применение liCHi-C описано с использованием HindIII, фермента, режущего 6.н., который дает теоретическое среднее разрешение 4,096.н. liCHi-C позволяет заменить фермент рестрикции, например, на фермент резки 4.н. или даже микрококковую нуклеазу, тем самым увеличивая разрешение обнаруженных значимых взаимодействий. Сообщается, что генерация библиотек liCHi-C, переключающая фермент рестрикции HindIII на фермент MboI, сокращающий 4.н., дает отличные результаты, обнаруживая почти вдвое больше общих взаимодействий, хотя и со смещением среднего линейного расстояния обнаруженных взаимодействий до половины расстояния53.
Что касается фактической системы обогащения РНК-зонда, одним из основных преимуществ использования этого типа захвата по сравнению с захватом на основе антител, таким как HiChIP32 или HiCuT33, среди прочих, является возможность сравнивать условия независимо от связывания белка, а также отсутствие необходимости полагаться на наличие рабочего антитела для интересующего белка. Кроме того, система обогащения РНК может быть адаптирована для захвата любых конкретных областей всего генома в соответствии с потребностями каждого исследователя (дизайн обсуждается в35,64).
В дополнение к методам захвата на основе антител в последние годы было разработано несколько выдающихся одноклеточных (таких как scHi-C65, Dip-C66 или Sci-Hi-C 67 и другие) или методов с низким уровнем ввода (таких как Low-C 68 или Easy Hi-C 69) для исследования архитектуры 3D-генома. Однако они генерируют разреженные карты контактов с низким разрешением, которые не позволяют идентифицировать контакты между дистальными регуляторными элементами и генами-мишенями. liCHi-C - это метод, который способен преодолеть это ограничение, открывая возможность изучения архитектуры генома, ориентированного на промотор, в дефицитных типах клеток и предоставляя возможность продвинуть наше понимание клеточной биологии и биологии развития и развития заболеваний.
Несмотря на все свои особенности, liCHi-C не освобождается от ограничений. Во-первых, обработка необработанных данных секвенирования не является тривиальной, и для анализа данных и интерпретации их результатов необходимы неплохие вычислительные навыки. Более того, liCHi-C не делает различий между функциональными и структурными взаимодействиями; необходимо, чтобы данные liCHi-C были интегрированы с эпигенетическими данными и/или функциональным анализом для проверки потенциальных функциональных взаимодействий промоторов генов с их целевыми регуляторными элементами. Наконец, сложность библиотеки приносится в жертву при работе с нижним концом номеров ячеек. Это отражается на количестве обнаруженных уникальных взаимодействий по сравнению с библиотеками liCHi-C с более высоким числом клеток и их скорости дедупликации, которая может достигать 80%. Тем не менее, библиотеки liCHi-C с низким числом ячеек сохраняют топологические особенности библиотек с большим числом клеток более фокусным образом 53, демонстрируя, что можно выполнять библиотеки liCHi-C, которые повторяют промоторный интерактом клетки всего с50 000 клеток.
В целом, liCHi-C — это экономичный и настраиваемый метод создания высококачественных библиотек промоторных интерактомов с высоким разрешением в дефицитных типах клеток. Это первый метод с малым вводом для отображения интерактома промотора и вызова значимых циклов при разрешении фрагмента ограничения. Мы предвидим, что этот новый инструмент, как и его предшественник PCHi-C, обеспечит новое понимание дифференцировки клеток и развития организма, как в отношении здоровья, так и в отношении болезней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Мы благодарим остальных сотрудников лаборатории Хавьера за отзыв о рукописи. Мы благодарим Программу CERCA, Женералитат Каталонии и Фонд Хосепа Каррераса за институциональную поддержку. Эта работа финансировалась FEDER/Министерством науки и инноваций Испании (RTI2018-094788-A-I00), Европейской гематологической ассоциацией (4823998) и Испанской ассоциацией по борьбе с раком (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ финансируется проектом «Младший лидер» La Caixa Banking Foundation (LCF/BQ/PI19/11690001), LR финансируется стипендией AGAUR FI (2019FI-B00017), а LT-D финансируется стипендией FPI (PRE2019-088005). Мы благодарим докторскую программу по биохимии и молекулярной биологии из Автономного университета Барселоны за поддержку. Ни один из спонсоров не участвовал ни в одном из этапов разработки эксперимента или написания рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mM Biotin-14-dATP | Invitrogen | 19524-016 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 1 M Tris pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | |
| 10x NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 10x T4 DNA ligase reaction buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free | Thermo Scientific | 28908 | |
| 20 mg/mL Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9000S | |
| 5 M NaCl | Invitrogen | AM9760G | |
| 5PRIME Phase Lock Gel Light tubes | Qiuantabio | 2302820 | For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube |
| Adapters and PCR primers for library amplification | Integrated DNA Technologies | - | Bought as individual primers with PAGE purification for NGS |
| Cell scrappers | Nunc | 179693 | Or any other brand |
| Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) | Any brand | ||
| CHiCAGO R package | 1.14.0 | ||
| CleanNGS beads | CleanNA | CNGS-0050 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Promega | U120A, U121A, U122A, U123A | Or any other brand |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| DNA LoBind tube, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
| DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL | New England Biolabs | M0210L | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads | Invitrogen | 65002 | For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down) |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads | Invitrogen | 65602 | For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| DynaMag-2 | Invitrogen | 12321D | Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.321 | |
| FBS, qualified | Gibco | 10270-106 | Or any other brand |
| Glycine | Fisher BioReagents | BP381-1 | |
| GlycoBlue Coprecipitant | Invitrogen | AM9515 | Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification) |
| HiCUP | 0.8.2 | ||
| HindIII, 100 U/µL | New England Biolabs | R0104T | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ML | |
| Klenow EXO- 5000 units/mL | New England Biolabs | M0212L | |
| Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) | ZeroTip | PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials | Covaris | 520045 | For sonication in section 6 (sonication) |
| NheI-HF, 100 U/µL | New England Biolabs | R3131M | |
| Nuclease-free molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| PCR primers for quality controls | Integrated DNA Technologies | - | |
| PCR strips and caps | Agilent Technologies | 410022, 401425 | |
| Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531L | For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) and 11 (biotin pull-down and PCR amplification) |
| Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR grade | Roche | 3115836001 | |
| Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit | Invitrogen | Q33230 | For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification) |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| rCutsmart buffer | New England Biolabs | B6004S | |
| RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | Or any other brand |
| SDS - Solution 10% for molecular biology | PanReac AppliChem | A0676 | |
| Sodium acetate pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899-100ML | |
| SureSelect custom 3-5.9 Mb library | Agilent Technologies | 5190-4831 | Custom designed mouse or human capture system, used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent Technologies | 5190-8645 | Used for the capture |
| SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter | Agilent Technologies | 931107 | Used for the capture |
| T4 DNA ligase 1 U/µL | Invitrogen | 15224025 | For ligation in section 3 (ligation and decrosslink) |
| T4 DNA ligase 2000000/mL | New England Biolabs | M0202T | For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification) |
| T4 DNA polymerase 3000 units/mL | New England Biolabs | M0203L | |
| T4 PNK 10000 units/mL | New England Biolabs | M0201L | |
| Tapestation 4200 instrument | Agilent Technologies | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
|
| Tapestation reagents | Agilent Technologies | 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, | For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid |
| Triton X-100 for molecular biology | PanReac AppliChem | A4975 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML |
References
- Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
- Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
- Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
- Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
- Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
- Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P.
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
- Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
- Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
- He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
- Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16 (2015).
- Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
- He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384 (2010).
- Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610 (2014).
- Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
- Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
- Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
- Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
- Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161 (2021).
- Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
- Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Fullwood, M. J., et al.
- Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
- Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121 (2022).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
- Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
- Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
- Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222 (2020).
- Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
- Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
- Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923 (2016).
- Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165 (2017).
- Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526 (2018).
- Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
- Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154 (2019).
- Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615 (2019).
- Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81 (2020).
- Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
- Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
- Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
- Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
- Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268 (2023).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923 (2012).
- Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86 (2019).
- Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310 (2015).
- Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175 (2015).
- Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127 (2016).
- Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
- Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
- Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
- Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859 (2011).
- Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
- Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
- Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
- Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924 (2018).
- Ramani, V., et al.
- Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938 (2018).
- Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).
