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Biology

Alineación de datos sincronizados de series temporales utilizando el modelo de caracterización de la pérdida de sincronía del ciclo celular para comparaciones entre experimentos

Published: June 9, 2023 doi: 10.3791/65466
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

Summary

Un desafío de analizar experimentos sincronizados de series de tiempo es que los experimentos a menudo difieren en la duración de la recuperación de la sincronía y el período del ciclo celular. Por lo tanto, las mediciones de diferentes experimentos no pueden analizarse en conjunto o compararse fácilmente. Aquí, describimos un método para alinear experimentos para permitir comparaciones específicas de fase.

Abstract

La investigación del ciclo celular a menudo depende de la sincronización de las poblaciones celulares para medir varios parámetros en una serie de tiempo a medida que las células atraviesan el ciclo celular. Sin embargo, incluso en condiciones similares, los experimentos replicados muestran diferencias en el tiempo requerido para recuperarse de la sincronía y atravesar el ciclo celular, evitando así las comparaciones directas en cada punto de tiempo. El problema de comparar mediciones dinámicas entre experimentos se exacerba en poblaciones mutantes o en condiciones de crecimiento alternativas que afectan el tiempo de recuperación de sincronía y / o el período del ciclo celular.

Hemos publicado previamente un modelo matemático paramétrico llamado Caracterización de la pérdida de sincronía del ciclo celular (CLOCCS) que monitorea cómo las poblaciones sincrónicas de células se liberan de la sincronía y progresan a través del ciclo celular. Los parámetros aprendidos del modelo se pueden usar para convertir puntos de tiempo experimentales de experimentos sincronizados de series temporales en una escala de tiempo normalizada (puntos de línea de vida). En lugar de representar el tiempo transcurrido en minutos desde el inicio del experimento, la escala de línea de vida representa la progresión desde la sincronía hasta la entrada del ciclo celular y luego a través de las fases del ciclo celular. Dado que los puntos de la línea de vida corresponden a la fase de la célula promedio dentro de la población sincronizada, esta escala de tiempo normalizada permite comparaciones directas entre experimentos, incluidos aquellos con períodos y tiempos de recuperación variables. Además, el modelo se ha utilizado para alinear experimentos de ciclo celular entre diferentes especies (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe), permitiendo así la comparación directa de las mediciones del ciclo celular, que pueden revelar similitudes y diferencias evolutivas.

Introduction

Las mediciones de series temporales realizadas en poblaciones sincronizadas de células a medida que progresan a través del ciclo celular es un método estándar para investigar los mecanismos que controlan la progresión del ciclo celular 1,2,3,4,5,6,7,8 . La capacidad de hacer comparaciones entre experimentos de series temporales de sincronía / lanzamiento es vital para nuestra comprensión de estos procesos dinámicos. El uso de experimentos replicados para corroborar los hallazgos puede aumentar la confianza en la reproducibilidad de las conclusiones. Además, las comparaciones entre las condiciones ambientales, entre mutantes e incluso entre especies pueden descubrir muchos nuevos conocimientos sobre la regulación del ciclo celular. Sin embargo, la variabilidad interexperimental en la recuperación de la sincronía y en la velocidad de la progresión del ciclo celular afecta la capacidad de hacer comparaciones de punto a punto de tiempo entre réplicas o entre experimentos con tiempo alterado del ciclo celular. Debido a estos desafíos, las réplicas a menudo no se incluyen para la serie de tiempo completo (por ejemplo, Spellman et al.4). Cuando se recopilan réplicas para toda la serie temporal, los datos no se pueden analizar en conjunto, sino que se utiliza una sola réplica para el análisis, y otras réplicas a menudo se relegan a cifras suplementarias (por ejemplo, Orlando et al.8). Además, las comparaciones entre experimentos con diferentes características de recuperación o progresión del ciclo celular son difíciles. Las mediciones de intervalos más pequeños entre un evento de interés y un punto de referencia del ciclo celular (por ejemplo, emergencia de brotes, entrada en fase S o inicio en anafase) pueden ayudar a reducir los errores si se realiza un seguimiento de estos eventos de referencia 1,2,3,9,10,11,12. Sin embargo, las diferencias sutiles pero importantes pueden permanecer sin ser detectadas u ocultas utilizando estos métodos ad hoc. Finalmente, los análisis de células individuales permiten analizar la progresión del ciclo celular sin depender de la sincronización o la alineación13, aunque las mediciones a gran escala en estudios de células individuales pueden ser desafiantes y costosas.

Para superar estas dificultades, desarrollamos el modelo Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) para ayudar al análisis de las mediciones de series temporales realizadas en poblaciones sincronizadas14,15. CLOCCS es un modelo matemático flexible que describe la distribución de células sincronizadas a través de las fases del ciclo celular a medida que se liberan de la sincronía y progresan a través del ciclo celular. El marco del proceso de ramificación permite que el modelo tenga en cuenta las cualidades asimétricas de las células madre e hija después de la división, como se observa en S. cerevisiae, sin dejar de ser útil para organismos que se dividen por fisión, como S. pombe. El modelo puede tomar entradas de un conjunto diverso de tipos de medición para especificar la fase del ciclo celular. Puede ingerir datos de fase del ciclo celular en ciernes, que incluyen mediciones del porcentaje de células gemadas a lo largo del tiempo, lo que permite la estimación del número de células fuera de la fase G1 no brotada14,15. El modelo también puede ingerir datos citométricos de flujo que miden el contenido de ADN, lo que permite la evaluación de transiciones históricas de G1 a S, S a G2 y M a G115. Los marcadores morfológicos fluorescentes también se pueden utilizar para identificar la fase del ciclo celular. El marcado fluorescente de los anillos, núcleos y cuerpos de polo fusiforme (SPB) de miosina se puede utilizar para determinar la fase del ciclo celular, y estos se incorporaron al modeloCLOCCS 11; Sin embargo, estas mediciones no se describirán en este protocolo. Además, el índice de septación se utilizó como entrada para modelar datos de S. pombe14. Por lo tanto, el modelo se puede utilizar para análisis del ciclo celular en una variedad de organismos y se puede ampliar aún más.

CLOCCS es un modelo paramétrico que permite la inferencia bayesiana completa de múltiples parámetros a partir de los datos de entrada (por ejemplo, porcentaje de gemación, contenido de ADN). Estos parámetros incluyen el tiempo de recuperación de la sincronía, la duración del período del ciclo celular (estimado por separado para las células madre e hija) y la posición promedio del ciclo celular de las células en cada punto de tiempo. Estos parámetros representan el comportamiento de la célula promedio en la población, lo que permite al investigador mapear cada punto de tiempo a una posición del ciclo celular expresada como un punto de línea de vida. La conversión a puntos de línea de vida depende de los parámetros lambda (λ) y mu0 (μ0)14,15 de CLOCCS. El parámetro λ corresponde al período promedio del ciclo celular de las células madre. Sin embargo, debido al retraso madre-hija14,15, este no es el período promedio del ciclo celular de toda la población que incluye tanto las células madre como hija. CLOCCS también infiere el parámetro delta (δ), que corresponde al retraso madre-hija y, por lo tanto, permite el cálculo del período promedio del ciclo celular de toda la población. Finalmente, debido a que cada experimento comienza después de la liberación de la sincronización del ciclo celular, el tiempo requerido para recuperarse del método de sincronización se representa mediante el parámetro CLOCCS μ0. CLOCCS ajusta un modelo a los datos de fase del ciclo celular de entrada y luego infiere estos parámetros utilizando un algoritmo de Monte Carlo de cadena de Markov aleatorio14,15. Al mapear múltiples experimentos a una escala de tiempo común de la línea de vida del ciclo celular, se pueden hacer comparaciones directas específicas de fase entre réplicas o experimentos donde el tiempo de recuperación o los períodos del ciclo celular no son idénticos 8,14,15.

Como las poblaciones sincronizadas pierden sincronía a cierto ritmo en el transcurso de la serie temporal14,15,16,17, la variabilidad en la tasa de pérdida de sincronía también puede impedir las comparaciones cuantitativas entre experimentos. Al identificar la ubicación de las poblaciones y la varianza en sus distribuciones, CLOCCS explica las diferencias en las tasas de pérdida de sincronía. Esta poderosa herramienta permite comparaciones específicas y detalladas entre experimentos, proporcionando así la capacidad de hacer directamente comparaciones relevantes no solo entre réplicas sino también entre condiciones ambientales, mutantes e incluso especies que tienen un tiempo de ciclo celular dramáticamente diferente14,15.

Este documento describe un método que utiliza CLOCCS para estimar parámetros ajustando datos de experimentos de series temporales de sincronía / liberación, mapear los datos a una escala de línea de vida común y luego hacer comparaciones relevantes entre réplicas o experimentos. La alineación de la línea de vida permite comparaciones directas específicas de fase a través de estos experimentos, lo que permite la agregación y comparación de réplicas y para hacer comparaciones más relevantes entre experimentos con diferentes tiempos de recuperación y períodos de ciclo celular.

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Protocol

1. Recopilación de datos experimentales y de fase del ciclo celular

  1. Sincronizar las células con respecto al ciclo celular utilizando el método de sincronización deseado (por ejemplo, elutriación centrífuga como se describe en Leman et al.18 o detención de feromonas de apareamiento como se describe en Rosebrock 19; tanto Leman et al.18 como Rosebrock19 también incluyen métodos para la liberación de la sincronía). Comience el muestreo a lo largo de la serie temporal, asegurándose de que la serie temporal tenga al menos dos períodos completos de ciclo celular de duración, y de manera óptima, recoja al menos 10 muestras por ciclo celular. En cada punto de tiempo, recoja una muestra para los datos de fase del ciclo celular (citometría de gemación o flujo) y una muestra para los datos experimentales, como se describe a continuación.
  2. Si utiliza datos de gemación como datos de fase del ciclo celular, recopile datos sobre gemación para la alineación de CLOCCS.
    1. Muestra a lo largo de la serie temporal. Para cada punto de tiempo, recolecte células y fíjelas mezclando 200 μL de cultivo celular sonicado con 200 μL de solución fijadora, como se describe en Leman et al.18.
    2. Para la gemación estándar, cuente al menos 200 células por punto de tiempo usando un microscopio de luz transmitida con un objetivo 40x y un hemocitómetro. Añadir la muestra de células del paso 1.2.1 al hemocitómetro y diluir si la densidad impide el recuento. Registre el número de celdas con y sin budds en cada punto de tiempo. Calcule el porcentaje de celdas en gemación y trace cada punto de tiempo en una curva en ciernes.
      NOTA: Hay disponibles otros métodos para especificar la información de fase del ciclo celular, pero no se describen en este protocolo. Los otros métodos se describen en el archivo léame de CLOCCS y en un trabajo anterior11.
  3. Si utiliza datos de contenido de ADN por citometría de flujo como datos de fase del ciclo celular, recopile datos de tinción de ADN de citometría de flujo para la alineación CLOCCS de citometría de flujo.
    1. Muestra a lo largo de la serie temporal. Para cada punto de tiempo, recopile celdas y corríjalas como se describe en Haase y Reed20.
    2. Manchar el ADN y analizar mediante el análisis citométrico de flujo estándar. Un protocolo de tinción recomendado para S. cerevisiae se describe en Haase y Reed20.
  4. Recopilar ómicas asociadas o datos experimentales relacionados. Para obtener datos transcriptómicos estándar, recopilar como se describe en Leman et al.18 y Kelliher et al.21,22. Asegúrese de que los datos estén asociados con puntos de tiempo que contengan datos de fase del ciclo celular para permitir la alineación posterior. Para una alineación óptima, asegúrese de que cada punto de tiempo que contenga datos experimentales también tenga datos de fase asociados.
    NOTA: Los datos experimentales pueden tomar muchas formas. Tradicionalmente, utilizamos el método de alineación descrito para alinear experimentos transcriptómicos de series temporales. Sin embargo, cualquier tipo de datos asociados con puntos de tiempo puede alinearse (es decir, proteómica22).

2. Instalación del software requerido

NOTA: En esta sección se supone que Conda, Java 19 y Git ya están instalados (tabla de materiales).

  1. Descargue el repositorio de CLOCCS_alignment introduciendo el siguiente comando en el terminal:
    Git Clone Git Clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. Cree un entorno de Conda utilizando el archivo conda_req.yml introduciendo el siguiente comando en el terminal en la carpeta donde se clonó el repositorio de CLOCCS_alignment:
    conda env create -f conda_req.yml

3. Uso de CLOCCS para parametrizar los experimentos

  1. Haga doble clic en el archivo cloccs_v2023.jar en la carpeta CLOCCS en el repositorio de CLOCCS_alignment y espere a que se abra una interfaz gráfica de usuario. Esta pantalla permite ingresar opciones para la ejecución de CLOCCS y muestra los resultados una vez ejecutada.
  2. Introduzca la configuración general.
    1. Establezca Sim Anneal, Burn In e Iterations escribiendo en los cuadros de entrada de texto asociados. Sim Anneal (recocido simulado) identifica buenos valores de parámetros iniciales, Burn In busca modos posteriores y la etapa final permite extraer todas las inferencias posteriores. Los valores más altos aumentan el tiempo de ejecución, pero también aumentan la precisión.
    2. Ingrese las condiciones experimentales especificando la temperatura en grados Celsius y el método de sincronización utilizando el cuadro de texto etiquetado Temperatura y el menú desplegable Sincro. Método, respectivamente.
    3. Opcionalmente, configure los ajustes avanzados en el menú Configuración avanzada. La configuración avanzada permite establecer priores para cada uno de los parámetros ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      NOTA: Puede encontrar más información sobre la configuración avanzada en el archivo léame.txt en la carpeta CLOCCS del repositorio de CLOCCS_alignment.
  3. Introduzca la configuración para usarla con los datos en ciernes.
    1. Elija la selección adecuada en el menú desplegable Tipo de modelo . La opción predeterminada Bud es para información de gemación estándar para levadura en ciernes.
      NOTA: También existen otras opciones más avanzadas en el menú desplegable: Mutante para información de gemación para mutantes que experimentan múltiples ciclos de gemación sin división, BudSSLSMR para información de gemación e información adicional sobre el cuerpo del polo del huso y el anillo de miosina, y BudNucDivNeck para información sobre gemación e información adicional sobre núcleos divisorios y de cuello de brotación. Estas opciones avanzadas se describen en el archivo léame de CLOCCS y en trabajos anteriores11,14,15.
    2. Importe los datos mediante el panel Importación de datos escribiendo en los cuadros de entrada de texto o cargando un archivo haciendo clic en el botón Seleccionar archivo . La primera columna especifica los puntos de tiempo. Las dos columnas restantes especifican los datos de gemación y pueden tomar cualquiera de las siguientes opciones: el número de celdas sin gemación (Sin brote), el número de celdas en gemación (Bud) o el número total de celdas (Total).
  4. Introduzca los ajustes para utilizarlos con los datos citométricos de flujo. Para cada experimento , ejecute el paso 3.3 o el paso 3.4.
    NOTA: Los datos citométricos de flujo y los datos de gemación se pueden usar juntos. Aunque anteriormente describimos ejecutarlos juntos15, para esta herramienta, deben ejecutarse de forma independiente y luego compararse.
    1. Convierta los archivos .fcs al formato de entrada CLOCCS correcto para citometría de flujo siguiendo las instrucciones del archivo complementario 1 (también se encuentra en el repositorio de CLOCCS_alignment como CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
    2. Seleccione la selección Flujo en el menú desplegable Tipo de modelo .
    3. Importe los datos mediante el panel Importación de datos. Haga clic en Seleccionar archivo y seleccione el archivo generado en el paso 3.4.1.
    4. Seleccione los puntos de tiempo para los que se debe trazar un ajuste CLOCCS de citometría de flujo seleccionando los puntos de tiempo en el cuadro Tiempos de ajuste .
  5. Una vez que se hayan seleccionado todas las entradas para la citometría de gemación o de flujo, haga clic en el botón Aplicar y luego haga clic en el botón Muestra en la parte superior de la pantalla.
  6. Vea la curva de gemación o los gráficos de citometría de flujo con los ajustes previstos seleccionando la pestaña Ajustes previstos . Esta pestaña se abre de forma predeterminada inmediatamente después del paso anterior.
  7. Para ver los histogramas de parámetros para cada parámetro, seleccione la pestaña Histogramas de parámetros y, a continuación, seleccione la subpestaña que corresponde al parámetro de interés entre las siguientes opciones: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, etc.
  8. Para ver la gráfica de puntuación posterior, seleccione la ficha Puntuación posterior .
  9. Vea la configuración y modifíquela seleccionando la pestaña Configuración ; para ver el registro de las ejecuciones anteriores, seleccione la ficha Registro .
  10. Obtenga los parámetros CLOCCS del ajuste seleccionando la ficha Parámetros posteriores . La tabla resultante tendrá la siguiente forma: cada fila consta de un parámetro, siendo la última fila la posterior. Las columnas consisten en el parámetro previsto para la media, el intervalo de confianza inferior del 2,5%, el intervalo de confianza superior del 97,5% y la tasa de aceptación.
    1. Registre los parámetros utilizados para la alineación de cada experimento: el tiempo de recuperación de la sincronía (μ0) y el período promedio del ciclo celular de las células madre (λ).
    2. Calcule el período del ciclo celular calculando el promedio del período de la célula madre (λ) y el período de la célula hija (λ + δ), donde δ es el retraso específico de la hija.
      NOTA: Repita la sección 3 con todos los experimentos que se incluirán en las comparaciones.

4. Conversión de puntos de tiempo a puntos de línea de vida utilizando las funciones de conversión de Python y los parámetros CLOCCS

NOTA: La conversión entre puntos de tiempo y puntos de línea de vida requiere dos fórmulas de conversión21. Una implementación de Python para la conversión y la visualización de datos está disponible en el repositorio de CLOCCS_alignment y se describe a continuación.

  1. Active el entorno Conda introduciendo el siguiente comando en el terminal: conda activate CLOCCS_alignment
  2. Abra un bloc de notas interactivo de Python escribiendo el siguiente comando en el terminal: Jupyter Notebook
  3. Cree un nuevo bloc de notas de Python en la carpeta deseada.
    NOTA: Se ha incluido un bloc de notas de ejemplo para demostrar el uso estándar y se puede encontrar en Alignment/JOVE_example.ipynb en el repositorio de alineación de CLOCCS_.
  4. Importe el archivo de Python que contiene las funciones de alineación ejecutando el siguiente comando en la primera celda:
    %run path_to_repo/cloccs_alignment/Alignment/utilities.py
    1. Sustituya la ruta de acceso al repositorio de CLOCCS_alignment por path_to_repo.
  5. Si utiliza datos de gemación como datos de fase de ciclo de celda, importe un marco de datos que contenga el porcentaje de budded en cada punto de tiempo ejecutando el siguiente comando en una celda nueva:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Sustituya la ruta de archivo y el nombre de archivo adecuados. Si el archivo es un archivo .csv, quite sep ="\t"
  6. Si utiliza datos de gemación como datos de fase del ciclo celular, alinee los datos de gemación con una escala de tiempo de punto de línea de vida introduciendo la siguiente función en una nueva celda:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, puntos temporales, param_mu0, param_lambda)
    1. Para los puntos de tiempo, sustituya una lista de los puntos de tiempo para que sea el índice del marco de datos budding_df.
    2. Para param_mu0 y param_lambda, sustituya el experimento por los parámetros aprendidos de la ejecución de CLOCCS en ciernes en la sección 3.
  7. Si utiliza datos de citometría de flujo, importe los datos de citometría de flujo ejecutando el siguiente comando en una celda nueva:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. Para obtener flow_input_folder, sustituya la ruta de acceso adecuada a la carpeta que contiene los archivos .fcs de citometría de flujo.
  8. Si utiliza datos de citometría de flujo, genere una tabla de conversión entre los puntos de tiempo y los puntos de línea de vida para cada experimento escribiendo el siguiente comando en una nueva celda:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(puntos de tiempo, param_mu0, param_lambda)
    1. Para los puntos de tiempo, sustituya una lista de los puntos de tiempo de los datos de citometría de flujo.
    2. Para param_mu0 y param_lambda, sustituya el experimento por los parámetros aprendidos de la citometría de flujo CLOCCS ejecutada en la sección 3.
  9. Importe el marco de datos que contiene los datos experimentales en el bloc de notas ejecutando el siguiente comando en una celda nueva:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Sustituya la ruta de archivo y el nombre de archivo adecuados. Si el archivo es un archivo .csv, elimine sep ="\t".
      NOTA: Esto se puede hacer para cualquier dato tabular. Los datos experimentales simplemente deben tener los puntos de tiempo como columnas o el índice del marco de datos. Los datos de ejemplo se pueden encontrar en el repositorio CLOCCS_alignment.
  10. Alinee los datos experimentales con una escala de tiempo de punto de línea de vida introduciendo la siguiente función en una nueva celda:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, timepoints, param_mu0, param_lambda, interpolate, lowerll, upperll)
    1. Para los puntos de tiempo, sustituya una lista de los puntos de tiempo como el índice o las columnas de la data_df experimental del paso anterior.
    2. Para param_mu0 y param_lambda, sustituir los valores obtenidos en la sección 3 de CLOCCS.
      NOTA: Los parámetros pueden provenir de cualquier ejecución CLOCCS realizada en cualquiera de los tipos de datos de fase de ciclo celular aceptados.
    3. Opcionalmente, sustituya interpolar por True o False, o deje en blanco (el valor predeterminado es False).
      NOTA: Cuando se establece en False, los datos no se interpolarán. Cuando se establece en True, los puntos de la línea de vida se redondearán e interpolarán para rellenar los valores entre los puntos de la línea de vida, de modo que haya un punto por entero en el rango de los puntos de la línea de vida. Esto permite una mejor comparación entre conjuntos de datos.
    4. Opcionalmente, sustituya lowerll y upperll por None o valores enteros.
      NOTA: Cuando se establece en Ninguno, se mantienen todos los puntos de la línea de vida después de la interpolación. Cuando se suministran enteros , esto trunca los datos para que los puntos de la línea de vida oscilen entre el nivel inferior y el superior. Esto permite la comparación entre conjuntos de datos con un lowerll o upperll diferente.
  11. Descargue el conjunto de datos alineado con la línea de vida escribiendo el siguiente comando en una nueva celda: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. Repita los pasos 4.5-4.11 con todos los experimentos que se incluirán en las comparaciones.

5. Comparación de curvas de gemación y datos de citometría de flujo

  1. Trazar las curvas de gemación antes de la alineación utilizando la función de utilidades de Python introduciendo el siguiente comando en una nueva celda:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, título = str_title)
    1. Sustituya una lista que contenga los marcos de datos de todas las curvas en ciernes deseadas para trazar list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
    2. Sustituya una lista de las etiquetas por la leyenda [Experimento 1, Experimento 2, Mutante] por leg_list si lo desea. En caso contrario, excluya o sustituya Ninguno.
    3. Sustituya el tiempo por str_type.
    4. Sustituya el título de una cadena Comparison Budding Curves por str_title si lo desea. Si no es así, sustituya Ninguno o excluya.
  2. Trazar las curvas de gemación después de la alineación utilizando la función de utilidades de Python siguiendo las instrucciones del paso 5.1, pero con una lista de curvas de gemación alineadas sustituidas por list_of_budding_curves y con línea de vida para point_type en lugar de tiempo.
  3. Para trazar los datos de citometría de flujo, trace los datos asociados de los archivos .fcs en los puntos de línea de vida correspondientes utilizando el convertidor generado en el paso 4.8.
  4. Convierta los puntos de la línea de vida a la fase del ciclo de celda utilizando la tabla del convertidor (Tabla 1).
    NOTA: Esto también se puede trazar siguiendo las instrucciones del paso 5.1, pero con fase para point_type en lugar de tiempo.

6. Comparación de los datos experimentales

  1. Determinar la lista de genes que se trazará en los gráficos de líneas en función de la información de la literatura o los genes de interés para la investigación.
  2. Utilice la plot_linegraph_comparison proporcionada en el archivo de utilidades de Python para realizar comparaciones de gráficos de líneas en el marco de datos original, alineado o alineado e interpolado escribiendo el siguiente comando en una nueva celda:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, point_type = str_type, título = str_title)
    1. Sustituya list_of_dfs por una lista de los marcos de datos de los experimentos que se compararán.
      NOTA: Los marcos de datos pueden estar desalineados o alineados; Sin embargo, la point_type correspondiente debe introducirse en el paso 6.2.4.
    2. Sustituya una lista de títulos para cada marco de datos en el mismo orden que la lista de marcos de datos para list_for_legend.
    3. Sustituya una lista de los nombres de genes (que deben incluirse en el índice de los marcos de datos) para trazar por genelist.
    4. Sustituya el tipo de punto por str_type. Utilice la línea de vida (el valor predeterminado es la escala de punto de línea de vida) o la fase (la escala de línea de vida de fase del ciclo de celda) para las tramas de datos alineadas en el paso 6.2.1 o el tiempo para las tramas de datos no alineadas en el paso 6.2.1.
    5. Sustituya str_title por un título de cadena opcional.
  3. Determine la lista de genes que se incluirán en el mapa de calor utilizando la literatura o los algoritmos para determinar los principales genes periódicos.
    NOTA: Para realizar comparaciones adecuadas de mapas de calor, los datos deben alinearse, interpolarse y ajustarse a la escala temporal en el paso 6.2; Debe tener el mismo valor de línea de vida inicial y final para cada experimento.
    1. Ejecutar algoritmos de periodicidad para determinar los principales genes periódicos23,24, o utilizar los métodos alternativos deseados para determinar la lista de genes (es decir, los resultados de la literatura).
    2. Importe un archivo de lista de genes .csv o .tsv en el bloc de notas mediante el siguiente comando en una celda nueva:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. Sustituya la ruta de archivo y el nombre de archivo adecuados. Si el archivo es un archivo .csv, elimine sep="\t".
  4. Utilice la función proporcionada plot_heatmap_comparison en el archivo de utilidades de Python para realizar una comparación de mapa de calor en el marco de datos alineado, interpolado y alineado por fase escribiendo el siguiente comando en una nueva celda:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelista, título = str_title)
    1. Sustituya por list_of_dfs una lista de los marcos de datos alineados de los experimentos que se compararán.
    2. Sustituya una lista de títulos para cada marco de datos en el mismo orden que la lista de marcos de datos para list_for_legend.
    3. Sustituya una lista de los nombres de genes (que deben incluirse en el índice de los marcos de datos) para trazar por genelist.
    4. Sustituya str_title por un título de cadena opcional.
      NOTA: El primer marco de datos de la lista es el que se utilizará para ordenar los genes en el mapa de calor. Los genes se ordenarán por el máximo en el primer período para ese marco de datos, y se utilizará el mismo orden para los marcos de datos posteriores en la lista.

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Representative Results

Los pasos descritos en el protocolo anterior y en el flujo de trabajo de la Figura 1 se aplicaron a cinco experimentos de series temporales sincronizadas con ciclo celular para demostrar dos comparaciones representativas: entre réplicas con diferentes métodos de sincronía (feromona de apareamiento y elutriación centrífuga18) y plataformas de secuenciación (secuenciación de ARN [RNA-seq] y microarray), así como entre condiciones experimentales. Se realizaron múltiples experimentos con S. cerevisiae, y se recopilaron datos experimentales y de fase del ciclo celular para cada experimento. El flujo de trabajo implica el uso de CLOCCS para parametrizar los diversos experimentos de series temporales de sincronía / lanzamiento, el uso de estos parámetros para alinear los experimentos a una escala de línea de vida comparable común y luego el uso de estos experimentos alineados para las dos comparaciones representativas.

Para demostrar la comparación representativa entre réplicas, seleccionamos tres experimentos realizados con la misma cepa y en las mismas condiciones experimentales, llamados Condición 1. Dos de estos experimentos fueron réplicas directas entre sí, y ambos se analizaron mediante análisis de microarrays y se sincronizaron mediante elutriación centrífuga. El tercer experimento se analizó mediante análisis RNA-seq y se sincronizó mediante la detención de feromonas de apareamiento por factor alfa. Para demostrar la segunda comparación entre experimentos con diferentes períodos del ciclo celular, el experimento RNA-seq de la Condición 1 (período del ciclo celular: 71 min) desde arriba se comparó con la Condición 2 (período del ciclo celular: 82 min) y la Condición 3 (período del ciclo celular: 110 min) (Tabla 2). Para cada experimento, las células se cultivaron en sus respectivas condiciones, se sincronizaron, se liberaron y luego se muestrearon a lo largo de dos o más períodos de ciclo celular. Los datos de citometría de gemación y/o flujo se recogieron para proporcionar información sobre la fase del ciclo celular, y se recogieron datos transcriptómicos de series temporales de microarrays o RNA-seq como se describe en Leman et al.18 (Tabla Suplementaria S1).

Para cada experimento, los datos tomaron las formas descritas en la Figura 2, que presenta el experimento de la Condición 2 como un ejemplo para la demostración. Cada conjunto de datos tenía una curva en ciernes, lo que permitía inferir la fase del ciclo celular. Esta curva comprendía un valor porcentual de gemación para cada punto de tiempo en la serie temporal, que luego se trazó para producir una curva en gemación que mostraba múltiples oscilaciones del ciclo celular (Figura 2). Los datos de fase del ciclo celular también tomaron la forma de datos de tinción del contenido de ADN por citometría de flujo para cada punto de tiempo en la serie de tiempo. Se trazaron los puntos de tiempo seleccionados para la condición 2 (Figura 2). Los archivos de citometría de flujo se combinaron en una sola tabla que comprende las celdas en cada contenedor de fluorescencia logarítmica para cada punto de tiempo para ingresar en el CLOCCS utilizando la función flow_cytometry_CLOCCS_file_from_fcs en las utilidades de Python. Cada conjunto de datos también contenía datos experimentales. En este caso, los datos eran datos transcriptómicos, y los datos se organizaron en filas de genes, cada uno con un valor para la abundancia de ARN en cada punto de tiempo en el experimento (Figura 2).

Hemos demostrado el uso de CLOCCS y la conversión a puntos de línea de vida para el conjunto de datos RNA-seq de la Condición 2; Sin embargo, el proceso también fue idéntico para los otros experimentos. La información de gemación se ingresó en el algoritmo CLOCCS como se describe en la sección 3 del protocolo y como se muestra en la Figura 3A. Se utilizaron los valores predeterminados para Sim Anneal, Burn In, Iterations y Advanced Settings (Configuración avanzada). Se seleccionaron las condiciones experimentales apropiadas. Se utilizó el tipo de modelo de "Bud" para los datos de brotación. Los ajustes de gemación CLOCCS resultantes se consideraron para garantizar que las curvas de gemación se ajustaran correctamente, como lo demuestran los puntos de datos que superponen la curva de ajuste correspondiente con una pequeña banda de confianza del 95% (Figura 3B y Figura suplementaria S1). Los parámetros μ0 y λ de la tabla de parámetros posteriores (Figura 3C) se registraron para su uso en la alineación. Los datos de citometría de flujo para la condición 2 se introdujeron por separado en CLOCCS, como se describe en la sección 3 del protocolo. Actualmente, CLOCCS espera que los citómetros de flujo produzcan datos de 10 bits con 1.024 canales; Sin embargo, los citómetros de flujo modernos pueden tener más canales. Dado que nuestro citómetro de flujo produce datos con más de 1.024 canales, los datos se agruparon en 1.024 contenedores. Con los datos de fase del ciclo celular de citometría de flujo, CLOCCS produce un ajuste CLOCCS para cada punto de tiempo seleccionado (Figura 3D y Figura Suplementaria S2) y proporciona una tabla de parámetros posterior similar a la tabla de parámetros posteriores en gemación en la Figura 3C. Los parámetros para la gemación que CLOCCS ejecuta para cada uno de los otros experimentos se describen en la Tabla 2, y los parámetros para la citometría de flujo que ejecuta CLOCCS se describen en la Tabla Suplementaria S2.

Para la alineación de la línea de vida se utilizaron los parámetros CLOCCS correspondientes al período del ciclo celular de las células madre (λ) y el tiempo de recuperación (μ0). Es importante tener en cuenta que λ no representa necesariamente el período promedio del ciclo celular de la población celular. En los casos en que las células experimentan una división completa, hay un número igual de células madre e hija, por lo que el período promedio del ciclo celular es el promedio entre el período del ciclo celular de las células madre (λ) y el período del ciclo celular de las células hijas (λ + δ); Específicamente, delta (δ) es la duración del retraso específico de la hija. Este es el cálculo que utilizamos para el período del ciclo celular para cada experimento (Tabla 2). Para cada experimento, los parámetros correspondientes λ y μ0 se utilizaron en la función de conversión, df_conversion_from_parameters, suministrada en el archivo de utilidades de Python, como se demuestra para la Condición 2 (Figura 4A). Para las curvas en ciernes, los datos no fueron interpolados. Sin embargo, para los datos experimentales, los conjuntos de datos alineados con la línea de vida se volvieron a muestrear utilizando interpolación, de modo que cada punto de la línea de vida contenía datos interpolados para mejorar el trazado. Para garantizar que los conjuntos de datos alineados con la línea de vida tuvieran el mismo rango de puntos de línea de vida, se establecieron límites de línea de vida inferior y superior para truncar los datos en esos puntos. Estos parámetros lowerll y upperll se introdujeron en la función df_conversion_from_parameters cuando la interpolación se estableció en True. Para la comparación de la Condición 1, se establecieron en 44 y 270, respectivamente, para todos los conjuntos de datos, y para la comparación entre condiciones ambientales, se establecieron en 50 y 300, respectivamente. Un ejemplo de uso de estas funciones para la alineación y comparación se puede ver en el bloc de notas de Python de ejemplo JOVE_example.ipynb, y el código utilizado para generar las figuras se puede ver en el bloc de notas JOVE_Figures.ipynb en el repositorio de CLOCCS_alignment.

Esta conversión de puntos de tiempo a puntos de línea de vida depende de dos fórmulas21 (Figura 4A) utilizando μ0 (tiempo de recuperación) y λ (período madre). La primera fórmula, , Equation 1es la fórmula de la fase de recuperación (Figura 4A). Esta fórmula se utiliza sólo para los puntos de tiempo dentro de la fase de recuperación, que consiste en los puntos de tiempo hasta e incluyendo μ 0, ya que μ0 corresponde al tiempo de recuperación. Los puntos de tiempo se convierten a un rango de escala de línea de vida que termina con 100 puntos de línea de vida (Tabla 1), marcando el final de la fase de recuperación y el comienzo del primer ciclo celular. La fase posterior a la recuperación utiliza la segunda fórmula, Equation 2 (Figura 4A), que convierte cada punto de tiempo posterior a la recuperación en un punto de línea de vida después de 100. Cada 100 puntos de línea de vida subsiguientes corresponde a un nuevo ciclo celular, con el primer ciclo correspondiente a los puntos de línea de vida 100 a 200, el segundo ciclo correspondiente a los puntos de línea de vida 200 a 300, y así sucesivamente (Tabla 1). La conversión de puntos de tiempo a puntos de línea de vida se aplica a cada conjunto de datos individualmente utilizando los parámetros CLOCCS correspondientes para ese conjunto de datos. Después de convertir cada conjunto de datos a la escala de línea de vida, las fases del ciclo celular se alinean, lo que permite comparaciones específicas de fase entre conjuntos de datos.

La Tabla 3 muestra la conversión de puntos de tiempo seleccionados en sus respectivos puntos de línea de vida para la conversión representativa del conjunto de datos de la Condición 2 utilizando parámetros de la ejecución CLOCCS en ciernes. Los datos de gemación recopilados del RNA-seq de la Condición 2 se trazaron en una curva de gemación que muestra el porcentaje de gemación a lo largo del tiempo tanto para la escala de tiempo no alineada en minutos (Figura 4B) como para la escala de tiempo alineada en puntos de línea de vida (Figura 4C) utilizando la función Python plot_budding_curves en un cuaderno de Python. Los puntos de la línea de vida se pudieron convertir fácilmente en información experimental y de fase del ciclo celular (Tabla 1), y la fase de recuperación y los ciclos de la primera a la tercera célula se codificaron por colores a mano en consecuencia (Figura 4B, C). Dado que cada punto de la línea de vida correspondía a una fase del ciclo celular, los gráficos de citometría de flujo individuales podían etiquetarse a través de las funciones de Python utilizando la fase del ciclo celular determinada por la alineación de la línea de vida. Estas fases coincidieron con las fases determinadas mediante análisis citométrico de flujo para la Condición 2. Los datos de citometría de flujo recopilados para el conjunto de datos de la Condición 2 se trazaron para puntos de tiempo seleccionados y se etiquetaron utilizando la fase del ciclo celular determinada a partir de la alineación de la línea de vida de la citometría de flujo. En cada caso, los datos coincidían con la fase determinada por la alineación (Figura 4D).

Es importante tener en cuenta que el nivel de expresión de cada gen para cada muestra sigue siendo el mismo, pero el etiquetado de los puntos de tiempo se altera de tiempo en minutos a puntos de línea de vida. Sin embargo, la conversión no es lineal. La fase de recuperación, resaltada en gris, ocupa un mayor porcentaje del tiempo experimental una vez realizada la conversión a puntos de línea de vida (Figura 4B,C). La ventaja de la escala de línea de vida es que permite información detallada de fase y comparaciones de fase entre experimentos. La información de fase está contenida en los puntos de la línea de vida, como se describe anteriormente y se muestra en la Tabla 1. Además, G1 está contenido en los primeros 15,5 puntos de la línea de vida de cada ciclo celular, S en los siguientes 20 puntos de la línea de vida y G2/M en los siguientes 64,5 puntos de la línea de vida (Tabla 1). Sin embargo, esto limita artificialmente el tiempo de recuperación al mismo lapso de tiempo de cada ciclo celular consecutivo, incluso si la fase de recuperación parece muy corta en la escala de puntos de tiempo original. Esto no oscurece las comparaciones, porque las fases de cada experimento están alineadas. En la mayoría de los casos, es más relevante comparar los datos en puntos que ocurren en la misma fase experimental y biológica en lugar de en puntos de tiempo que ocurren al mismo tiempo en minutos.

Una vez que todos los experimentos se han convertido a la escala de línea de vida alineada utilizando las funciones de Python proporcionadas en el archivo de utilidades de Python, se pueden comparar. Aquí, demostramos dos comparaciones comunes entre experimentos: una entre réplicas de un experimento similar a través de plataformas y métodos de sincronización (Figura 5) y otra entre diferentes condiciones experimentales con una duración de período cambiante (Figura 6 y Figura 7). Como se describió anteriormente, la primera comparación es a través de dos réplicas de microarrays elutriados y un experimento de RNA-seq sincronizado con factor alfa. Antes de la alineación, las dos réplicas de microarrays mostraron una sincronía y una dinámica de ciclo celular similares, pero la replicación de la Microarray 2 de la Condición 1 parecía ligeramente retrasada (Figura 5A). La diferencia más notable se encontró al comparar los conjuntos de datos no alineados; el segundo ciclo de RNA-seq de la Condición 1 apareció alineado con el primer ciclo de los dos experimentos de microarrays. La diferencia probablemente no estaba relacionada con las diferentes plataformas transcriptómicas, sino más bien con los diferentes métodos de sincronización. Las poblaciones celulares en los experimentos de microarrays se sincronizaron mediante elutriación centrífuga, mientras que la población para el experimento RNA-seq se sincronizó mediante un tratamiento de feromonas de apareamiento. De hecho, la sincronización con feromonas de apareamiento redujo sustancialmente el tiempo de recuperación en comparación con la elutriación (Figura 5A y Tabla 2).

A pesar de las diferencias obvias entre las réplicas cuando se trazaron en términos del tiempo transcurrido, después de la alineación de la línea de vida, las curvas fueron casi idénticas, y se hicieron posibles comparaciones más detalladas y relevantes entre las réplicas (Figura 5B). La fase de recuperación se alineó para que cada experimento comenzara en el mismo punto de la línea de vida, y las variaciones en el período se normalizaron mediante la alineación de la línea de vida. Debido a la alineación, los valores experimentales en el mismo punto de la línea de vida a través de réplicas ocurrieron en la misma fase del ciclo celular, lo que permitió cálculos de la varianza experimental a través de réplicas. Las fases de recuperación y ciclo celular están etiquetadas en la Figura 5B para proporcionar información adicional sobre las fases del ciclo celular en cada uno de los experimentos. Esta alineación de la línea de vida podría aplicarse al conjunto de datos experimental (Figura 5C, D) utilizando la función Python df_conversion_from_parameters proporcionada en el archivo de utilidades, como se describió anteriormente.

En la Figura 5D, los datos transcriptómicos se alinearon y la dinámica de expresión para el gen CDC20 se trazó utilizando la función Python plot_linegraph_comparison en un cuaderno de Python. Antes de la alineación, parecía como si la primera expresión del pico de los experimentos de microarrays se alineara con el segundo pico del experimento RNA-seq (Figura 5C); sin embargo, después de la alineación, los primeros picos del ciclo celular de cada conjunto de datos se alinearon correctamente (Figura 5D). Además, el ancho de pico de los experimentos pareció diferir entre el conjunto de datos RNA-seq y los conjuntos de datos de microarrays, pero después de la alineación, el ancho del pico estaba más alineado (Figura 5C, D).

La segunda comparación es entre experimentos en diferentes condiciones ambientales con diferentes períodos del ciclo celular (Figura 6). Como se describió anteriormente, aquí, comparamos los conjuntos de datos de S. cerevisiae en la Condición 1 con la Condición 2 y la Condición 3, que corresponden a períodos de ciclo celular de 71, 82 y 110 min, respectivamente. Estas diferencias en el período del ciclo celular introdujeron incertidumbre al comparar entre experimentos antes de la alineación de la fase del ciclo celular, como se muestra en las curvas de gemación no alineadas. Las diferencias de período son visibles en las curvas de gemación no alineadas (Figura 6A). Sin embargo, cuando se alinearon con CLOCCS utilizando este protocolo, las tres curvas parecían notablemente similares, lo que hizo posible la comparación de datos experimentales (Figura 6B).

Usando los parámetros CLOCCS de citometría de flujo, la Condición 1 y la Condición 2 se alinearon con una escala de línea de vida común, y los histogramas de contenido de ADN se trazaron en la Condición 2 y en puntos de línea de vida equivalentes en la Condición 1. Se compararon las mediciones citométricas de flujo del contenido de ADN a través de los puntos de la línea de vida (Figura 6C). Como las mediciones del contenido de ADN no eran continuas y no se interpolaban fácilmente, solo podíamos comparar los puntos de la línea de vida más cercanos. Los datos de fase del ciclo celular para cada punto de línea de vida comparable no fueron idénticos entre las dos condiciones (Figura 6C), lo que indica que los ajustes CLOCCS y los parámetros resultantes probablemente estaban ligeramente desalineados para la Condición 1. Esto probablemente se debió al peor ajuste de CLOCCS a los datos citométricos de flujo para la Condición 1 en comparación con la Condición 2 (Figura suplementaria 2). Sin embargo, la alineación solo se desvió en una muestra y, por lo tanto, aún permite mejorar las comparaciones específicas de la fase.

La alineación de la línea de vida en gemación se aplicó a los datos experimentales para los experimentos de RNA-seq en la Condición 1, la Condición 2 y la Condición 3 (Figura 7) utilizando los parámetros CLOCCS en gemación en la función df_conversion_from_parameters en los datos experimentales. Los datos transcriptómicos se alinearon, y la expresión génica del gen CDC20 para cada serie de tiempo se mostró para los tres experimentos. Antes de la alineación, la dinámica de transcripción de CDC20 no se superponía (Figura 7A). Después de la alineación, los picos primero y segundo de la expresión génica CDC20 estaban mucho más estrechamente alineados para los tres conjuntos de datos. Después de la alineación, quedó claro que los picos ocurrieron en la misma fase del ciclo celular, pero las formas de las curvas eran diferentes (Figura 7B). La condición 3 tuvo un primer pico más bajo y más amplio en comparación con las otras dos condiciones, incluso después de tener en cuenta las diferencias en el período del ciclo celular, lo que sugiere que estas diferencias probablemente estaban relacionadas con las condiciones experimentales que se estaban probando (Figura 7B).

También se podrían hacer comparaciones transcriptómicas a gran escala. Para estas comparaciones, se seleccionaron 278 genes ejecutando el algoritmo de periodicidad JTK_CYCLE23 en cada conjunto de datos y tomando la intersección de los genes periódicos principales. Sin embargo, los genes se pueden seleccionar utilizando cualquier método deseado o de la literatura. Estos genes se trazaron en el mismo orden para las tres condiciones, tanto para los mapas de calor no alineados (Figura 7C) como para los alineados (Figura 7D) utilizando la función plot_heatmap_comparison Python en un cuaderno de Python. Estos mapas de calor permiten hacer cientos de comparaciones a nivel de genes simultáneamente. Se podrían hacer comparaciones entre experimentos no alineados con respecto al cambio en la dinámica de la curva, el tiempo pico en relación con los genes vecinos, la duración del período, etc. (Figura 7C). Sin embargo, no se pudieron hacer comparaciones detalladas específicas de fase porque los puntos de tiempo no necesariamente se correlacionan con la misma fase del ciclo celular en todas las condiciones. Aunque los segundos ciclos parecían similares después de la alineación, los primeros ciclos se desplazaron ligeramente entre las condiciones (Figura 7D). Este cambio puede reflejar el hecho de que la información de la fase del ciclo celular en gemación fue de menor calidad para la Condición 3. No obstante, la alineación de los experimentos para las tres condiciones permitió una mejor comparación específica de fase. Antes de la alineación, no estaba claro si el primer pico de expresión en cada condición ocurriría en la misma fase del ciclo celular (Figura 7C); sin embargo, después de la alineación, los experimentos podrían compararse de una manera específica de fase (Figura 7D). Antes de la alineación, los picos en la Condición 3 parecían mucho más amplios que en las otras dos condiciones (Figura 7C); sin embargo, después de la alineación, quedó claro que los picos en la Condición 3 eran de anchura similar a las otras condiciones cuando estaban alineados (Figura 7D).

Estos resultados representativos demuestran el proceso para el uso de CLOCCS para alinear los experimentos a una escala de tiempo común. Antes de la alineación, las comparaciones directas de puntos de tiempo a menudo no se correlacionan con una fase similar del ciclo celular. La conversión del tiempo experimental transcurrido en minutos a puntos de línea de vida que representan la fase del ciclo celular permite comparaciones específicas de fase y biológicamente relevantes entre experimentos en el mismo punto del ciclo celular.

Figure 1
Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo de alineación de la línea de vida de CLOCCS. El flujo de trabajo experimental para la alineación de dos conjuntos de datos de ejemplo utilizando CLOCCS, seguido de comparaciones representativas entre los conjuntos de datos. Se ilustran los pasos principales del protocolo: la recopilación de datos experimentales y de fase del ciclo celular no alineados para cada uno de los conjuntos de datos (paso 1), el uso de CLOCCS para la parametrización de cada conjunto de datos (paso 2 y paso 3), la alineación de los conjuntos de datos a una línea de vida común (paso 4) y, finalmente, la comparación de la fase del ciclo celular y la dinámica experimental (paso 5 y paso 6). Los datos de fase del ciclo celular no alineados se ingresan en CLOCCS para proporcionar parámetros aprendidos, que luego se utilizan para alinearse con una escala de línea de vida común. Estos conjuntos de datos alineados se comparan a continuación. Abreviatura: CLOCCS = Caracterización de la pérdida de sincronía del ciclo celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Formato de la fase del ciclo celular y datos experimentales necesarios para el flujo de trabajo. Los datos necesarios para el flujo de trabajo constan de dos componentes principales: datos de fase del ciclo celular y datos experimentales del ciclo celular. Los datos de fase del ciclo celular pueden consistir en datos de gemación del ciclo celular o datos de contenido de ADN por citometría de flujo para cada punto de tiempo en la serie temporal. Los datos experimentales pueden tomar muchas formas, pero en este caso, son datos transcriptómicos, que consisten en datos de expresión génica para cada gen para cada punto de tiempo en la serie temporal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Ejemplo de resultados de la ejecución de CLOCCS en un conjunto de datos del ciclo celular de S. cerevisiae. (A) Una captura de pantalla de la interfaz gráfica de usuario de CLOCCS con los valores de entrada y la configuración suministrados para los datos en ciernes de la Condición 2. Se introducen los tiempos, el número de celdas sin brotes y el número de celdas en brotación, así como el tipo de modelo, las iteraciones y las condiciones, etc. (B) Una captura de pantalla del ajuste de gemación CLOCCS resultante para la Condición 2 en la pestaña "Ajuste previsto" de los resultados. Cada punto de datos tiene una barra de error de muestreo asociada correspondiente a los intervalos de confianza de proporción binomial del 95% de los datos (para cada punto de tiempo, se contaron al menos 200 celdas [entre 204 y 295 celdas]). La curva de ajuste de gemación resultante muestra la banda de confianza para el intervalo de confianza del 95% del ajuste CLOCCS en púrpura. (C) Una captura de pantalla de la tabla resultante de "Parámetros posteriores" para la ejecución de CLOCCS en ciernes de la Condición 2 que consiste en los parámetros CLOCCS en la media, el intervalo de confianza del 2,5% y el intervalo de confianza del 97,5%. También se muestran las tasas posteriores y de aceptación. (D) Una captura de pantalla de la citometría de flujo que CLOCCS ajusta para la condición 2 a los 70 min y 150 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ejemplo del proceso de conversión de puntos de tiempo a puntos de línea de vida alineados para el conjunto de datos de la condición 2. (A) Las fórmulas de conversión utilizadas para convertir de puntos de tiempo a puntos de línea de vida. Una captura de pantalla de las funciones de Python en el bloc de notas de Python para la conversión y el trazado de las curvas en ciernes. (B) La curva de gemación de la condición 2 no alineada que muestra el porcentaje de gemación para cada punto de tiempo en minutos. El ciclo celular y las fases de recuperación se destacan de la siguiente manera: recuperación (gris), primer ciclo celular (azul), segundo ciclo celular (magenta) y tercer ciclo celular (salmón). (C) La curva de gemación alineada de la Condición 2 que muestra los mismos porcentajes de gemación pero trazada en la escala alineada con la línea de vida. El ciclo celular y las fases de recuperación se destacan como en el panel C. (D) Los gráficos de citometría de flujo alineados para puntos de tiempo seleccionados de la Condición 2 correspondientes a distintas fases del ciclo celular basadas en la escala de línea de vida: el comienzo de G1, el comienzo de la fase S, el comienzo de G2 / M y G2 / M tardío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos para la comparación de los experimentos replicados de la Condición 1 alineados y no alineados. La comparación de las réplicas de la Condición 1: RNA-seq de la Condición 1 (azul), micromatriz de la Condición 1 1 (púrpura) y micromatriz 2 de la Condición 1 (gris). (A) La curva de gemación no alineada para los conjuntos de datos de la Condición 1. (B) La curva de gemación alineada para los conjuntos de datos de la condición 1. Los puntos de la línea de vida se han convertido a la fase del ciclo celular y están codificados por colores debajo del eje x. (C) La expresión génica no alineada de un gen representativo, CDC20, para los conjuntos de datos de la Condición 1. (D) La expresión génica alineada de un gen representativo, CDC20, para los conjuntos de datos de la Condición 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Resultados representativos para la comparación de datos de fase del ciclo celular alineados y no alineados entre experimentos con períodos variables. Comparación de los datos de fase del ciclo celular para conjuntos de datos con tres condiciones ambientales diferentes y, por lo tanto, tres períodos diferentes del ciclo celular: Condición 1 RNA-seq (período del ciclo celular: 71 min), Condición 2 RNA-seq (período del ciclo celular: 82 min) y Condición 3 RNA-seq (período del ciclo celular: 110 min). (A) La curva de gemación no alineada para los conjuntos de datos. (B) La curva de gemación alineada para los conjuntos de datos. (C) Los histogramas de contenido de ADN por citometría de flujo para la Condición 2 (fila superior) en comparación con los puntos de línea de vida equivalentes en la Condición 1 (fila inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Resultados representativos para la comparación de los datos transcriptómicos alineados y no alineados a través de experimentos con períodos variables. Comparación de los datos transcriptómicos asociados con los conjuntos de datos en la Figura 6: Condición 1 RNA-seq, Condición 2 y Condición 3. (A) La expresión génica no alineada de un gen representativo, CDC20, para los conjuntos de datos RNA-seq de la Condición 1, Condición 2 y Condición 3. (B) La expresión génica alineada de CDC20 para los conjuntos de datos. (C) El mapa de calor no alineado de los genes periódicos del ciclo celular superior en el mismo orden para cada conjunto de datos. (D) Los mapas de calor alineados con la línea de vida de los mismos genes periódicos del ciclo celular del panel C en el mismo orden. Las líneas púrpuras discontinuas corresponden a los puntos de línea de vida 100 y 200. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Conversión del punto de la línea de vida a la fase del ciclo celular. La clave de conversión entre la escala de puntos de línea de vida y la fase correspondiente en el experimento. Los puntos de la línea de vida 0-100 corresponden a la recuperación de la sincronía. Cada 100 puntos de línea de vida subsiguientes corresponde a un nuevo ciclo celular, con los primeros 15.5 puntos de línea de vida correspondientes a G1, los siguientes 20 correspondientes a la fase S y los puntos de línea de vida restantes correspondientes a G2 / M. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Parámetros CLOCCS en ciernes. Los parámetros CLOCCS en ciernes resultantes "lambda" y "mu0" para cada experimento a partir de los resultados representativos. Además, el retraso específico de la hija "Delta" y el período calculado del ciclo celular se muestran para cada experimento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Tabla de conversión que muestra la conversión entre puntos de tiempo en minutos y sus respectivos puntos de línea de vida correspondientes para la Condición 2. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura suplementaria S1: La brotación de CLOCCS se ajusta a la Condición 1 y la Condición 3. Captura de pantalla del ajuste de gemación CLOCCS resultante para (A) los datos de gemación de ARN seq de la Condición 1, (B) los datos de gemación de la micromatriz de la Condición 1, (C) los datos de gemación de la micromatriz 2 de la Condición 1 y para (D) los datos de gemación de la Condición 3. El ajuste de gemación de CLOCCS para la Condición 2 se puede ver en la Figura 3B. La banda de confianza del 95% y las barras de error de muestreo son las descritas en la documentación de CLOCCS14,15 y en la Figura 3. Para cada punto de tiempo para cada serie temporal, se contaron aproximadamente 200 celdas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: La citometría de flujo CLOCCS se ajusta a la condición 1 y la condición 2. Captura de pantalla de la citometría de flujo que CLOCCS ajusta para las muestras que se muestran en la Figura 6C para la Condición 2 (fila superior: A-D) y la Condición 1 (fila inferior: E, F). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: Sensibilidad de la alineación a variaciones en los parámetros CLOCCS. Comparación de la alineación del conjunto de datos RNA-Seq de la condición 1 utilizando variaciones (A-C) en los parámetros CLOCCS λ y μ0 dentro del intervalo de confianza del ajuste CLOCCS y (D,E) con grandes variaciones en los parámetros. Comparación entre el valor medio con los valores de confianza del 2,5% y 97,5% de salida en la tabla de parámetros por CLOCCS para (A) el parámetro μ0, (B) el parámetro λ y (C) para ambos parámetros μ0 y λ. (D) Comparación entre la alineación utilizando el valor medio para μ0 en comparación con grandes variaciones en el parámetro μ0 (200% a 0,25% de μ0). (E) Comparación entre la alineación utilizando el valor medio para λ en comparación con grandes variaciones en el parámetro λ (200% a 0,25% de λ). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1: Descripción de la recopilación de datos para cada experimento. Para cada experimento, esta tabla proporciona una descripción de los datos de gemación, los datos de citometría de flujo, los datos transcriptómicos y el método de sincronización. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S2: Parámetros CLOCCS de las ejecuciones CLOCCS por citometría de flujo. Los parámetros CLOCCS "mu0" y "lambda" para la citometría de flujo de la Condición 1 y la Condición 2 CLOCCS ejecutan. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Instrucciones para la conversión de los datos de flujo citométrico al formato de entrada CLOCCS. Para el uso de CLOCCS con datos de citometría de flujo, se requiere un formato de entrada específico. Este archivo proporciona instrucciones más detalladas sobre el paso de protocolo 3.4.1 para explicar cómo utilizar las funciones de utilidad de Python para realizar esta conversión. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este artículo presenta un método para evaluar de manera más precisa y cuantitativa los datos de experimentos de series temporales en poblaciones sincronizadas de células. El método utiliza parámetros aprendidos de CLOCCS, un modelo de inferencia bayesiana que utiliza datos de fase del ciclo celular de entrada, como datos de gemación y datos de contenido de ADN por citometría de flujo, para parametrizar cada experimento14,15. CLOCCS utiliza los datos de fase del ciclo celular de entrada para inferir los parámetros para cada experimento, que luego se utilizan para la alineación a una escala de línea de vida común. La conversión de múltiples experimentos de series temporales de sincronía/lanzamiento a una única escala de tiempo alineada con la línea de vida permite comparaciones relevantes y específicas de fase entre experimentos y la agregación de múltiples experimentos replicados, que antes eran difíciles o imposibles.

Los pasos críticos de este protocolo incluyen la recopilación de datos, la ejecución de CLOCCS, la alineación de los conjuntos de datos y la comparación entre los conjuntos de datos. En primer lugar, se deben recopilar datos para su uso en este protocolo. Los datos deben consistir tanto en datos experimentales que contengan información sobre la cuestión de interés (es decir, datos transcriptómicos, datos de expresión génica, datos proteómicos) como en datos de fase del ciclo celular que contengan información sobre la fase del ciclo celular (es decir, datos de gemación, datos de contenido de ADN por citometría de flujo). Luego, los datos de fase del ciclo celular se pueden usar en CLOCCS para recopilar la información de parámetros para cada experimento. Los parámetros μ0 (duración de la fase de recuperación) y λ (período del ciclo de la célula madre) se utilizan para convertir los puntos de tiempo en puntos de la línea de vida. La alineación del punto de la línea de vida permite comparar directamente las series temporales alineadas.

Una limitación del método es que la alineación adecuada depende de la identificación de un buen ajuste a los datos. Lograr el mejor ajuste de CLOCCS depende de la calidad de los datos de fase del ciclo celular y del uso de la configuración de entrada correcta para el experimento en CLOCCS. El ajuste a los datos de fase del ciclo celular determina la precisión de los parámetros aprendidos y, por lo tanto, tiene un gran impacto en la precisión de la alineación, porque depende del uso de estos parámetros. Como los cambios amplios en los parámetros afectarían en gran medida la alineación, los cambios siguen siendo mínimos dentro del intervalo de confianza suministrado en la salida CLOCCS (Figura suplementaria S3). Es importante tener en cuenta que esta sensibilidad a las variaciones en los parámetros es también lo que permite la alineación entre conjuntos de datos con diferentes tiempos de ciclo celular.

La precisión del ajuste CLOCCS se puede determinar utilizando la curva de ajuste CLOCCS resultante y las barras de error y la banda de error correspondientes (Figura 3B, D, Figura Suplementaria S1 y Figura Suplementaria S2). La pestaña de ajuste CLOCCS muestra los puntos de datos originales, así como la curva de ajuste CLOCCS con la banda de confianza correspondiente al intervalo de confianza del ajuste CLOCCS y las barras de error correspondientes al intervalo de confianza de proporción binomial del 95% de los datos, ya que se supone que los recuentos son variables aleatorias binomiales independientes14. Por ejemplo, las barras de confianza en los datos de gemación miden la confianza en la proporción de células gemadas para una muestra dada.

Un método para determinar la calidad del ajuste CLOCCS implica determinar si las barras de error de los datos se superponen con la banda de intervalo de confianza del ajuste CLOCCS. Otra indicación es la amplitud de la banda de confianza del 95% del ajuste CLOCCS. En general, el ancho de la banda disminuye con una mayor bondad de ajuste. Una indicación de mala alineación es si la fase del ciclo celular de los datos originales no coincide con la fase del ciclo celular inferida de la alineación. Cada alineación se puede verificar dos veces confirmando que, para cada punto de tiempo, la fase indicada por los datos de información de la fase del ciclo celular coincide con la fase del ciclo celular asignada por la alineación.

Un ajuste deficiente de CLOCCS o una alineación deficiente podría ser el resultado de datos de fase del ciclo celular de baja calidad. Los datos de gemación de alta calidad tendrán un porcentaje de gemación muy bajo inmediatamente después del arresto y un porcentaje de gemación muy alto en el primer pico. Los picos y valles posteriores perderán sincronía, pero deben ser distintos y espaciados uniformemente. Dado que los puntos de la línea de vida representan la fase promedio del ciclo celular de la población, la mala sincronización también puede impedir la alineación adecuada. Los datos de contenido de ADN de flujo citométrico de alta calidad tendrán distintos picos de 1C y 2C para cada punto de tiempo correspondiente a la fase apropiada del ciclo celular. Además, la insuficiencia de datos de fase del ciclo celular introduce problemas de identificación de parámetros. En el caso de datos suficientes, los parámetros pueden inferirse y no cambian sustancialmente entre las ejecuciones de CLOCCS. Sin embargo, los parámetros descritos en este protocolo (lambda, delta, mu0) no se pueden desenredar cuando los datos de fase del ciclo celular contienen solo un ciclo celular completo. Para permitir una mejor estimación de los parámetros, se deben utilizar datos suficientes y bien construidos del ciclo celular para el CLOCCSfits 14,15. Además, el modelo CLOCCS utiliza información previa como se describe en Orlando et al.15, pero esta información puede ajustarse para adaptarse mejor a las condiciones experimentales utilizadas.

Si la calidad de los datos de fase del ciclo celular es buena, volver a ajustar la configuración de CLOCCS puede ayudar a producir un ajuste más preciso. Por ejemplo, el número de iteraciones seleccionadas podría aumentarse para mejorar la precisión. Confirmar que se seleccionó el método de sincronización correcto en CLOCCS también puede ser útil, ya que la detención del factor alfa se asocia con un tiempo de recuperación más corto en comparación con la elutriación.

Este método también está limitado en términos de los tipos de datos de fase del ciclo celular admitidos actualmente. Sin embargo, CLOCCS es flexible y se puede adaptar para admitir otros tipos de datos. Por ejemplo, CLOCCS se ha adaptado previamente para admitir el etiquetado fluorescente del ciclo celular de cuerpos de polos fusiformes, anillos de miosina y núcleos11 para su uso como identificadores de fase del ciclo celular. Además, se ha hecho posible el uso de CLOCCS con especies distintas de S. cerevisiae. CLOCCS acepta índices de septación como marcador para la fase del ciclo celular en S. pombe14, así como datos de contenido de ADN por citometría de flujo, que son fácilmente recolectables para muchas especies15. Esto permite la comparación de datos experimentales en la misma fase del ciclo celular para dos especies completamente diferentes y puede dar una idea de los cambios en el ciclo celular a lo largo de la evolución.

Aunque solo se pueden usar formas admitidas de datos de fase del ciclo celular con este método de alineación de línea de vida, este método es independiente del tipo de datos experimentales de series temporales utilizados. En este protocolo, hemos demostrado su uso en la alineación de la expresión génica de un gen individual, así como datos transcriptómicos de series temporales para cientos de genes en tándem. Hemos demostrado que este método se puede utilizar para comparar entre plataformas y, por lo tanto, hacer comparaciones entre conjuntos de datos RNA-seq y conjuntos de datos de microarrays tomados en condiciones similares. También hemos demostrado que este método se puede usar para alinear conjuntos de datos con diferentes métodos de sincronización comparando entre un conjunto de datos que fue elutriado (Microarray de condición 1) con un conjunto de datos que fue detenido por factor alfa (ARN-seq de condición 1). Anteriormente, CLOCCS también se ha utilizado para alinear datos transcriptómicos de series temporales y proteómicas de series temporales utilizando datos de fase del ciclo celular en ciernes22, lo que permitió comparaciones directas entre la dinámica del ARNm y la dinámica de la proteína correspondiente. CLOCCS también se ha utilizado para alinear datos de series temporales entre especies, como para la alineación entre S. cerevisiae y S. pombe14 y entre el primer ciclo de S. cerevisiae y la levadura patógena Cryptococcus neoformans21. Finalmente, la alineación de CLOCCS es actualmente específica para datos de series temporales de ciclo celular y aún no se ha adaptado para su uso con otros tipos de procesos rítmicos. Un área donde esto sería de particular interés es para los ritmos circadianos, donde el tiempo circadiano (TC) se usa convencionalmente para alinear experimentos, aunque su implementación no se aplica de manera consistente. Otra área de interés es investigar los ritmos de desarrollo, como los del parásito de la malaria. Por ejemplo, la alineación de cepas de Plasmodium falciparum con diferentes períodos, como se describe en Smith et al.25, permitiría comparaciones más detalladas entre cepas. La alineación de estos procesos periódicos para la comparación permitiría una mejor comprensión de estas importantes funciones biológicas rítmicas. Estos tipos de comparaciones del ciclo celular han sido posibles mediante el uso de CLOCCS para la alineación de la línea de vida, como se describe en este protocolo.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

S. Campione y S. Haase fueron apoyados por fondos de la National Science Foundation (DMS-1839288) y los Institutos Nacionales de Salud (5R01GM126555). Además, los autores desean agradecer a Huarui Zhou (Universidad de Duke) por los comentarios sobre el manuscrito y por las pruebas beta del protocolo. También agradecemos a Francis Motta (Florida Atlantic University) y Joshua Robinson por su ayuda con el código Java.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2x PBS For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde For Fixative Solution.
100% Ethanol For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer For flow cytometry protocol.
Git https://git-scm.com/
Java 19 https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope For counting cells and buds.
Miniconda https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain Invitrogen S7020 For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris pH 7.5

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References

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Campione, S. A., Kelliher, C. M., Orlando, D. A., Tran, T. Q., Haase, S. B. Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons. J. Vis. Exp. (196), e65466, doi:10.3791/65466 (2023).

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