세포주기 분석: 세포주기 CFSE 염색 및 유세포 분석을 사용한 자극 후 CD4 및 CD8 T 세포 증식 평가

1. 준비

1. 시작하기 전에 실험실 장갑과 적절한 보호 복을 착용하십시오.
2. 먼저 세제로 모든 해부 도구를 살균한 다음 70%의 에탄올로 닦은 다음 철저히 닦아냅니다.
3. 2% 태아 종아리 혈청(FCS)을 함유한 행크의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 50mL준비한다.

2. 해부

1. 이산화탄소 전달 시스템을 사용하여 저산소증으로 마우스를 안락사시합니다. supine 위치에 있는 해부 판에 안락사 마우스를 고정하고 가위와 집게를 사용하여 세로 복강경을 수행합니다.
2. 집게를 사용하여 복부 오른쪽에 내장과 위를 움직여 위와 비장을 노출시십시오. 비장은 위장에 부착됩니다.
3. 집게를 사용하여 조심스럽게 위에서 비장을 분리하고 HBSS 2 % FCS의 5 mL가 들어있는 페트리 접시에 놓습니다.

3. 면역 세포 격리

1. 같은 페트리 접시 위에 40 μm 세포 여과기에 비장을 놓습니다. 비장을 플런저로 분쇄하여 해리합니다.
2. 해리된 비장과 유체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기.
3. 10°C에서 7분 동안 370 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 피하는 상퍼를 폐기하십시오.
4. 적혈구를 lyse 칼륨 아세테이트 의 2 mL에 펠릿을 다시 중단. 2 분 기다린 다음 HBSS 2 % FCS를 사용하여 최대 15 mL의 볼륨을 구성하십시오.
5. 10°C에서 7분 동안 370 x g로 튜브를 다시 원심 분리합니다. 슈퍼네티드를 버리고 5mL의 HBSS 2% FCS로 펠릿을 다시 놓습니다.
6. 트라이판 블루 염색 분석기를 사용하여 세포를 계산하고 HBSS 2% FCS의 적절한 부피를 사용하여 최종 세포 농도를 10⁷ 세포/mL로 조정합니다.

4. CFSE 염색 및 T 세포 자극

1. 4개의 관에^107개의 격리된 비장 세포/튜브를 분배합니다 (15mL 튜브, 1-4로 표시)
2. 각 튜브에 3mL HBSS 2% FCS를 추가합니다.
3. 각 튜브에 CSFE 1 μL을 추가합니다(최종 농도- 5 μM).
4. 튜브를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터로 10분 동안 배양합니다.
5. 튜브 3 및 4에서는 2.5 μg/mL의 최종 농도에서 HBSS 2% FCS + 안티 CD3 항체의 12mL을 추가합니다. 튜브 3 과 4항 CD3 항체를 사용하여 자극되고, 세포 주기에 미치는 영향을 관찰한다.
6. 튜브 1과 2에서 HBSS 2 % FCS의 12 mL을 추가합니다. 튜브 1과 2의 세포는 자극되지 않습니다.
7. 원심 분리기는 10 °C에서 7 분 동안 370 x g의 모든 튜브를 합니다. 초월체를 폐기합니다.
8. HBSS 2% FCS의 2mL에서 펠릿을 재중단합니다.
9. 결과 용액을 6웰 플레이트의 별도의 우물로 옮기.
10. 37°C에서 세포를 배양하고 3일 동안 5% CO_2를 배양합니다.

5. 셀 염색