접합: 공여 E.coli에서 수용 E.coli로 암피실린 내성을 전달하는 방법
출처: 알렉산더 S. 골드1, 토냐 M. 콜핏스1
1 미생물학학과, 보스턴 대학교 의과대학, 국립 신흥 감염 질병 연구소, 보스턴, MA
1946년 Lederberg와 테이텀에 의해 처음 발견된, 결합은 두 개의 세균세포(1)의 직접적인 물리적 접촉에 의존하는 박테리아…
1. 셋업
- 루리아-베르타니 매체(LB)의 약 1L 오토클레이브. 이 멸균 LB는 0.3 mM 디아미미노피멜산(DAP)을 함유한 LB약 5mL를 만드는 데 사용될 것이다.
- 1X Tet와 0.3mM DAP의 LB 한천 플레이트, 1X Tet만 있는 LB 한천 플레이트, 1X Amp/Tet만 있는 LB 한천 플레이트.
- 일부 글리세롤과 미리 멸균된 플라스틱 파이펫 팁 상자가 가까이 있는지 확인하십시오.
- 미생물과 관련된 작업을 시작하기 전에 70 %의 에탄올로 작업 공간을 살균하십시오. 항상 실험실 코트와 장갑을 포함하여 필요한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
- 완성되면 모든 표면과 장갑을 70% 에탄올로 살균하고 손을 씻으실 수 있습니다.
2. 기증자 및 수령인 균주 준비
- 기증자와 수령인 균주의 5mL 세균 배양을 준비하고 37 °C에서 하룻밤 동안 증가시키고 220 rpm에서 흔들어. 기증자 균주는 0.3 mM DAP와 LB에서 성장해야합니다.
- 두 배양물 1mL(~3000rpm 5분)를 회전시키고 PBS로 셀을 세척합니다.
- 인산염 완충식식염(PBS)의 500μL에서 세포를 재연한다.
3. 컨쥬게이션
- 수신자 세포의 50 μL과 기증자 세포의 50 μL을 마이크로 원심 분리기 튜브에 결합하고 파이펫팅하여 혼합합니다.
- 세포 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양한다. 이렇게 하면 다음 도금 단계 전과 도중 컨쥬게이션의 효율성을 향상시킬 수 있습니다.
- 1X Tet 및 0.3 mM DAP를 가진 천접시에 셀 혼합물의 파이프 100 μL. 접시에 퍼지지 마십시오.
- 1X Tet 및 0.3 mM DAP를 가진 한천 판에 받는 세포 배양의 파이프 100 μL. 접시에 퍼지지 마십시오.
- 37 °C에서 하룻밤 동안 두 플레이트를 배양합니다.
- 멸균 세포 스크레이퍼로 결합 세포 혼합물 및 받는 사람 세포 배양을 긁어냅니다. 세포를 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 PBS의 1mL에서 세포를 재연한다.
- 세포를 소용돌이시키고 부드럽게 아래로 회전 (~ 3000 rpm 5 분).
- PBS의 1 mL에서 세포를 다시 중단합니다.
- 1X Amp/Tet만으로 LB 천판에 접합 반응 세포 혼합물을 플레이트. 이 플레이트에서, 성공적으로 컨쥬게이션을 통해 Amp 저항 유전자를 얻은 수신자 박테리아만이 증가할 것으로 예상된다.
- 수신자 셀을 1X Tet만 으로 LB 한천 플레이트에 플레이트합니다. 이 플레이트에서는 Amp 저항 유전자가 없는 수렴되지 않은 받는 사람 박테리아만이 증가할 것으로 예상됩니다.
- 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 플레이트 에서 단일 콜로니를 선택하고 5mL의 미디어 (220 rpm에서 폭이있는 37 °C)에서 하룻밤 문화를 성장시키는 데 사용합니다.
4. DNA 격리
- DNA 미니프렙에 의한 총 배양량의 4.5mL를 사용하여 이전에 준비된 배양으로부터 DNA를 분리한다.
- 이렇게하려면, 뉴클레아제없는 물의 35 μL을 사용하여 DNA를 엘테.
- 순수 DNA는 약 1.8의 흡광도 비(A260/280)를생성합니다.
- 세균 배양1:1 혼합물과 100% 글리세롤을 만들어 글리세롤 주식을 준비하기 위해 각 배양의 나머지 0.5 mL을 사용하십시오.
- 냉동고 재고를 -80 °C에 보관하십시오.
5. PCR에 의한 플라스미드 전송 컨쥬게이션 확인
- 두 개의 PCR 마스터 믹스를 준비, 앞으로 및 역 프라이머의 다른 세트와 각각, 하나는 암피실린 저항 유전자 내의 500 베이스 쌍 세그먼트를 대상으로하고 다른 가사 유전자 내에서 세그먼트를 대상으로.
- 가사 유전자 프라이머는 DNA 자이라제 B (14)에 대한 인코딩 세균 유전자 내의 DNA 세그먼트를 증폭하도록 설계되었습니다.
- 다음 시약 볼륨은 각 마스터 믹스의 90 μL을 준비하는 데 사용되었습니다.
7.5 μL 10 μM 포워드 프라이머
7.5 μL 10 μM 역 프라이머
2X PCR 마스터 믹스75 μL
- 15 μL 마스터 믹스, 템플릿 DNA의 10 ng 및 25 μL의 최종 부피까지 핵세없는 물을 사용하여 다음 6 개의 PCR 반응을 준비하십시오.
컨쥬게이션 반응 DNA 및 암피실린 프라이머
컨쥬게이션 반응 DNA 및 하우스키핑 프라이머
네거티브 컨트롤 DNA 및 암피실린 프라이머
네거티브 컨트롤 DNA 및 하우스키핑 프라이머
DNA 및 암피실린 프라이머 없음
DNA 및 하우스키핑 프라이머 없음 - 이러한 반응을 98C로 예열된 블록을 PCR 기계로 전송하고 다음 조건에서 열순환을 시작합니다.
98°C 30초
5-10초 동안 98°C의 25-35사이클, 10~30초 동안 45-72°C, KB당 15-30초 동안 72°C
5-10분 동안 72°C
4°C에서 유지 - 6개의 PCR 반응을 모두 1% 아가로즈 젤에 적재하고 ~150V에서 약 20분간 실행합니다.
- UV 조명을 사용하여 PC 제품을 시각화합니다.
대장균(E. coli)과 같은 박테리아 세포는 세포 간에 유전 정보를 전달할 수 있습니다. 접합은 세포 간의 물리적 접촉을 필요로 한다는 점에서 형질도입(transduction) 또는 형질전환(transformation)과 같은 DNA 전달의 다른 메커니즘과 다릅니다.
계속 진행하기 위해서는 생식력 또는 F 인자를 발현하는 공여자 세포와 이 인자를 발현하지 않는 수용 세포(F 마이너스 세포)가 필요합니다. 이 프로세스에는 두 단계가 필요합니다. 첫 번째는 세포 간 직접 접촉의 확립입니다. 이를 위해 기증자 세포는 성 필루스(sex pilus)라고 하는 세포 외 사상 구조를 생성합니다. conjugation은 무성 생식 박테리아에 대한 짝짓기의 한 형태이기 때문에 이런 이름이 붙었지만, 배우자가 교환되지 않고 자손이 형성되지 않기 때문에 진정한 유성 생식이 아니라는 점에 유의해야 합니다.
두 번째 단계는 DNA를 수용 세포로 전달하는 것입니다. 성필루스가 두 세포 사이에 접촉을 이루고 나면, IV형 분비 시스템이라고 하는 도관이 구축되어 DNA를 전달할 수 있게 된다. 그런 다음 기증자 세포는 OriT 또는 전달의 기원으로 알려진 유전 요소의 존재에 따라 선택되는 전달될 염색체 외 DNA를 복제하기 시작합니다. 새로 복제된 DNA의 한쪽 끝은 DNA 단백질 결합을 통해 도관에 끼워집니다. DNA가 더 복제됨에 따라 채널을 통해 펌핑되며, 이는 OriT 가까이에 위치한 유전자에 의해 암호화된 단백질 복합체에 의해 촉진됩니다. DNA가 완전히 전달되면 여분의 염색체 플라스미드를 형성하거나 수용 세포의 염색체에 통합될 수 있습니다. 전달된 DNA의 종말점이 무엇이든, 그것이 암호화하는 유전자는 그런 다음 발현됩니다. 이 유전자 발현은 성공적인 접합을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
예를 들어, 공여자 균주가 암피실린 내성을 발현하고 이를 접합된 DNA를 통해 수용체 박테리아에 전달하지만, 수용자 균주 역시 공여자에 존재하지 않는 테트라사이클린 내성 유전자를 가지고 있는 시나리오를 생각해 보십시오. 이 경우, 세포가 테트라사이클린과 암피실린을 모두 포함하는 LB 배지에 도말될 때, 콜로니는 성공적으로 접합된 박테리아에서만 성장해야 하며, 이는 두 가지 저항성 표현형을 모두 발현하게 됩니다. 성공적인 접합을 추가로 확인하기 위해 이러한 콜로니의 플라스미드 DNA를 수확한 다음 전달된 플라스미드에 특이적인 DNA 부분을 중합효소연쇄반응(PCR)을 사용하여 증폭할 수 있습니다. PCR 산물이 표준 크기의 사다리와 함께 전기영동 겔에서 실행될 때 알려진 크기의 PCR 단편이 겔에서 볼 수 있어야 하며, 이는 성공적인 접합을 더욱 확인합니다. 이 실험에서는 플라스미드를 사용하여 공여자 균주에서 접합을 통해 암피실린 내성 유전자를 테트라사이클린 내성 수용체 균주로 전달합니다. 그 후, 접합을 확인하기 위해 접합 혼합물을 두 항생제를 모두 포함하는 플레이트에서 배양하고 형질전환된 박테리아만 남깁니다. 마지막으로, 성공적인 접합은 PCR로 추가로 확인될 것입니다.
절차를 시작하기 전에 실험복과 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 다음으로, 70% 에탄올을 사용하여 작업 공간을 살균하여 표면을 닦습니다.
이 절차에서 암피실린 내성 유전자는 접합을 통해 WM3064 균주에서 J53 균주로 전달됩니다. 공여체 균주 WM3064는 테트라사이클린과 암피실린에 내성이 있으며 성장하려면 디아미노피멜산(DAP)이 필요합니다. 수용 균주 J53은 테트라사이클린에만 내성이 있으며 DAP가 성장할 필요가 없습니다. 이는 성공적으로 접합된 세포가 테트라사이클린과 암피실린에 내성이 있어야 하며 DAP 없이 성장할 수 있음을 의미합니다.
0.3 millimoles의 DAP를 함유한 LB 5ml에 동결된 donor strain glycerol stock 스크랩을 접종하여 donor strain 배양을 준비합니다. 그런 다음 DAP가 없는 LB 육수 5ml에 동결된 수취인 균주 글리세롤 스톡의 스크랩을 접종하여 수혜자 균주를 준비합니다. 이러한 배양물을 섭씨 37도에서 폭기로 하룻밤 동안 진탕 인큐베이터에서 220RPM으로 진탕하여 성장시킵니다. 배양액이 OD 600 of two로 성장하면 각각에서 1ml의 배양물을 제거하고 이를 두 개의 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 이러한 부분 표본을 3000RPM에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아 세포를 펠릿화합니다. 상등액을 버리고 각 펠릿을 250마이크로리터의 1X PBS로 세척합니다. 샘플을 다시 원심분리하고 상등액을 버린 후 각 펠릿을 500마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다.
접합 절차를 시작하려면 먼저 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 50마이크로리터의 수용 세포와 50마이크로리터의 기증자 세포를 결합하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 다음으로, 수혜 세포 배양 100마이크로리터를 DAP가 포함된 다른 1X 테트라사이클린 플레이트에 피펫팅합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 수용 세포 배양액을 DAP가 포함된 비선택적 한천 플레이트에만 피펫팅하여 음성 대조군을 준비합니다. 그런 다음 접합 및 음극 대조 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.
다음날, 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 집락을 수집하여 접합 플레이트에서 세포를 수확합니다. 그런 다음 콜로니를 1.5mL의 1X PBS가 들어 있는 멸균 1리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 과정을 반복하여 다른 플레이트에서 수혜자 세포를 수집합니다.
그런 다음 혼합할 샘플을 소용돌이치십시오. 혼합 후 튜브를 원심분리기로 옮겨 세포를 부드럽게 펠릿화합니다. 상등액을 버리고 세포 펠릿을 1ml의 PBS로 세척하고 튜브를 와류로 만들어 세포를 재현탁시킵니다. 원심분리를 통해 세포를 다시 펠릿화합니다. 상등액을 다시 버리고 두 세포 펠릿을 1ml의 PBS에 재현탁합니다. 이제 멸균 피펫 팁을 사용하여 1X 테트라사이클린과 1X 암피실린이 포함된 DAP가 없는 LB 한천 플레이트에 접합 반응 세포 혼합물 100마이크로리터를 플레이트화합니다. 1X 테트라사이클린과 1X 암피실린을 함유한 DAP가 없는 다른 LB 한천 플레이트에 PBS에서 동일한 세포 혼합물을 10배 희석하여 100마이크로리터를 사용하여 도금 방법을 반복합니다.
마지막으로, 100 마이크로리터의 음성 대조군 세포 혼합물을 1X 테트라사이클린만 함유된 단일 LB 한천 플레이트에 피펫팅합니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한 후에는 군체를 볼 수 있어야 합니다. 멸균 피펫 팁을 사용하여 접합 반응 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 두 항생제를 모두 포함하는 5ml의 선택적 LB 배지가 들어 있는 튜브에 추가합니다. 그런 다음 수용자 세포판에서 단일 콜로니를 선택하여 콜로니 분리를 반복합니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 220RPM의 폭기로 이러한 배양을 성장시킵니다.
다음 날, 70% 에탄올로 벤치 상단을 닦고 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. DNA 미니 준비 키트를 사용하여 4에서 DNA를 분리합니다. 제조업체의 지침에 따라 각 배양액 5 밀리리터. DNA 미니 전처리를 완료한 후 35마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 DNA를 용리합니다. 마지막으로 나머지 0을 사용합니다. 100% 글리세롤 0.5ml를 첨가하여 1:1 희석을 위해 100% 글리세롤 1ml를 제조하기 위해 각 배양액당 5ml를 준비합니다. 이 부분 표본을 섭씨 영하 80도에 놓고 필요할 때까지 보관하십시오.
PCR에 의한 성공적인 접합을 확인하려면 먼저 마이크로 원심분리 튜브에 75마이크로리터의 2X PCR 마스터 믹스를 첨가하여 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 그런 다음 플라스미드에서 암피실린 저항성 유전자를 증폭하도록 설계된 10 마이크로몰 전방 프라이머와 10 마이크로몰 역 프라이머를 각각 7.5마이크로리터씩 추가합니다. 다음으로, 75마이크로리터의 2X PCR 마스터 믹스를 마이크로 원심분리 튜브에 첨가한 다음 하우스키핑 유전자(이 경우 DNA 자이라제 B)를 증폭하도록 설계된 10마이크로몰 전방 프라이머 및 10마이크로몰 역 프라이머 각각 7.5마이크로리터를 추가하여 두 번째 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.
이제 첫 번째 마스터 믹스 15마이크로리터를 PCR 튜브에 추가한 다음 10나노그램을 추가합니다. 약 2마이크로리터의 주형 실험용 DNA를 동일한 튜브에 넣습니다. 뉴클레아제가 없는 물로 반응을 최종 부피인 25 microlit까지 가져옵니다. 이 단계를 반복하여 나머지 5개의 반응을 생성하여 튜브에 여기에 표시된 성분이 포함되도록 합니다. 이제 이러한 반응을 블록이 섭씨 98도로 예열된 상태에서 열 순환기로 전송한 다음 프로그램을 시작합니다. PCR 완료 후 기계에서 튜브를 제거합니다. 그런 다음, 2마이크로리터의 로딩 염료 2마이크로리터와 분자량 마커 4마이크로리터와 혼합된 각 반응의 2마이크로리터를 1% 아가로스 겔의 연속 웰에 로드합니다. 젤을 150 분 동안 20 볼트에서 작동하도록 설정하십시오. 마지막으로 UV 조명기를 사용하여 젤을 시각화합니다.
이 실험에서는 PCR을 통해 접합을 통한 암피실린 저항성 유전자의 성공적인 전달을 확인했습니다. 여기서, 대략 500 염기쌍 크기의 띠가 접합된 DNA와 암피실린 프라이머를 포함하는 웰에서 관찰되어야 하며, 이 예에서는 웰 2개가 있습니다. 하우스키핑 유전자인 DNA gyrase B를 각각 접합 DNA와 수용 세포 DNA와 함께 웰 3과 5에 적재했습니다. 이 웰에서 관찰된 밴드는 DNA 템플릿이 존재하고 PCR이 성공적이었는지 확인하기 위해 양성 대조군으로 작용합니다. 수용 세포는 암피실린 내성이 없기 때문에 수용 세포 DNA와 암피실린 프라이머 쌍(이 예에서는 4)에 대한 반응을 포함하는 웰에서 밴드가 관찰되어서는 안 됩니다. 또한, 주형 DNA가 결여된 반응에서 어떤 밴드도 관찰되어서는 안 되며, 여기에서 웰 6과 7이 관찰됩니다. 이러한 조건이 충족되면 암피실린 내성 유전자의 성공적인 전달이 확인되어 대장균의 WM3064 균주에서 J53 대장균 균주로 암피실린 내성이 부여됩니다.
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Q1: What is the sex pilus and what role does it play in bacterial conjugation?
The sex pilus is an extracellular filamentous structure generated by the donor cell to establish direct cell-to-cell contact with the recipient cell. This physical contact is essential for conjugation to proceed. The sex pilus is encoded by the F (fertility) factor and serves as the initial bridge between donor and recipient cells before DNA transfer begins.
Q2: How does the Type IV secretion system facilitate DNA transfer during conjugation?
After the sex pilus establishes contact, a conduit called the Type IV secretion system is built between the two cells. This multiprotein complex allows DNA to be actively transported from the donor to the recipient. The system works with coupling proteins to pump replicated DNA through the channel, enabling the transfer of genetic material encoding traits like ampicillin resistance.
Q3: Why is selective plating used to confirm successful conjugation in this experiment?
Selective plating uses antibiotics to isolate only successfully conjugated cells. The donor strain requires diaminopimelic acid (DAP) to survive, while the recipient lacks ampicillin resistance. Plating on media with both tetracycline and ampicillin without DAP eliminates donor cells and non-conjugated recipients, leaving only recipient cells that acquired ampicillin resistance through conjugation.
Q4: What is the origin of transfer (OriT) and why is it important for conjugation?
The origin of transfer (OriT) is a genetic element on the plasmid that signals where DNA replication and transfer should begin. A relaxase enzyme cleaves at the nic site within the OriT sequence and covalently attaches to the DNA strand, initiating the formation of the relaxosome complex. This complex is essential for directing which DNA gets replicated and transferred to the recipient cell.
Q5: How does PCR confirm the successful transfer of ampicillin resistance genes?
PCR amplifies a specific DNA sequence from the transferred plasmid using primers designed for the ampicillin resistance gene. Successfully conjugated cells contain this gene and produce a visible band of known size on an agarose gel. A housekeeping gene serves as a positive control, while recipient-only DNA should show no amplification, confirming the resistance gene was successfully transferred.
Q6: How does conjugation differ from other bacterial DNA transfer mechanisms?
Conjugation requires direct physical contact between donor and recipient cells through the sex pilus, unlike transduction or transformation. It is unidirectional, with DNA flowing from donor to recipient, and naturally occurs in bacteria. This process has contributed to the spread of antibiotic resistance and can be manipulated in laboratory settings using selective pressures for horizontal gene transfer.
Q7: What happens to transferred DNA once it enters the recipient cell?
Once transferred, the DNA can either form an extrachromosomal plasmid or integrate into the recipient cell's chromosome. Regardless of its final location, the genes encoded on the transferred DNA are then expressed in the recipient cell. This gene expression produces the new phenotype, such as ampicillin resistance, which can be detected through selective plating or PCR analysis.