접합: 공여 E.coli에서 수용 E.coli로 암피실린 내성을 전달하는 방법

1. 셋업

1. 루리아-베르타니 매체(LB)의 약 1L 오토클레이브. 이 멸균 LB는 0.3 mM 디아미미노피멜산(DAP)을 함유한 LB약 5mL를 만드는 데 사용될 것이다.
2. 1X Tet와 0.3mM DAP의 LB 한천 플레이트, 1X Tet만 있는 LB 한천 플레이트, 1X Amp/Tet만 있는 LB 한천 플레이트.
3. 일부 글리세롤과 미리 멸균된 플라스틱 파이펫 팁 상자가 가까이 있는지 확인하십시오.
4. 미생물과 관련된 작업을 시작하기 전에 70 %의 에탄올로 작업 공간을 살균하십시오. 항상 실험실 코트와 장갑을 포함하여 필요한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
5. 완성되면 모든 표면과 장갑을 70% 에탄올로 살균하고 손을 씻으실 수 있습니다.

2. 기증자 및 수령인 균주 준비

1. 기증자와 수령인 균주의 5mL 세균 배양을 준비하고 37 °C에서 하룻밤 동안 증가시키고 220 rpm에서 흔들어. 기증자 균주는 0.3 mM DAP와 LB에서 성장해야합니다.
2. 두 배양물 1mL(~3000rpm 5분)를 회전시키고 PBS로 셀을 세척합니다.
3. 인산염 완충식식염(PBS)의 500μL에서 세포를 재연한다.

3. 컨쥬게이션

1. 수신자 세포의 50 μL과 기증자 세포의 50 μL을 마이크로 원심 분리기 튜브에 결합하고 파이펫팅하여 혼합합니다.
2. 세포 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양한다. 이렇게 하면 다음 도금 단계 전과 도중 컨쥬게이션의 효율성을 향상시킬 수 있습니다.
3. 1X Tet 및 0.3 mM DAP를 가진 천접시에 셀 혼합물의 파이프 100 μL. 접시에 퍼지지 마십시오.
4. 1X Tet 및 0.3 mM DAP를 가진 한천 판에 받는 세포 배양의 파이프 100 μL. 접시에 퍼지지 마십시오.
5. 37 °C에서 하룻밤 동안 두 플레이트를 배양합니다.
6. 멸균 세포 스크레이퍼로 결합 세포 혼합물 및 받는 사람 세포 배양을 긁어냅니다. 세포를 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 PBS의 1mL에서 세포를 재연한다.
7. 세포를 소용돌이시키고 부드럽게 아래로 회전 (~ 3000 rpm 5 분).
8. PBS의 1 mL에서 세포를 다시 중단합니다.
9. 1X Amp/Tet만으로 LB 천판에 접합 반응 세포 혼합물을 플레이트. 이 플레이트에서, 성공적으로 컨쥬게이션을 통해 Amp 저항 유전자를 얻은 수신자 박테리아만이 증가할 것으로 예상된다.
10. 수신자 셀을 1X Tet만 으로 LB 한천 플레이트에 플레이트합니다. 이 플레이트에서는 Amp 저항 유전자가 없는 수렴되지 않은 받는 사람 박테리아만이 증가할 것으로 예상됩니다.
11. 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
12. 플레이트 에서 단일 콜로니를 선택하고 5mL의 미디어 (220 rpm에서 폭이있는 37 °C)에서 하룻밤 문화를 성장시키는 데 사용합니다.

4. DNA 격리

1. DNA 미니프렙에 의한 총 배양량의 4.5mL를 사용하여 이전에 준비된 배양으로부터 DNA를 분리한다.
2. 이렇게하려면, 뉴클레아제없는 물의 35 μL을 사용하여 DNA를 엘테.
3. 순수 DNA는 약 1.8의 흡광도 비(A_260/280)를생성합니다.
4. 세균 배양1:1 혼합물과 100% 글리세롤을 만들어 글리세롤 주식을 준비하기 위해 각 배양의 나머지 0.5 mL을 사용하십시오.
5. 냉동고 재고를 -80 °C에 보관하십시오.

5. PCR에 의한 플라스미드 전송 컨쥬게이션 확인

1. 두 개의 PCR 마스터 믹스를 준비, 앞으로 및 역 프라이머의 다른 세트와 각각, 하나는 암피실린 저항 유전자 내의 500 베이스 쌍 세그먼트를 대상으로하고 다른 가사 유전자 내에서 세그먼트를 대상으로.
   1. 가사 유전자 프라이머는 DNA 자이라제 B (14)에 대한 인코딩 세균 유전자 내의 DNA 세그먼트를 증폭하도록 설계되었습니다.
   2. 다음 시약 볼륨은 각 마스터 믹스의 90 μL을 준비하는 데 사용되었습니다.
      7.5 μL 10 μM 포워드 프라이머
      7.5 μL 10 μM 역 프라이머
      2X PCR 마스터 믹스75 μL
2. 15 μL 마스터 믹스, 템플릿 DNA의 10 ng 및 25 μL의 최종 부피까지 핵세없는 물을 사용하여 다음 6 개의 PCR 반응을 준비하십시오.
   컨쥬게이션 반응 DNA 및 암피실린 프라이머
   컨쥬게이션 반응 DNA 및 하우스키핑 프라이머
   네거티브 컨트롤 DNA 및 암피실린 프라이머
   네거티브 컨트롤 DNA 및 하우스키핑 프라이머
   DNA 및 암피실린 프라이머 없음
   DNA 및 하우스키핑 프라이머 없음
3. 이러한 반응을 98C로 예열된 블록을 PCR 기계로 전송하고 다음 조건에서 열순환을 시작합니다.
   98°C 30초
   5-10초 동안 98°C의 25-35사이클, 10~30초 동안 45-72°C, KB당 15-30초 동안 72°C
   5-10분 동안 72°C
   4°C에서 유지
4. 6개의 PCR 반응을 모두 1% 아가로즈 젤에 적재하고 ~150V에서 약 20분간 실행합니다.
5. UV 조명을 사용하여 PC 제품을 시각화합니다.