생체내 칼슘 ^{2 +} - 허니 비에 강한 학습하는 동안 버섯 바디 뉴런의 영상

꿀벌은 appetitive 후각 학습 패러다임 (당 시설)에서 시설 수 있습니다. 자극과 같은 냄새를 사용하여, 우리는 동시에 칼슘 이미징이 버섯 신체 뉴런에서 냄새 evoked 활동을 측정하는 데 사용하는 동안 기록되는 행동 방식을 설립

이 절차는 꿀벌을 기록 챔버에 고정하는 것으로 시작됩니다. 머리낭에서 큐티클 조각을 제거하여 뇌의 선택된 구조를 염색합니다. 염색된 뉴런의 칼슘 신호는 광시야 이미징 설정을 사용하여 생체 내에서 기록됩니다.

이미징하는 동안 꿀벌은 냄새나 자당이 안테나로 전달되어 자극을 받을 수 있습니다. 이런 식으로 꿀벌은 냄새에 반응하여 주둥이를 확장하도록 조건화될 수 있습니다. 확장 반응은 M 17 근육의 근전도 기록을 사용하여 모니터링됩니다.

이미징 실험이 끝나면 컨포칼 현미경을 사용하여 염색된 구조를 더 자세히 조사하기 위해 뇌를 절부합니다. 안녕하세요, 저는 rdo Mansel 연구소의 Melanie입니다. 안녕하세요, 저도 Mansel Lab의 Anya입니다.

오늘 우리는 생체 내 칼슘 이미징과 꿀벌 버섯 몸체를 위한 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 꿀벌 뇌의 후각 코딩 및 학습 관련 가소성을 연구합니다. 시작하겠습니다.

벌통 입구에서 꿀벌 채집자를 잡는 것으로 시작한 다음 얼음 위에서 식혀 움직이지 못하게 하십시오. 다음으로, 꿀벌을 플렉시 유리 기록 챔버에 장착합니다. 저융점 하드 왁스를 사용하여 눈과 흉부를 벽에 고정합니다.

모두 끝에서 유리 모세관을 부수어 10미크론의 직경을 얻습니다. 모세관 끝을 URA 2 덱스트린과 고정성 로댕 덱스트린의 10 대 1 혼합물로 구성된 d 페이스트로 덮습니다. 준비된 모세관은 염색에 사용됩니다.

염색 절차를 시작하려면 먼저 코아네로 더듬이를 고정시킵니다. 큐티클 조각을 제거하고 땀샘과 기관을 옆으로 밀어 버섯 몸체에 접근할 수 있도록 하여 뇌 위의 머리 캡슐을 엽니다. 종이 한 장을 사용하여 머리 캡슐 내부의 혈 림프를 흡수합니다.

버섯체 뉴런을 염색하려면 모세혈관을 뉴런의 체세포 또는 수지상 영역에 주입합니다. 그런 다음 헤드 캡슐의 큐티클 조각을 복원하고 안테나를 풉니다. 마지막으로 꿀벌에게 자당 용액 30%를 먹이고 젖은 키친 타월로 덮인 스티로폼 상자에 최소 4시간 동안 또는 섭씨 20도에서 밤새 보관하십시오.

B 제제가 완료되면 생체 내 이미징을 시작할 수 있습니다. 시작하려면 녹음실에 부착된 스펀지를 사용하여 꿀벌이 지나가는 것을 방지하고 복부에 대고 누릅니다. 이제 꿀벌의 안테나를 요오아네로 고정하여 식도의 펌핑으로 인해 뇌가 움직이는 것을 방지합니다.

소음순 위의 큐티클을 작게 절개하고 식도와 주변의 단단한 구조를 조심스럽게 빼낸 다음 두 가지 성분인 실리콘으로 덮습니다. 다음으로, 바늘을 사용하여 소음순의 각도기 근육에서 얻은 전기도를 기록하는 데 사용되는 와이어 전극을 삽입하기 위한 구멍을 만듭니다. 뇌 위의 큐티클 조각, 기관 및 땀샘을 제거합니다.

종이 한 장을 사용하여 머리 캡슐 내부의 헤모를 흡수하여 M 17의 적전도를 기록합니다. 입 부분에 가까운 근육에 구리선을 주입합니다. 접지 전극을 눈에 주입합니다.

이제 헤드 캡슐을 2액형 실리콘으로 채웁니다. 뇌가 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 현미경 스테이지에 꿀벌을 놓고 실리콘 표면에 물 한 방울을 놓습니다.

현미경의 딥 대물렌즈를 액적에 담근 다음 스테이지 뉴런에 초점을 맞춥니다. 생체 내 이미징을 위한 준비가 완료되었으므로 이제 냄새 자극 및 신호 기록에 대해 설명할 수 있습니다. 꿀벌에게 냄새 자극을 전달하기 위해 우리는 컴퓨터로 제어되는 맞춤형 후각계를 사용하여 냄새 물질을 일정한 기류로 희석합니다.

안테나를 향한 냄새 자극은 냄새 포화 공기의 3초 펄스로 구성됩니다. 칼슘 이미징의 경우, zes 형광 현미경에 장착된 til photonics 이미징 설정을 사용하여 실온에서 5헤르츠의 샘플링 속도로 이미지를 기록합니다. 칼슘 신호는 Ango CCD 카메라가 장착된 X 60 0.9 W Olympus dip Objective를 통해 기록되며, 각 측정은 10초 동안 지속됩니다.

근육 전위는 잔디 증폭기로 증폭되고 아날로그 디지털 변환기로 기록 및 디지털화됩니다. M 17의 녹음은 신호 녹음이 완료된 학습과 관련된 행동 반응을 모니터링하는 데 사용되며, 이제 형태학적 분석 및 재구성으로 이동할 수 있습니다. 백필 중에 사용되는 두 염료는 동일한 분자량을 갖기 때문입니다.

그들은 뉴런에 같은 위치에 있습니다. 광시야 이미징은 공간 해상도가 제한되어 있으므로 컨포칼 주사 현미경을 사용하여 염색된 구조를 조사합니다. 실험 후에, 첫째로 두뇌를 해부하고 다음날 4°C에 4%포름알데히드에 밤새 고치고, PBS에서 헹구고 그 후에 에탄올 단계에서 50%70%90%99%와 2 번 10%에 있는 10 분에 있는 그것을 탈수하십시오메틸 살리실레이트 덮개의 한 방울을 가진 홈이 있는 목표 활주에 두뇌를 두십시오, 그것을 밀어 넣은 다음 컨포칼 스캐닝 현미경의 현미경 스테이지에 놓습니다.

공기 대물 렌즈와 4개의 마이크로미터 광학 섹션에서 1.1-1.2 디지털 줌으로 뇌를 스캔합니다. 여기에서 우리는 더듬이의 냄새 자극에 대한 버섯 몸체 외적 뉴런의 반응을 60 x 대물렌즈를 통해 기록되고 거짓 색상으로 시각화되는 것을 볼 수 있습니다. 왼쪽의 빨간색 사각형은 냄새 자극의 지속성을 나타냅니다.

실험이 끝나면 뇌를 해부하고 20배 배율의 컨포칼 현미경을 사용하여 염색 구조를 더 자세히 조사합니다. 그래서 우리는 후각 학습 중에 꿀벌의 버섯 몸체 뉴런을 이미지화하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 빛에 민감한 염료와 관련된 실험은 어두운 곳에서 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다. 잘가요.