Microfluidic Perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 Perifusion 시스템

본 발표에서는 인슐린 분비견에 대한 반응으로 췌장 구멍의 동적 인슐린 분비, 칼슘 유입 및 미토콘드리아 전위 변화를 동시에 측정할 수 있는 미세유체 기반 눈꺼풀 관류 시스템을 소개합니다. 관류 시스템은 3층 미세유체 장치, 주사기 펌프 및 분획 수집기 인슐린으로 구성됩니다. 분비물에 의한 칼슘 유입 및 미토콘드리아 전위는 형광 현미경 설정을 사용하여 이미지화됩니다.

안녕하세요, 제 이름은 시카고 일리노이 대학교 이식 외과의 Val Holter 박사 실험실의 Waller인 Ola입니다. 안녕하세요, 저는 10월의 연구실에서 온 Don Lee입니다. 안녕하세요, 역시 Dr.Al Holster의 연구실에서 온 Tricia Hart입니다.

오늘은 선형 포도당 구배를 사용하여 동시에 눈꺼풀을 촬영하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 아일릿 비주얼과 기능을 연구했습니다. 시작하겠습니다.

이 절차에 사용되는 미세유체 장치는 표준 포토리소그래피에 의해 생성된 3개의 경화된 PDMS 층으로 조립됩니다. 실리콘 마스터에서 생성된 첫 번째 층에는 깊이 150마이크로미터, 직경 500마이크로미터의 구멍을 부드럽게 제자리에 고정하는 미세유체 장치의 웰이 있습니다. 두 번째 레이어에는 높이 500마이크로미터, 너비 2mm의 채널이 있습니다.

채널의 중간은 용액의 더 나은 교환을 위해 흐름을 분산시키기 위해 확장됩니다 장치 내부에서는 레이어 중간에 높이 3mm, 너비 7mm의 구멍을 뚫어 잘 만듭니다. 세 번째 층은 PDMS의 두꺼운 슬래브입니다. 이 층을 준비하려면 채널의 입구와 출구와 정렬되는 양쪽에 작은 구멍을 뚫습니다.

두 번째 층에서 세 개의 층이 모두 생성되면 첫 번째 층은 우물이 위를 향하도록 유리 슬라이드에 결합됩니다. 그런 다음 두 번째 레이어는 채널 간격이 위로 당겨 첫 번째 레이어에 결합됩니다. 마지막으로 세 번째 레이어가 두 번째 레이어에 결합됩니다.

층이 접합되면 장치를 실험에 사용할 준비가 된 것입니다. 70% 에탄올로 채워진 10밀리리터 주사기를 사용하여 튜브의 Tai가 있는 장치의 입구 포트에 연결하고 장치 채널을 통해 에탄올을 흐르게 하여 미세유체 장치를 살균합니다. 그런 다음 동일한 설정 흐름을 사용하여 탈이온수를 사용하여 에탄올을 씻어냅니다.

장치가 멸균되면 가열된 현미경 s에 놓습니다.tage tigon 튜브를 사용하여 고혈당 및 저혈당 용액이 들어 있는 주사기 펌프를 Y 커넥터에 연결합니다. 그런 다음 미세 유체 장치의 입구에 연결하십시오. 미세유체 장치의 배출구를 분획 수집기에 연결합니다.

튜브가 섭씨 37도의 핫 플레이트에 놓여 있는지 확인하십시오. 실험 내내 용액을 생리학적 온도로 유지하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, 실험실 보기 프로그램을 사용하여 실험 중 미세유체 네트워크를 통해 관류될 포도당 구배를 시작합니다.

이 소프트웨어는 두 포도당 용액의 유속을 변경합니다. 주사기 펌프를 제어함으로써 여기에서 선형, 종 모양 및 정사각형 모양의 포도당 구배 프로파일과 같은 다양한 포도당 구배 프로파일을 생성할 수 있습니다. 이 실험에서 표시된 계산된 예상 값과 비교하여 2 밀리몰에서 25 밀리몰 포도당의 선형 구배는 두 포도당 용액의 분당 0.01 밀리리터의 다양한 유속과 용액이 혼합된 후 장치에 유입되는 분당 0.25 밀리리터의 일정한 유속으로 사용됩니다.

적절한 그래디언트 프로파일을 선택했으면 그래디언트의 안정성을 테스트합니다. 먼저 그래디언트 시스템을 시작합니다. 그런 다음 분획 분취기를 시작하고 1ml eend orph tubes에서 8개의 perfuse를 수집합니다.

그런 다음 혈당계를 사용하여 Excel을 사용하여 각 튜브의 포도당 농도를 테스트합니다. 혈당계에서 얻은 결과를 분석합니다. 다음으로, 고포도당 주사기를 분당 1밀리리터의 속도로 장치를 통해 Krebs 링거 버퍼 PERFUSE 50밀리리터에 0.5% BSA 용액이 포함된 주사기로 교체합니다.

이렇게 하면 인슐린이 미세채널 벽으로 비특이적으로 흡수되는 것을 방지하여 나중에 BSA로 관류한 후 분비된 인슐린 수치를 측정할 때 정확성을 보장할 수 있습니다. 고포도당 용액 reus로 교체하십시오. 칼슘 지시약 염료 피라 2:00 AM과 미토콘드리아 전위 지시자 염료 반추위 1 2 3을 포함하는 2 밀리 몰 포도당 크렙스 링거 버퍼에 25-30 개의 엄선 된 마우스 구멍을 매달아 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양합니다.

배양 후, 관류 시스템에서 장치를 분리하고 섬을 포함하는 피펫 끝을 입구 포트에 삽입하여 구멍을 미세유체 장치에 조심스럽게 로드하고 로딩 후 섬을 천천히 분배한 다음 장치를 관류 시스템에 다시 연결합니다. 거품이 생기지 않도록 주의하세요. 다음으로, 주사기 펌프를 시작하여 2개의 밀리몰 포도당이 포함된 KRB로 구멍을 관류하기 시작합니다.

이 단계는 매체에서 과도한 염료를 세척하고 여기 및 방출 필터 세트와 실험 중에 사용할 노출 시간을 지정합니다. 그런 다음 분획 수집기를 1분 간격으로 수집하도록 설정하고 파라가 저포도당 용액이 있는 구멍을 사용합니다. 간단한 PCI 이미징 소프트웨어의 관심 영역 또는 ROI 도구를 사용하여 이미징할 영역 또는 구멍을 정의할 수 있습니다.

또한 세포를 10분 동안 세척한 후 뺄 배경 영역에 동그라미를 치고 포도당 구배 분획 수집기를 시작한 다음 타임 랩스 이미징을 시작합니다. 30분 후 소프트웨어와 고혈당 주사기 펌프를 끕니다. 높은 포도당의 영향을 씻어내기 위해 낮은 포도당으로 계속 관류하십시오.

10분 후 주사기 펌프를 꺼서 저혈당의 흐름을 멈춥니다. 관류 후 분석을 위해 데이터를 Excel로 내보냅니다. perfu eight로 분비되는 인슐린의 양은 ELA 마우스 구멍에 의해 결정될 수 있습니다.

여기에 나타난 바와 같이 2 내지 25 밀리몰 포도당의 선형 구배로 관류되었다. 칼슘 유입과 인슐린 분비는 6밀리몰에 해당하는 약 13분의 관류 후에 유발됩니다. 포도당. 미토콘드리아 전위의 변화는 약 11분에서 예상했던 대로 더 일찍 볼 수 있습니다.

이 데이터는 아일릿 생리학을 특성화하기 위해 이 미세유체 네트워크를 사용하는 이점을 보여줍니다. 우리는 방금 작은 구멍 생리학 연구를 위해 미세유체 파라 융합 장치를 사용하는 방법을 보여주었습니다. 이 절차를 수행할 때 실험 중에 구멍이 움직일 수 있으므로 장치에 기포가 없는지 확인하는 것이 중요합니다.

또한 flury는 구멍을 방해하지 않고 분당 최대 1ml까지 조정할 수 있습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.