Name: Microfluidic Perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 Perifusion 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 배우세요 마이크로플루이딩 퍼퓨전 장치를 이용한 다중 파라메트릭 아일릿 분석법으로, 인슐린 분비 역학과 칼슘 유입 및 미토콘드리아 전위 변화를 동시에 측정합니다. 이 방법은 당뇨병 및 대사 질환 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 Adeola Adewola, NIH / NCRR (U42RR023245) 호세 Oberholzer하고, 시카고 당뇨병 프로젝트 AAUW 국제 친교에 의해 지원되었다.

3 층 microfluidic의 perifusion 장치의 A.의 Microfabrication 하단 그럼 마스터 프로토콜 (150 μm의 깊은 우물) <ol><li> 필요한 경우 면도날을 사용하여 웨이퍼를 청소합니다. 아세톤, 메탄올과 IPA로 닦으십시오. 30 S. 50 왓츠에서 플라즈마 처리를 수행 </li><li> 스핀 SU8 - 100 @ 2000 RPM. [1 단계 : 500 RPM, 10 S, 100 RPM / s의 2 단계 : 2000 RPM, 30 S, 300 RPM / S]. [참고 : SU8 스피닝 후 핀셋으로 웨이퍼를 보유하지] </li><li> 소프트 베이킹 65 웨이퍼 ° C 20 분 및 95 °에서 50 분 C. </li><li> 웨이퍼는 원하는 마스크를 통해 자외선에 노출됩니다. 150 μm의 높이에 대한 선량 650 MJ / cm 2입니다. </li><li> 포스트 노출은 65에서 웨이퍼를 구워 ° 1 분 및 95에서 C ° 12 분 C. </li><li> 15 분 SU8 개발자의 웨이퍼를 개발. </li></ol> Microchannel 마스터 프로토콜 (500 μm의 깊은 우물) <ol><li> 필요한 경우 면도날을 사용하여 웨이퍼를 청소합니다. 아세톤, 메탄올과 IPA로 닦으십시오. 30 S. 50 왓츠에서 플라즈마 처리를 수행 </li><li> 스핀 SU8 - 2150 @ 1000 RPM. [1 단계 : 500 RPM, 10 S, 100 RPM / s의 2 단계 : 1000 RPM, 30 S, 300 RPM / S]. </li><li> 소프트 베이킹 65 웨이퍼 ° C 15 분 및 95 °에서 2 시간 30 분 C. </li><li> 웨이퍼는 원하는 마스크를 통해 자외선에 노출됩니다. 650 μm의 높이에 대한 노출 선량은 685 MJ / cm 2입니다. </li><li> 포스트 노출은 65에서 웨이퍼를 구워 ° 5 분 및 95에서 C ° ~ 35 분 C. </li><li> 20-30 분 SU8 개발자의 웨이퍼를 개발. </li></ol> PDMS 솔루션 준비 <ol><li> Polydimethylsiloxane (PDMS) 솔루션은 철저하게 표준 Sylgard 184 키트의 치료 요원 1 일부로 실리콘 탄성체의 10 부분을 혼합하여 준비가되어 있습니다. </li><li> 혼합 과정에서 PDMS 솔루션에서 생성된 거품은 진공 건조기를 사용하여 제거됩니다. </li><li> 거품없는 PDMS 솔루션은 천천히 SU8 마스터와 세 번째 레이어에 빈 페트리 접시에 적절합니다. </li><li> 뜨거운 접시의 온도가 75로 설정되어 ° C와 PDMS는 2 시간이 온도에서 치료됩니다 </li><li> 인레츠, 콘센트 및 교환 우물은 적절한 크기의 구멍 구멍을 뚫는를 사용하여 밖으로 펀치입니다. </li><li> 레이어는 휴대용 플라즈마 장치를 사용하여 유리 슬라이드 (크기 0.1 ㎜)에 함께 결합하고 있습니다. </li></ol> B. 실험 설정 <ol><li> 마이크로 장치를 통해 흐름을 70 % 에탄올은 소독 수 있습니다. 흐름 DI 물 에탄올을 씻어. microchannel 벽에 인슐린 이외의 구체적인 흡착을 방지하기 위해 장치를 통해 0.5 % BSA의 50 ML을 Perfuse. </li><li> 포도당 램프 기울기와 펌프는 그라디언트가 안정되어 있는지 확인하기 위해 테스트하는 주사기와 통신 LabView 소프트웨어에 의해 생성된 기타 관련 그라디언트. </li><li> 25-30 쥐 아일 레츠가 37 ° C에서 30 분 5 μm의의 Fura-2/AM (칼슘 표시기, 분자 프로브, CA) 및 2.5 μm의의 Rhodamine 123 (Rh123, mitochondrial 가능성 표시기, 시그마, MO)와 incubated되었습니다 이 MM 포도당을 포함한 크렙스 - 링어 버퍼 (KRB) </li><li> 마우스 아일 레츠는 신중하게 유입 포트를 통해 microfluidic perifusion 장치로 pipetted 있습니다. </li><li> microfluidic 네트워크는 다음 Tygon 관 그리고 Y - 커넥터 및 분획 수집기에 콘센트를 사용하여 주사기 펌프에 입구를 연결하여 설정합니다. 장치는 현미경에서 가열 단계 (37 ° C)에 자리하고 유입 튜브는 37 챔버 및 솔루션의 온도를 유지하기 위해 열판에서 가열 ° C. </li><li> 즉시 설치 후, 쥐 아일 레츠는 KRB 그런 다음 10 분 25 분 포도당 램프 (2mM 25mM) 2 MM 포도당이 포함된 함께 perifused 있습니다. </li><li> 시간 경과 이미지 SimplePCI 소프트웨어에 의해 매 15 s를 수집하고 분석합니다. perifusate 또한 엘리사 키트를 사용하여 인슐린 분비를 분석하기 위해 분획 수집기를 사용하여 매 순간을 수집합니다. </li></ol> 대표 결과 마우스 아일 레츠는 2-25 MM 포도당의 선형 그라디언트로 perifused되었습니다. 그림 1에 표시된, 칼슘 유입 및 인슐린 분비는 6 MM 포도당에 해당하는 perifusion 13 분 후에 실행됩니다. Mitochondrial 잠재력의 변화는 약 11 분, 이전에 예상대로 볼 수 있습니다. 이 데이터는 아일릿 생리 특징이 microfluidic 네트워크를 사용하는 장점을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/1649/1649fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 세포 자극을 아일릿하는 생리 반응.

<ol><li>Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+for+multimodal+characterization+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets.</a> Lab Chip. 9, 97-106 (2009).</li>
</ol>

전통 아일릿 perifusion 시스템 (macroscale 및 microscale) 설정 및 디자인, 높은 기술적 요구 사항과 시스템의 사용자 규정된 화학 그라디언트를 만들 어려움 복잡 등 일부 제한이 있습니다. 여기에서 설명한 microfluidic perifusion 시스템 설계 및 제조의 간단한 기하학 이러한 한계를 극복. 더 중요한 것은,이 시스템은 아일릿 생리 연구를 수있는 유일한 도구로 제공하는 형광 이미징 접근 방식과 통합될 수 있습니다. 높은 신호 대 잡음 비율 이러한 형광 신호의 공간적 시간적 해상도 - 시연 시스템입니다. 현재 프로토 타입 장치도 하나의 칩에 여러 perifusion 설정을 보유하고 광범위한 애플 리케이션을 위해 microenvironments의 다른 유형을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>60ml 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 형광 염료</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine123 형광 염료</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30&quot; 실리콘 튜브</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16 x 1/8in</td></tr><tr><td>1.5ml Eppendorf 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y-커넥터</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16&amp;#8221; &amp;amp; 4mm</td></tr><tr><td>주사기 커넥터</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>female luer plug 1/16&amp;#8221;</td></tr><tr><td>직선 커넥터</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16&amp;#8221;</td></tr><tr><td>엘보우 커넥터</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>1/16&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Havard 주사기 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perifusion 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열판(Hot plate)</td><td>PMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>온도계</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분획 수집기</td><td>Gibson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫기</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>전하결합소자(CCD) 카메라</td><td>QImaging</td><td></td><td>Retiga-SRV, Fast 1394</td></tr></tbody></table>

microfluidic perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 perifusion 시스템

A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device

microfluidic 아일릿 perifusion 장치가 여러 아일 레츠와 칼슘 유입과 mitochondrial 잠재적인 변화 동시 형광 이미지의 역동적인 인슐린 분비의 평가를 위해 개발되었습니다. 이 장치는 세 계층으로 구성되어 있습니다 : 첫 번째 레이어는 아일 레츠의 노출 표면적을 흐름과 극대화에 노출된 상태에서 아일 레츠를 무력화하는 데 도움이 microscale 웰스 (500 μm의 직경 150 μm의 깊이)의 배열을 포함, 두 번째 레이어는 원형을 포함 perifusion 챔버 (깊이 3mm, 7mm 직경) 및 세 번째 계층은 입구 - 혼합 채널을 포함하는 팬들 아웃하기 전에 최적화에 대한 perifusion 챔버에 주입 (폭 2mm, 길이 19mm, 높이 500 μm의) 혼합 효율 전에 perifusion 챔버를 입력합니다. 선형, 종 모양 등 다양한 포도당 그라디언트, 그리고 광장 형태의 생성도 microfluidic perifusion 네트워크에 만들 수 있으며, 증명합니다.

microfluidic 아일릿 perifusion 장치가 여러 아일 레츠와 칼슘 유입과 mitochondrial 잠재적인 변화 동시 형광 이미지의 역동적인 인슐린 분비의 평가를 위해 개발되었습니다.

Microfluidic Perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 Perifusion 시스템

여러 개의 소도에서 나타나는 동적인 인슐린 분비 평가와 동시에 형광...을 측정하기 위해 미세유체 소도 주위관류 장치가 개발되었습니다.

본 발표에서는 인슐린 분비 촉진제에 반응하는 췌장 섬의 동적 인슐린 분비, 칼슘 유입 및 미토콘드리아 전위 변화를 동시에 측정하기 위한 미세유체 기반의 췌장 섬 관류 시스템을 소개하겠습니다. 이 관류 시스템은 3층 구조의 미세유체 장치, 시린지 펌프 및 분획 수집기로 구성됩니다. 인슐린 분비 촉진제로 유도된 칼슘 유입과 미토콘드리아 전위는 형광 현미경 설정을 통해 이미징됩니다.안녕하세요, 저는 일리노이 대학교 시카고 캠퍼스 이식외과 Val Holter 교수님 연구실의 Waller인 Ola입니다. 안녕하세요, 저도 Holter 교수님 연구실의 Don Lee입니다. 안녕하세요, 저 역시 Holter 교수님 연구실의 Tricia Hart입니다.오늘은 선형 포도당 농도 구배를 이용한 안검 동시 이미징 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 안검의 시각적 특성과 기능을 연구하기 위해 이 절차를 사용했습니다. 그럼 시작하겠습니다.이 절차에 사용된 미세유체 장치는 표준 포토리소그래피로 제작된 세 층의 경화된 PDMS로 조립되었습니다. 실리콘 마스터로 제작된 첫 번째 층에는 아이렛을 부드럽게 고정하는 미세유체 장치의 웰이 있으며, 깊이는 150 micrometers, 직경은 500 micrometers입니다. 두 번째 층에는 높이 500 micrometers, 너비 2 millimeters의 채널이 있습니다.솔루션의 교환 효율을 높이기 위해 채널 중앙부를 확장하여 흐름을 분산시켰습니다. 장치 내부의 교환 웰(exchange well)은 레이어 중앙에 높이 3 mm, 너비 7 mm의 구멍을 뚫어 제작합니다. 세 번째 레이어는 두꺼운 PDMS 슬랩입니다. 이 레이어를 준비하기 위해 채널의 입구 및 출구와 일치하도록 양쪽에 작은 구멍을 뚫습니다.세 개의 층이 모두 제작되면, 두 번째 층의 경우, 먼저 첫 번째 층을 웰(well)이 위를 향하도록 하여 유리 슬라이드에 접합합니다. 그런 다음 채널 간격이 위로 오도록 하여 두 번째 층을 첫 번째 층에 접합합니다. 마지막으로, 세 번째 층을 두 번째 층에 접합합니다.층들이 접합되면 장치를 실험에 사용할 준비가 된 것입니다. 70% ethanol을 채우고 Tygon 튜빙을 통해 장치의 입구 포트에 연결한 10 milliliter 주사기를 사용하여, 에탄올을 장치의 채널로 흘려보내 미세유체 장치를 멸균합니다. 그런 다음 동일한 설정을 사용하여 탈이온수를 흘려보내 에탄올을 세척합니다.장치를 멸균한 후, 타이곤 튜빙을 사용하여 가열된 현미경 스테이지 위에 배치하고, 고농도 및 저농도 포도당 용액이 담긴 시린지 펌프를 Y형 커넥터에 연결하십시오. 그런 다음 미세유체 장치의 입구에 연결하십시오. 미세유체 장치의 출구는 분획 수집기에 연결하십시오.튜빙이 37 °C 핫플레이트 위에 놓여 있는지 확인하십시오. 실험 전반에 걸쳐 용액을 생리적 온도로 유지하는 것이 매우 중요합니다. 다음으로, LabVIEW 프로그램을 사용하여 실험 동안 미세 유체 네트워크를 통해 주입될 포도당 농도 구배를 설정하십시오.이 소프트웨어는 두 가지 포도당 용액의 유량을 조절합니다. 시린지 펌프를 제어함으로써 선형, 종 모양 및 사각형 모양의 다양한 포도당 구배 프로파일을 생성할 수 있습니다. 본 실험에서는 계산된 예상 값과 비교하여 표시하며, 두 포도당 용액의 유량을 0.01 mL/min씩 가변적으로 조절하고 용액이 혼합된 후 장치로 유입되는 유량을 0.25 mL/min으로 일정하게 유지하여 2 mM에서 25 mM까지의 선형 포도당 구배를 사용할 것입니다.적절한 기울기 프로파일을 선택한 후, 해당 기울기의 안정성을 테스트하십시오. 먼저 기울기 시스템을 가동합니다. 그런 다음 분획 수집기를 시작하여 1 mL EPR 튜브에 여덟 개의 분획을 수집하십시오.그런 다음 혈당측정기를 사용하여 각 튜브의 포도당 농도를 측정하고 엑셀에 기록하십시오. 혈당측정기로 얻은 결과를 분석하십시오. 다음으로, 고농도 포도당 주사기를 Krebs ringer buffer 내의 0.5%BSA 용액이 담긴 주사기로 교체하고, 분당 1 mL의 속도로 장치에 50 mL를 관류하십시오.이는 BSA로 관류한 후 분비된 인슐린 수치를 측정할 때의 정확성을 보장하기 위해 마이크로채널 벽에 인슐린이 비특이적으로 흡착되는 것을 방지하기 위함입니다. 이를 고농도 포도당 용액으로 교체하십시오. 엄선된 25~30개의 마우스 안구 조각(eyelets)을 칼슘 지시약 fira 2:00 AM과 미토콘드리아 막전위 지시약 rumine 1 2 3이 포함된 2 mM 포도당 Krebs ringer 완충액에 현탁하고, 37 °C에서 30분 동안 배양하십시오.배양 후, 기기를 관류 시스템에서 분리하고, islet이 담긴 피펫 팁을 유입구 포트에 삽입하여 islet을 미세유체 소자 내로 조심스럽게 로딩합니다. 로딩 후 기기를 관류 시스템에 다시 연결하며, 이때 기포가 유입되지 않도록 주의합니다. 다음으로, 시린지 펌프를 작동시켜 2mM glucose가 함유된 KRB로 islet을 관류하기 시작합니다.이 단계에서는 배지에서 과잉 염료를 세척하고, 실험 중에 사용할 여기 및 방출 필터 세트와 노출 시간을 지정합니다. 그다음, 저포도당 용액이 들어있는 안구(eyelets)를 처리하는 동안 분획 수집기가 1분 간격으로 수집하도록 설정하십시오. simple PCI 이미징 소프트웨어의 관심 영역(ROI) 도구를 사용하여 이미징하려는 영역 또는 안구를 정의하십시오.또한, 세포를 10분 동안 세척한 후 감산할 배경 영역을 지정하고, 포도당 농도 구배 분획 수집기를 가동하며 타임랩스 이미징을 시작하십시오. 30분 후, 소프트웨어와 고농도 포도당 시린지 펌프를 끕니다. 고농도 포도당의 영향을 제거하기 위해 저농도 포도당으로 계속 관류하십시오.10분 후, 시린지 펌프를 꺼서 저농도 포도당의 흐름을 중단합니다. 관류 후, 분석을 위해 데이터를 Excel로 내보냅니다. 관류액으로 분비된 인슐린 양은 mouse islet ELISA로 측정할 수 있습니다.여기에 표시된 것과 같이 2에서 25 mM의 선형 농도 구배의 포도당으로 관류시켰습니다. 6 mM 포도당에 해당하는 관류 후 약 13분이 지나면 칼슘 유입과 인슐린 분비가 유발됩니다. 예상대로 미토콘드리아 전위의 변화는 그보다 앞선 약 11분경에 관찰됩니다.이 데이터는 아이렛(eyelet) 생리학적 특성을 분석하는 데 있어 이 미세유체 네트워크를 사용하는 것의 이점을 보여줍니다. 지금까지 아이렛 생리학 연구를 위해 미세유체 파라 퓨전(para fusion) 장치를 사용하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 장치 내에 기포가 없도록 확인하는 것이 중요합니다. 기포가 있을 경우 실험 중에 아이렛이 이동할 수 있기 때문입니다.또한, 아일렛(eyelets)을 건드리지 않고 분당 최대 1ml까지 유량을 조절할 수 있습니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

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Microfluidic Perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 Perifusion 시스템

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