Microfluidic 네트워크 및 표준 재관류 회의소를 사용하여 뇌 슬라이스 자극

오늘 보여드릴 프로젝트의 주요 목표는 뇌 슬래시 자극을 공간적으로, 그리고 일시적으로 제어할 수 있도록 하는 것입니다. 그리고 또 다른 중요한 점은 이미 복잡한 전기생리학적 설정에서 간단한 수정을 사용하여 이 뇌 생명 자극을 실제로 사용하는 다양한 실험실에 이 미세유체 장치를 보급할 수 있다는 것입니다. 안녕하세요, 저는 시카고 일리노이 대학교 생명공학과 에딩턴 연구실의 자바 첵 모하마드입니다.

오늘은 뇌 절편 자극을 위해 간단한 마이크로 가공 미세유체 장치를 적용하는 방법을 보여 드리겠습니다. 오늘 우리가 시연할 브레인 슬라이스 장치는 몇 가지 이유로 인해 매우 유용하며, 주된 이유는 새로운 추가 수정 없이 기존 전기생리학적 설정에 맞출 수 있는 모듈식이기 때문입니다. 그리고 그것은 어떤 microfluidic 장치든지 복잡하게 하는 tubings 및 pumpings의 사용을 피합니다.

그리고 우리는 수동 펌핑 방법을 사용하고 있기 때문에 튜브나 펌프가 필요하지 않습니다. 세 번째는 커버 슬립과 표준 전기 생리학 설정에 사용되는 표준 profusion 챔버 사이에 들어가는 얇은 PDMS 멤브레인 시트라는 것입니다. 오늘 제가 시연할 절차는 표준 SV 8 리소그래피 공정을 사용하여 제작되는 C 8 마스터로 시작합니다.

그리고 오늘 우리가 가지고 있는 마스터는 2단계 마스터로, 한 레벨은 채널, 마이크로 채널, 그리고 이러한 채널 위에 놓인 VR 개구부를 위한 디자인을 가지고 있어 채널을 통해 흐르는 솔루션이 비아 개구부에서 나올 수 있습니다. 그래서 우리는 실리콘 웨이퍼에 있는 이 마스터를 만든 다음 실리콘 또는 PDMS를 사용하여 이 장치 상단에 붓고 이 웨이퍼 위에 있는 구조를 PDMS에 성형합니다. 그래서 우리는 PDMS가 이 장치 위에 쏟아지도록 할 것입니다.

그런 다음 경화 후 형성되어 커버 슬립에 결합된 PDMS 멤브레인을 가져갈 것입니다. 그리고 우리는 미세유체 장치를 가지고 있습니다. 그런 다음 관류 챔버 바닥에 있는 PDMS의 얇은 층을 인용하여 표준 풍부 챔버를 수정할 것입니다.

그리고 일단 우리가 이 변형된 관류 챔버를 갖게 되면, 우리는 이전에 제작한 미세유체 장치를 가져와서 관류 챔버에 결합할 것입니다. microfluidic 장치의 제작에는 2개의 긴요한 점이 있습니다. 하나는 PDMS를 장착하기 전에 PDMS를 웨이퍼에 부을 때 PDMS가 즉시 대기열에 추가되지 않도록 핫 플레이트를 꺼야 한다는 것입니다.

그리고 또 다른 중요한 점은 실리콘 웨이퍼의 네 모서리에 사용하는 스페이서의 높이가 실리콘 웨이퍼에서 가장 높은 구조보다 작아야 한다는 것입니다. 이것은 PDMS의 경화 공정을 수행할 때 VR 개구부를 얻을 수 있는지 확인하기 위한 것입니다. 여기 우리는이 부드러운 벽 모듈 식 클린 룸에 있으며 이것은 표준 C 8 리소그래피 공정을 사용하여 제작 한 마스터입니다.

그리고 4개의 입구와 1개의 출구가 있는 채널 설계를 가진 첫 번째 레벨의 2단계 마스터입니다. 그리고 4개 채널 모두의 중간 영역에는 채널 위에 서 있는 비아 또는 포스가 있습니다. 그리고 이것들은 제작 과정에서 만들어진 정렬 표시입니다.

이제 그것을 제거하고 PDMS 경화를 수행하는 방법을 보여 드리겠습니다. 엣지 비드 효과로 인해 웨이퍼 외곽의 두께는 종이 중앙의 실제 장치보다 큽니다. 그래서 우리가 할 일은 예비 블레이드를 사용하여 이 정렬 표시를 제거한 다음 무게를 수용하기 위해 140미크론 높이의 이 스페이서를 사용하여 웨이퍼의 네 모서리에 놓

따라서 면도날이 실제 장치 근처에 닿지 않도록 해야 합니다. 이제 에어 더스터를 사용하여 이 SVA 입자를 제거하려고 하고 웨이퍼는 이제 PDMS 금형 준비를 위한 준비가 되었습니다. 그러나 그렇게 하기 전에 높이가 140미크론인 이 스페이서를 넣어야 합니다.

그래서 저는 웨이퍼의 네 모서리에 4개의 테이프를 배치할 것입니다. 그런 다음 테이프가 웨이퍼에 제대로 부착되었는지 확인하겠습니다. 따라서 테이프의 높이가 140미크론인 이유는 채널과 VS가 있는 2단계 마스터의 높이가 150미크론이기 때문입니다.

그리고 PDMS 경화 중에 PDMS 위에 무게를 싣는 경우 PDMS 시트가 평평하게 나오는지 확인하고 싶습니다. 그래서 우리는 동일한 높이의 모서리에 4개의 스페이서를 사용하고 있습니다. 이제 PDMS를 어떻게 코딩하고 치료하여 장치를 만드는지 보여드리겠습니다.

그 전에 PDMS 솔루션을 어떻게 준비했는지 보여드리겠습니다. 그래서 우리는 베이스의 10개 부분과 경화제의 1개 부분을 취하여 혼합 과정으로 인해 완전히 혼합합니다. 이 거품을 제거하기 위해 PDMS 용액에서 많은 거품을 생성하는 것을 볼 수 있으며, PDMS를 10분 동안 건조제에 넣은 후 PDMS를 건조제에 넣으면 기포가 없습니다.

이제 PDMS를 경화에 사용할 준비가 되었습니다. 이제 PDMS를 웨이퍼에 놓고 경화하여 PDMS 멤브레인을 얻는 방법을 보여 드리겠습니다. 그래서 PDMS를 웨이퍼에 놓고 이 투명도를 사용하여 PDMS를 덮을 것입니다.

그리고 이것은 우리가 장치 sup을 제거하고 장치를 투명도에서 분리한 다음 투명도 위에 가중치를 배치하는 데 도움이 될 것입니다. 그리고 우리가 가중치를 사용하는 이유는 PDMS의 균일한 두께를 얻기 위해서입니다. 그리고 또 다른 중요한 문제는 비아 개구부를 얻는 것입니다.

따라서 vs가 있는 곳이면 어디든 PDMS를 원하지 않으며 가중치는 이를 수행하는 데 도움이 될 것입니다. 여기에서 볼 수 있듯이 핫 플레이트가 꺼져 있으며 그 이유는 PDMS가 즉시 경화되는 것을 원하지 않기 때문에 핫 플레이트를 끄도록 내버려 둡니다. 그런 다음 PDMS를 이식하기 전에 웨이퍼가 평평한지 확인해야 합니다.

이제 이전에 준비한 PDMS를 이식할 수 있습니다. 기포가 발생하지 않도록 PDMS를 웨이퍼에 충분히 가깝게 분배해야 합니다. 여기서 가장 중요한 점은 PDMS 위에 투명성을 적용하는 방식입니다.

시트 배치로 인해 기포가 발생하지 않도록 해야 합니다. 이제 이 유리 실험실들 중 하나를 배치하고 PDMS의 초과 PDMS들이 방해가 되지 않도록 하겠습니다. 나는 세 개의 유리 실험실을 더 배치하고 유리 실험실이 이 특정 마스터를 위해 움직이지 않도록 하고 있습니다.

그리고 이러한 특정 기능을 위해 우리는 이 4개의 유리 실험실을 배치하면 VS가 생성된다는 것을 알게 되었습니다. 그리고 PDMS가 과도한 PDMS가 투명도와 웨이퍼 사이에서 방해가 되지 않도록 합니다. 우리는 1-2분 동안 기다린 다음 다른 마스터와 다른 디자인에 대해 핫 플레이트를 시작할 수 있으며, 비아 개구부를 얻기 위해 유리 실험실의 수를 늘리거나 유리 실험실을 줄여야 할 수도 있습니다. 이제 핫 플레이트를 켤 준비가 되었으며 온도를 75도로 설정하겠습니다.

그리고 온도가 75도에 도달하면 타이머를 1시간 동안 설정하고 PDMS가 경화되도록 할 수 있습니다. 이제 PDMS를 1시간 동안 경화하도록 두었으므로 핫 플레이트를 끄고 섭씨 50도까지 식힐 수 있습니다. 이렇게 하는 이유는 SEA가 깨지지 않도록 하기 위함입니다.

75도에서 실온으로 즉시 제거하면 이제 전원을 끄고 섭씨 50도까지 내려갈 때까지 기다릴 수 있습니다. 이제 열판 온도가 섭씨 50도까지 내려갔으므로 투명도에서 가중치를 제거할 수 있습니다. 이제 핫 플레이어에서 웨이퍼를 제거할 수 있으며 절단할 준비가 되었습니다.

이제 PDMS 시트는 C 8 마스터에서 제거할 준비가 되었으며 알루미늄 호일을 제거해야 합니다. 그런 다음 투명 시트를 제거해야 합니다. 우리는 여기에 표준 관류 챔버를 가지고 있습니다.

정렬할 수 있도록 수정했습니다. 미세유체 장치의 구멍, 입구 및 출구 포트. 이것은 PDMS 멤브레인에 있는 4개의 입구 포트와 1개의 출구 포트입니다.

그리고 이것들은 관류 챔버의 4 개의 입구와 1 개의 출구와 일치해야합니다. 이제 관류 챔버를 밀어 PDMS 멤브레인의 구멍에 정렬하겠습니다. 이제 정렬되었으므로 절단할 준비가 되었습니다.

이제 프로브를 사용하여 챔버를 제거할 수 있습니다. PDMS 멤브레인의 모든 가장자리를 자유롭게 제거할 수 있는지 확인합니다. 그렇게 하면 냉동고를 사용하여 PDMS 멤브레인을 제거하고 장치 상단에서 PDMS를 제거할 때 PDMS 멤브레인이 찢어지지 않도록 PDMS를 천천히 움직일

이제 SC 8 마스터로 형성된 캐비티가 있는 PDMS 멤브레인을 위에 놓고 평평한지 확인하겠습니다. 그리고 우리가 이렇게 하는 이유는 구멍, 입구 및 출구 포트를 만들 때 PDMS가 측면이 거칠지 않기 때문입니다. 그것은 커버 슬립과 접착될 것입니다.

따라서 구멍이 위쪽에 있는지 확인해야 합니다. 이제 구멍을 명확하게 볼 수 있도록 입구와 출구 포트를 만들 수 있습니다. 우리는 검은 색 배경을 넣었습니다.

이제 입구와 출구 포트가 포트에 PDMS가 남아 있지 않은지 확인하도록 하겠습니다. PDMS를 제거하는 것도 마찬가지입니다. 이제 PDMS 멤브레인을 다른 투명 시트로 옮길 것입니다.

그래서 우리는 시트와 커버 슬립을 플라즈마로 처리하고 다시 충치가 맨 위에 있도록 놓을 수 있습니다. 따라서 이 표면이 플라즈마로 처리되고 커버 슬립이 플라즈마로 처리되면 이 두 표면을 결합하여 미세유체 네트워크를 형성하여 PDMS 시트 사이의 기포를 제거할 수 있습니다. 투명도는 스카치 테이프를 사용할 수 있습니다.

따라서 이렇게 하면 PDMS 시트가 평평하고 접착이 훨씬 더 잘 발생합니다. 그런 다음 다시 윗면에 스카치 테이프를 사용하여 PDMS 멤브레인에서 먼지를 제거합니다. 이제 PDMS 멤브레인과 결합할 커버 슬립을 넣을 수 있습니다.

이제 이 두 가지 PDMS와 유리를 플라즈마 처리할 준비가 되었습니다. 우리는 이 마이크로파 변형 플라즈마 시스템을 사용하여 PDMS와 커버 슬립을 플라즈마 처리할 예정이며, 여기서 볼 수 있는 유리 챔버는 이 마이크로파 내부에 플라즈마를 생성할 수 있도록 합니다. 그리고 샘플을 내부에 배치하여 챔버 내부에 진공을 생성하겠습니다.

이제 산소를 흘릴 수 있습니다. 이제 플라즈마 시스템을 사용할 준비가 되었으며 이 특정 시스템에 10%의 전력과 10초를 사용하여 플라즈마를 시각화하는 데 도움을 주겠습니다. 플라즈마 치료가 진행되는 동안, 우리는 전원을 100%까지 올리고 불을 껐습니다.

이제 플라즈마 치료 직후 플라즈마를 볼 수 있습니다. 카우 슬립과 PDMS의 두 표면을 접착해야 하며, 그렇지 않으면 PDMS 표면은 플라즈마 처리로 인해 친수성을 잃게 됩니다. 카우 슬립을 놓은 후에는 전체 표면이 기포 없이 함께 접착되어 있는지 확인하십시오.

기포가 있으면 제거할 수 있습니다. 이제 5분 동안 따로 보관하고 접착되도록 합니다. 여기 PDMS로 챔버의 바닥을 수정한 수정된 관류 챔버가 있습니다.

그리고 이것은 더 일찍 이루어졌습니다. 그래서 우리는 꺼져있는 핫 플레이트의 핫 플레이트에 투명도를 배치했습니다. 그런 다음 앞서 보여준 것과 비슷한 방법으로 준비한 P-D-M-S-P-D-M-S를 부었습니다.

그런 다음 PDMS 위에 관류 챔버를 배치한 다음 여기에 표시된 대로 단일 추를 놓고 섭씨 30분 또는 75도 동안 경화시켰습니다. 이제 PDMS와 커버 슬립 본딩이 발생하기를 기다리는 동안 챔버를 준비할 수 있다는 것을 보여드리겠습니다. 그래서 우리는 챔버와 미세유체 장치를 접착할 수 있습니다.

따라서 필요하지 않은 곳에서 과도한 PDM을 제거해야 합니다. 투명도를 제거한 다음 PDMS를 제거한 다음 입구 및 출구 포트에서 PDMS를 제거해야 합니다. 이제 챔버는 이전에 준비한 미세 유체 장치와 결합할 준비가 되었습니다.

이제 5 분을 기다렸으므로 미세 유체 장치를 투명도에서 분리 할 준비가되었지만 느린 속도로 투명도를 제거해야합니다. 따라서 PDMS와 커버 슬립은 분리되지 않습니다. 이제 관류 챔버가 준비되었으므로 PDMS를 인용한 챔버의 바닥 표면과 PDMS가 있는 미세유체 장치의 상단 표면을 플라즈마 처리해야 합니다.

이제 우리는 이 두 조각을 모두 플라즈마 챔버에 넣고 10초 동안 10%의 전력으로 플라즈마 처리를 할 것입니다. 이제 두 표면이 플라즈마로 처리되었으며 접착할 준비가 되었습니다. 접착하기 전에 챔버의 입구 및 출구 포트가 미세 유체 장치와 정렬되어 있는지 확인해야 합니다.

그리고 우리가 정렬하고 있는 기능이 충분히 크기 때문에 특별한 장비가 필요하지 않으며 육안으로 할 수 있습니다. 챔버 위에 정렬하고 배치한 후에는 모든 표면이 접촉했는지 확인한 다음 5분 동안 그대로 둘 수 있습니다. 따라서 접착력은 5분 동안 기다린 후 실험하기에 충분합니다.

이제 미세유체 장치가 챔버와 결합되었으므로 채널 표면의 채널을 친수성으로 만들 것입니다. 따라서 우리가 실제로 A CFS 용액이나 다른 신경전달물질을 흐르게 할 때, 그 용액은 더 쉽게 흐를 수 있습니다. 그래서 제가 할 일은 이 전체 장치를 플라즈마와 플라즈마에 넣고 10%에서 1분 동안 처리하여 전체 내부 채널 표면이 친수성이 되도록 하는 것입니다.

그런 다음 물을 채운 다음 전기 생리학 설정으로 가져가서 실제 실험을 할 수 있습니다. 자, 이제 전기생리학 설정으로 이동하여 실제로 이 장치를 뇌 절편과 함께 사용할 준비가 되었습니다. 안녕하세요, 제 이름은 uo입니다.

저는 일리노이 대학의 생명공학과의 Arrington 박사 및 Fall 박사와 함께 일하고 있습니다. 이제 저는 이 플랫폼을 가져와서 먹었던 마이크로 무료 장치로 작업할 것입니다. 한쪽에서 풍성한 튜브를 볼 수 있습니다.

반대편에서 흡입 튜브를 볼 수 있습니다. 따라서 이 장치는 95%의 산소와 5%의 CO2로 거품이 일어난 CSF 솔루션으로 관류될 것입니다. 이제 마이크로 V 장치가 준비되었으므로 뇌 라이센스를 얻은 다음 마이크로 장치 위에 놓을 것입니다.

이제 저는 뇌 절편을 원형 구멍의 맨 위에 놓고, 뇌 절편을 움직이지 못하게 하기 위해 닻을 사용할 것입니다. 이제 뇌 절편이 움직이지 않게 되었으니, 저는 그것을 자극하기 위해 eh 신경전달물질을 사용할 것입니다. 바로 여기에 4개의 흡입구가 있으므로 이 4개의 흡입구에서 이 배출구까지 수동 펌핑을 사용하여 각 흡입구에 신경전달물질을 주입할 것입니다.

이제 Dr.Fall이 이 장치에 대해 이야기할 것입니다. 우리에게 중요한 것은 무엇입니까? 안녕하세요, 저는 뇌 생리학을 하는 Chris Fall입니다.

그리고 우리가 뇌 절편을 사용해야 하는 이유는 마이크로 전극과 이미징 기술에 접근하기 위해서입니다. 그리고 지금까지, 우리가 이 뇌 절편의 신경전달물질 환경을 바꿀 수 있는 유일한 방법은 전체 절편에 대한 흐름을 바꾸거나 아주 작은 마이크로 피펫을 사용하여 신경전달물질을 직접 내뿜는 것이었습니다. 그래서 우리는 Eddington의 그룹과 함께 일하게 되어 정말 기쁩니다.

이 새로운 기술을 통해 우리는 뇌의 넓은 영역을 다루고 신경전달물질 환경인 국소적으로 변화시킬 수 있습니다. 그리고 동시에 우리는 우리의 전극과 이미징 기술을 가지고 들어갈 수 있으며, 어쩌면 궁극적으로는 동일한 장치에 다중 전극 기록 장치를 구축할 수 있습니다. 자, 여기 보시다시피, 미세유체 장치에서 쥐의 염좌 조각이 보입니다.

그리고 뇌가 여러 다른 영역으로 구성되어 있다는 것을 눈으로도 알 수 있습니다. 이러한 지역은 서로 다른 작업을 수행합니다. 그리고 살아 있는 동물의 경우, 뇌의 이러한 다양한 영역은 서로 다른 신경 조절 및 신경 전달 물질 색조를 가질 것입니다.

그리고 우리는 전기생리학적 및 이미징 기록을 만드는 동안 슬라이스 챔버에서 이것을 복제할 수 있기를 원합니다. 따라서 서로 다른 농도와 다른 시간 경과에 따라 다른 신경 전달 물질로 이러한 다양한 영역을 다룰 수 있다는 것은 정말 대단한 일입니다. 신경 전달 물질을 실제로 시각화할 수는 없지만, 다른 영역의 뇌 절편으로 펌핑되는 형광 염료의 예를 보여드릴 수 있습니다.

영화에서 우리는 장치의 채널을 통해 형광 염료를 흐르게 하고 만들어진 구멍에서 그것이 나오는 것을 시각화합니다. 그리고 이 초기 프로토타입에서도 흐름에 따른 공간 해상도가 얼마나 정확한지 확인할 수 있습니다. 영화를 보면서 염료가 채널로 흘러 들어간 다음 구멍에서 나오는 것을 볼 수 있으며, 그런 다음 염료를 씻어내어 흐름의 시간 해상도가 얼마인지 알 수 있습니다.

오늘 함께해 주셔서 감사합니다. 저는 우리가 어떻게 미세유체역학과 마이크로 기계가 전통적인 생리학적 기술과 결합될 수 있는지를 보여주어 뇌가 어떻게 작동하는지 이해하는 데 도움을 줄 수 있었다고 생각합니다. 감사.