Name: 형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 배우세요 인간 유사섬 시스템을 활용한 형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가 방법을. 이 기술은 당뇨병 연구에서 베타세포 기능과 신호 전달 메커니즘을 실시간으로 분석하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

장기 기증자와 그 가족들은 귀중한 기증에 감사하고 있으며, 국제장기조달기구협회(IIAM)와 국립질병연구거래소(NDRI)는 인간의 췌장 조직을 연구에 활용할 수 있도록 협력한 공로를 인정받고 있습니다. 이 연구는 Human Islet Research Network(RRID:SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program(RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 및 DK20593(Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, 미국 재향군인회(BX000666)의 지원을 받았습니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health, T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 및 국립과학재단(National Science Foundation) 대학원 연구 펠로우십(1937963)의 NIGMS.

Intracellular Signaling Events and Hormone Secretion in Human Pseudoislets(인간 가성섬에서 세포내 신호전달 사건과 호르몬 분비)

<ol><li>Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+systemic+insulin+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of systemic insulin function.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).</li>
<li>Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+controls+glucagon+secretion+by+directly+modulating+cAMP+in+alpha+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells.</a> Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).</li>
<li>Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+islet+glucagon+secretion%3A+Beyond+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Obesity+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium.</a> Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).</li>
<li>Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta+cell+mass+and+function+in+diabetes%3A+Recent+advances+in+knowledge+and+technologies+to+understand+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).</li>
<li>Halban, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-cell+failure+in+type+2+diabetes%3A+Postulated+mechanisms+and+prospects+for+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).</li>
<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1+cell+function+and+gene+expression+are+compromised+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes.</a> Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).</li>
<li>Walker, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+human+pseudoislet+system+and+microfluidic+platform+demonstrate+differences+in+GPCR+signaling+in+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells.</a> JCI Insight. 5 (10), e06990(2020).</li>
<li>Giannoukakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+intact+human+islets+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Infection of intact human islets by a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).</li>
<li>Curran, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+pancreatic+islets+by+feline+immunodeficiency+virus+vectors1%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1.</a> Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).</li>
<li>Kayton, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+preparations+distributed+for+research+exhibit+a+variety+of+insulin-secretory+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).</li>
<li>Lenguito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resealable%2C+optically+accessible%2C+PDMS-free+fluidic+platform+for+ex+vivo+interrogation+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets.</a> Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).</li>
<li>Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DAG+and+cAMP+sensors+optimized+for+live-cell+assays+in+automated+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).</li>
<li>Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+dynamics+in+the+pancreatic+%CE%B2-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Upsala+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell.</a> Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).</li>
<li>Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+triggering+pathway+to+insulin+secretion%3A+Functional+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+%CE%B2+cells+and+their+translational+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance.</a> Islets. 9 (6), 109-139 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

미세 주위 융합 시스템, 바이오센서 발현 유사섬 및 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 통합으로 세포 내 신호 이벤트 및 동적 호르몬 분비 프로파일의 동시 평가가 가능합니다. 동적 미세페리퓨전 시스템은 유사섬에 일련의 잘 정의된 자극을 전달할 수 있으며 상업적으로 이용 가능한 ELISA로 인슐린 및 글루카곤 농도를 측정할 수 있는 폐수 수집을 허용합니다. 동시에, 컨포칼 현미경 플랫폼에 의한 바이오센서 발현 유사섬의 살아있는 세포 이미징은 세포 내 신호 이벤트에 대한 정보를 제공하는 실시간 바이오센서 형광 활동을 캡처합니다. 시간 경과에 따른 바이오센서 신호와 호르몬 분비 프로파일의 동시 측정은 섬 호르몬 분비에 대한 세포 내 신호 전달 사건의 영향을 직접 비교할 수 있는 기회를 제공합니다.
여러 가지 고려 사항이 제시된 프로토콜의 성공의 열쇠입니다. 여기에는 바이오센서 발현 유사섬을 생성하고 유사섬 이동 없이 각 실험 동안 일정한 유속을 사용하는 것이 포함됩니다. 100μL/min의...

랑게르한스 섬은 췌장 전체에 흩어져 있는 작은 기관으로, 그 기능은 포도당 항상성 유지에 매우 중요합니다. 인슐린은 포도당의 대사, ATP/ADP 비율의 증가, ATP에 민감한 칼륨 채널의 폐쇄, 원형질막의 탈분극, 세포외 칼슘의 유입에 따라 베타 세포에서 분비됩니다1. 알파 세포에서 글루카곤 분비는 잘 알려져 있지 않지만, 세포 내 및 파라크린 경로가 글루카곤 과립 엑소사이토시스 2,3,4에 기여하는 것으로 추정되었습니다. 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병은 모두 섬세포 기능 장애와 관련이 있다 5,6,7. 따라서 섬 호르몬 분비를 매개하는 세포 내 신호 전달 경로를 규명하는 것은 췌장 섬의 생리학적 및 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.
섬의 구형 구조는 실험에 특정 장애물을 제시합니다. 이러한 문제에는 섬의 크기 변화와 섬의 3D 특성이 포함되며, 이는 섬 코어 8,9 내에서 바이러스 전달을 감소시킵니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 유사섬 시스템(pseudoislet system)이 개발되었는데, 이 시스템에서는 인간의 1차 섬을 단일 세포로 분산시키고, 관심 표적을 암호화하는 구조체로 아데노바이러스성 형질도입하고, 유사섬(pseudoislet)이라고 하는 크기가 조절되는 섬과 같은 구조를 형성하기 위해 재응집된다7. 병렬로 배양된 동일한 기증자의 토착 섬과 비교했을 때, 이들 유사섬은 형태, 내분비세포 조성 및 호르몬 분비가 유사하다7. 이 방법은 유사섬(pseudoislet) 전체에 걸쳐 구성물의 발현을 허용하는데, 이는 1차 인간 섬(7,8,9)의 균일한 유전자 조작에 대한 이전의 장벽을 극복한다는 것을 의미한다.
이 프로토콜에서, 유사섬 시스템은 미세유체 장치와 통합되어 1차 인간 섬 세포에서 바이오센서를 발현하고 동적 주융10,11,12 동안 유사섬 호르몬 분비의 시간적 분해능을 얻습니다. 유사섬은 마이크로칩에 배치되고 연동 펌프(12)를 통해 상이한 분비물의 꾸준한 흐름에 노출된다. 마이크로칩은 투명한 유리 바닥을 가지고 있으며 컨포칼 현미경에 장착되어 바이오센서 형광 강도의 변화를 통해 세포 내 신호 역학을 기록합니다. 바이오센서 이미징은 인슐린 및 글루카곤 분비의 후속 분석을 위해 미세페리퓨전 유출물 수집과 동기화된다7. 거대주융합과 비교하여, 이러한 미세주융합 접근법은 거대주위융합 챔버(7)에 비해 미세유체 장치의 부피가 더 작기 때문에 더 적은 수의 유사섬을 사용할 수 있다.
이 시스템의 유용성을 활용하기 위해 cAMP 역학 및 호르몬 분비를 평가하기 위해 인간 유사 섬에서 순환 아데노신 일인산(cAMP) 차이 검출기(cADDis) 바이오센서를 발현했습니다. cADDis 바이오센서는 cAMP 2(EPAC2)에 의해 활성화된 교환 단백질의 힌지 영역에 위치한 원형 치환 녹색 형광 단백질(cpGFP)로 구성되어 조절 영역과 촉매 영역을 연결합니다. EPAC2의 조절 영역에 대한 cAMP의 결합은 cpGFP13에서 형광을 증가시키는 힌지 영역의 구조적 변화를 유도합니다. cAMP와 같은 세포내 메신저는 G-단백질 결합 수용체의 상류 활성화 후 인슐린과 글루카곤 분비를 유도한다14. 미세 주류주입과 결합된 살아있는 세포 이미징은 세포 내 cAMP 역학을 섬 호르몬 분비와 연결하는 데 도움이 됩니다. 구체적으로, 이 프로토콜에서, 다양한 자극에 대한 알파 및 베타 세포의 cAMP 반응을 모니터링하기 위해 cADDis-발현 유사섬이 생성된다: 낮은 포도당(2mM glucose; G 2), 고포도당 플러스 이소부틸메틸크산틴(IBMX; 20mM 글루코스 + 100μM IBMX; G 20 + IBMX), 저포도당 및 에피네프린(Epi; 2mM 포도당 + 1μM Epi; G 2 + 에피). 이 치료 워크플로우를 통해 1) 분해를 방지하여 세포 내 cAMP 수준을 향상시키는 IBMX 매개 포스포디에스테라제 억제 및 2) β-아드레날린 수용체 활성화에 의해 매개되는 알파 세포 글루카곤 분비의 알려진 cAMP 의존성 자극제인 에피네프린을 통해 세포 내 cAMP 역학을 직접 평가할 수 있습니다. 생세포 이미징 실험을 위한 미세페리퓨전 장치를 설정하는 단계, 마이크로칩에 유사섬을 로딩하는 단계, 동기식 생세포 이미징 및 미세주류융합, 마이크로플레이트 기반 호르몬 분석에 의한 바이오센서 추적 및 호르몬 분비 분석은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Ad-CMV-cADDis</td><td>Welgen</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0.01인치 FEP 튜빙</td><td>IDEX</td><td>1527L</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Enriched-CMRL 매체 구성 요소</td></tr><tr><td>1.5 mL 및 원추형 튜브</td><td>임의의</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; m PTFE 필터</td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-21940-41</td><td>8-10회마다 교체</td></tr><tr><td>100mM 피루브산 나트륨</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>11360070 Enriched-CMRL 배지 구성 요소</td></tr><tr><td>190 프루프 에탄올</td><td>Decon labs</td><td>2816</td><td>산성 에탄올 구성</td></tr><tr><td>요소 200mM GlutaMAX-I 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Enriched-CMRL 미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td>DMEM 페리퓨전 버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A7888</td><td>DMEM 페리퓨전 버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>버블 트랩&nbsp;</td><td>Omnifit</td><td>006BT</td><td></td></tr><tr><td>CellCarrier ULA&nbsp; 96웰 마이크로플레이트</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055330</td><td></td></tr><tr><td>cellSens 분석 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>v3.1</td><td>데이터 분석에 사용되는 소프트웨어</td></tr><tr><td>CMRL 1066</td><td>MediaTech&nbsp;</td><td>15-110-CV</td><td>Enriched-CMRL 미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>원뿔형 어댑터 (IDEX, P-794)</td><td>IDEX</td><td>P-794</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-글루코스</td><td>시그마</td><td>G7528</td><td>글루코스 버퍼 컴포넌트</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td>DMEM Perifusion Buffer Component</td></tr><tr><td>Environmental chamber</td><td>okolab</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Epinepherine (Epi)</td><td>Sigma</td><td>E4250</td><td>Stimulation Buffer Component</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td><td>Sigma</td><td>12306C</td><td>Enriched-CMRL Media Component</td></tr><tr><td>Glucagon ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1281-01</td><td></td></tr><tr><td>글루카곤 키트 HTRF</td><td>Cisbio</td><td>62CGLPEH</td><td></td></tr><tr><td>HCl (12N)</td> <td>모든</td><td></td><td>산 에탄올 구성 요소</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H7523</td><td>DMEM Perifusion 버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>iCell 내피 세포 매체 보충제</td><td>세포 역학</td><td>M1019</td><td>iEC 미디어 구성 요소</td></tr><tr><td>Idex Derlin 너트 및 페룰 1 / 4-24</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-00414-LW</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-01</td><td></td></tr><tr><td>이소 부틸 메틸 로닌 (IBMX)</td> <td>시그마</td><td>I5879</td><td>자극 완충 장치 구성 요소</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>올림푸스</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>시그마</td><td>G8540</td><td>DMEM 페리 퓨전 버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>마이크로 칩 (마이애미 대학교, FP-3W)</td> <td>마이애미</td> <td>대학교FP-3W</td><td></td></tr><tr><td>마이크로칩 홀더&nbsp;</td><td>Micronit Microfluidics</td><td>FC_PRO_CH4525</td><td></td></tr><tr><td>Model 2110 Fraction Collector</td><td>Biorad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>P10, P200, P1000 피펫 및 팁</td><td>어떤</td><td>어떤 페</td><td></td></tr><tr><td>니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Enriched-CMRL 미디어 컴포넌트</td></tr><tr><td>연동 펌프&nbsp;</td><td>Instech</td><td>P720</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>세척 섬</td></tr><tr><td>Sarstedt 접시</td><td></td>는 <td>접시 직경</td><td></td>에 따라 다릅니다</tr><tr><td>. 중탄산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S6014</td><td>DMEM 페리퓨전 버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>시그마</td><td>P2256</td><td>&nbsp; DMEM Perifusion Buffer Component</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Filter (0.22 &mu; m)</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>모든 버퍼를 두 번 필터링</td></tr><tr><td>VascuLife VEGF 매체 전체 키트</td><td>LifeLine Cell Technology</td><td>LL-0003</td><td>iEC 매체 구성 요소</td></tr></tbody></table>

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

랑게르한스의 췌장 섬은 췌장 전체에 산재된 특수 내분비 및 지원 세포의 작은 3D 집합체로, 혈당을 낮추는 베타 세포의 인슐린 분비와 혈당을 높이는 알파 세포의 글루카곤 분비를 통해 포도당 항상성을 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다. cAMP에 의해 매개되는 것을 포함한 세포 내 신호 전달 경로는 조절된 알파 및 베타 세포 호르몬 분비에 중요합니다. 3D 섬 구조는 조정된 섬 기능에 필수적이지만, 1차 인간 섬 세포의 세포 내 신호 전달 경로에 대한 기계론적 연구에 대한 실험적 과제를 제시합니다. 이러한 과제와 한계를 극복하기 위해 이 프로토콜은 당뇨병이 없는 기증자로부터 생성된 1차 인간 유사섬을 사용하여 형태, 구성 및 기능에서 토착 섬과 유사한 통합 생세포 이미징 및 미세유체 플랫폼을 설명합니다. 이러한 pseudoislet은 1차 인간 islet 세포의 분산 및 재응집 과정을 통해 크기가 조절됩니다. 분산된 상태에서, 섬세포 유전자 발현은 조작될 수 있다; 예를 들어, 유전적으로 인코딩된 cAMP 바이오센서, cADDis와 같은 바이오센서가 도입될 수 있다. 일단 형성되면 공초점 현미경 및 미세 주변 융합 플랫폼과 함께 유전적으로 인코딩된 바이오센서를 발현하는 유사섬을 통해 형광 바이오센서 역학과 알파 및 베타 세포 호르몬 분비 프로파일을 동시에 평가하여 세포 과정 및 기능에 대한 더 많은 통찰력을 제공할 수 있습니다.

바이오센서-발현 인간 유사섬은 cAMP 바이오센서 cADDis를 암호화하는 작제물의 아데노바이러스 전달을 통해 생성되었다(도 1A). 그림 1B는 시간 경과에 따른 형질도입된 인간 섬세포의 재응집을 보여주며, 배양 6일 후 완전히 형성된 유사섬이 관찰되었습니다. 세포는 48시간 이내에 가시적인 cADDis 형광을 나타내기 시작했으며, 배양 기간이 끝날 무렵에는 형질도입된 세포에서 높은 바이오센서 발현이 있었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 pseudoislet은 알파 세포에서 60%, 베타 세포에서 95%의 평균 형질도입 효율을 나타냈습니다(그림 1C-D).
통합된 미세유체 및 라이브 셀 이미징 플랫폼은 그림 2에 강조 표시...

이 프로토콜은 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 바이오센서, cAMP 차이 검출기 in situ (cADDis) 및 미세페리퓨전 시스템의 아데노바이러스 전달을 사용하여 일차 인간 유사섬에 의한 세포 내 신호전달 이벤트의 동기 획득 및 공동 정합 및 인슐린 및 글루카곤 분비를 위한 방법을 설명합니다.

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

우리 연구실은 제1형 및 제2형 당뇨병의 베타 세포 기능 장애 및 기타 눈꺼풀 이상을 이해, 예방 및 역전시키기 위해 노력하고 있습니다. 우리의 연구는 인간의 췌장과 눈꺼풀의 생물학과 건강과 질병에 대한 연구를 통합하여 인간 당뇨병의 발병 기전에 초점을 맞추고 있습니다. 인간의 작은 구멍은 3D 구형 구조이며, 전체 구멍에 걸쳐 세포에 접근하는 것은 몇 가지 실험적 과제를 제시합니다.예를 들어, 아일렛 세포 신호 전달을 이해하기 위해 바이오센서를 도입하려고 할 때, 당사의 유사 눈꺼풀 프로토콜은 단일 세포 상태에서 유전자 조작을 수행하고 다운스트림 연구를 위해 이러한 형질도입된 인간 아일렛 세포를 유사 눈꺼풀로 응집함으로써 이러한 문제를 극복합니다. 당사의 유사 눈꺼풀 시스템을 사용하면 눈꺼풀 표면뿐만 아니라 전체 구멍에 걸쳐 바이오센서를 발현할 수 있습니다. 라이브 셀 이미징 및 Microperfusion System과 결합하여 다운스트림 호르몬 분비와 함께 동적 세포 내 과정을 측정하고 공동 등록할 수 있습니다.이 프로토콜은 다양한 중요한 과학적 질문에 답하는 데 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 유전자 침묵 전략은 이 접근법과 결합되어 관심 유전자가 눈꺼풀 기능 및 관련 신호 전달 경로에 미치는 영향을 전체적으로 또는 자기 특이적인 방식으로 이해할 수 있습니다.

human-pseudoislet-system-for-synchronous-assessment-fluorescent

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

microfluidic 아일릿 perifusion 장치가 여러 아일 레츠와 칼슘 유입과 mitochondrial 잠재적인 변화 동시 형광 이미지의 역동적인 인슐린 분비의 평가를 위해 개발되었습니다.

Microfluidic Perifusion 장치 내에서 멀티 파라메 트릭 아일릿 Perifusion 시스템

여기에서는 생체 일주기 발광과 인간 섬 세포 및 일차 근관의 분비 활동을 병렬로 모니터링하기 위한 설정에 대해 설명합니다. 이를 위해 루시페라제 코어 클럭 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한 후, 연속적인 세포 주혈에 의한 유출 매질의 체외 동기화 및 수집을 수행했습니다.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.

Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

여기, 우리가 현재의 균질 시간 세포에서 분 비 하는 인슐린의 신속한 검출을 위한 효율적인 방법으로 무서 워 (HTRF) 해결.

균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 기반 분석 결과 인슐린 분 비의 검출에 대 한

이 프로토콜은 베타 세포에서 인슐린 분비를 위한 프록시로 인슐린 연결된 Gaussia luciferase를 사용하여 중간 처리량에서 급속한 저비용 luciferase 분석기를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 이 분석은 대부분의 발광 플레이트 판독기 및 다중 채널 파이펫으로 수행될 수 있습니다.

공동 분비 된 루시퍼라제 대리를 사용하여 상대 인슐린 분비 측정

이 프로토콜은 거의 생리학적 조건에서 세포 기능을 연구하기 위해 사망한 장기 기증자로부터 인간 췌장 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 혁신적인 접근법은 정상 및 구조적으로 손상된 섬과 내분비 구획 간의 복잡한 상호 작용을 조사할 수 있게 합니다.

내분비 및 외분비 췌장 생리학을 연구하기 위해 인간 췌장 조직 절편 생성

의 선택, microinjection, 그리고 영상은 형광을 통해 F - 굴지 찬란 - 라벨 (FSM) 현미경을 작은 반점을 찍다.

형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

작은 동물의 근육 Engraftment의 역학에 의해 추적 VIVO에서 형광 이미징

설명이 쉽고 밀도에 독립적 인 강화를위한 비오틴 링커를 전송할 클릭 화학에 이어, 5 HMC에 azide - 포도당를 전송하는 β-glucosyltransferase (β-GT)를 사용하여 두 단계 라벨 프로세스입니다. 이 효율적이고 특정 라벨 방식은 차세대 시퀀싱을 통해 매우 낮은 배경과 높은 처리량 epigenomic 매핑과 5 HMC의 농축이 가능합니다.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

우리는 공부에 대한 강력한 생화학 및 미세 방법을...

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

배우세요 인간 유사섬 시스템을 활용한 형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가 방법을. 이 기술은 당뇨병 연구에서 베타세포 기능과 신호 전달 메커니즘을 실시간으로 분석하는 데 활용됩니다.

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

더 많은 동영상 탐색