세균성 세포의 전자 Cryotomography

이 비디오에서는 분자 분해능에서 거의 네이티브 상태에 있는 박테리아 세포의 3D 이미지가 전자 극저온 단층촬영에 의해 생성됩니다. 이는 먼저 온전한 세포를 급강하, 동결하거나 세포 펠릿을 고압 동결 및 동결 해부하여 수행됩니다. 일련의 M 프로젝션 이미지를 획득하여 3D 재구성 또는 Tom Graham을 생성하는 데 사용되며, 이는 분할되고 추가로 계산적으로 분석됩니다.

안녕하세요, 저는 Caltech 생물학과의 Grant Jensen이고, 프레젠테이션을 준비한 Sonya Chen입니다. 오늘 우리는 박테리아 세포의 전자 극저온 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여 드리겠습니다. 일반적으로 한 사람이 전체 절차를 수행하지만, 당사의 프로토콜은 공유된 경험을 통해 개발되었기 때문에 현재 실험실에서 일하고 있는 모든 사람을 포함할 것입니다.

비디오에는 소냐와 저 외에도 메건 도브로, 아리아나, 브리, 미겔, 알리스테어 맥도웰, 마크 로딘스키, 젠이 등장합니다. 그녀와 다른 연구실 구성원들은 컴퓨터 화면 캡처를 제작하고 Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova 및 Dylan Morris를 포함하여 함께 제공되는 서면 프로토콜을 준비하는 데 도움을 주었습니다. Ariana는 박테리아 세포를 얼리는 방법을 보여주면서 시작할 것입니다.

얇은 박테리아 세포의 경우, 온전한 세포의 현탁액이 EM 그리드를 가로질러 급히 동결됩니다. 여기에서는 상업용 자동 플런지 냉동고를 사용하여 박테리아 배양액을 검사하여 오염 물질이 없는지 확인하고 적절한 합류 또는 농도에서 탄소 코팅된 EM 그리드를 2-4분 동안 방전하는 것으로 프로세스를 시연합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 콜로이드 금 용액과 25마이크로리터의 5% BSA 용액을 혼합합니다.

혼합물을 18, 000G에서 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 금 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 20마이크로리터의 셀 용액에 Vitra 봇의 EM 그리드를 100% 습도로 배치합니다.

그런 다음 4마이크로리터의 세포 혼합물을 광선 방전 EM 그리드에 적용합니다. 그리드는 과도한 액체를 제거하기 위해 여과지로 양쪽에서 자동으로 얼룩진 다음 액체 질소로 냉각되는 에탄과 프로판의 액체 혼합물로 빠르게 떨어집니다. 에탄 프로판 혼합물에서 그리드를 조심스럽게 제거하고 액체 질소 아래에 보관된 그리드 보관 상자로 빠르게 옮깁니다.두꺼운 세포의 경우 고압 동결이 얼음 결정화를 방지합니다.

후속 cryosectioning은 샘플을 충분히 얇게 렌더링합니다. 이미징은 15ml의 세포를 1000RPM에서 3분 동안 원심분리하는 것으로 시작합니다. 원심분리 후, 0.5 밀리리터의 20% 덱스트린 동결 방지제와 함께 0.5 밀리리터의 상층 배양 펠릿 혼합물을 제거합니다.

그런 다음 13, 15초 동안 000RPM으로 다시 원심분리합니다. 세포가 펠릿화된 후, 슈퍼 펠릿 페이스트의 상등액 피펫 0.1ml를 이미 0.2ml의 20%덱스트린 저온 보호 원심분리기가 들어 있는 열 밀봉 마이크로 피펫 팁으로 제거합니다. 13, 000 RBM에서 30초 동안 마이크로 피펫 팁의 혼합물.

탈수 후 상층액을 제거합니다. 밀봉된 팁에서 5-10 마이크로리터의 단단한 펠릿이 보입니다. 이미 고압 냉장고 홀더 암에 장착된 테플론에 의하여 입힌 금관 악기 반구형으로 한 planchet의 1/2 돔으로 풀을 옮기고, 그 후에 그것의 편평한 파트너 금관 악기 모자로 밀봉하십시오.

그런 다음 암 어셈블리를 프라이밍된 고압 냉동고에 즉시 삽입하십시오. 2100bar 압력에서 셀을 포함하는 결합된 황동 판지 장치는 고압 액체 질소 제트에 의해 빠르게 냉각됩니다. 세포가 냉각된 후 암 어셈블리를 신속하게 제거하고 플랑셰트가 따뜻해지는 것을 방지하기 위해 액체 질소 욕조에 빠르게 담그십시오.

다음으로, 플란�chet�을 극저온 마이크로톰 챔버에 단단히 장착된 사전 냉각 크라이오 마이크로톰 바이스와 같은 척으로 옮겨 절단을 위해 잘 얼어붙은 세포 돔을 노출시킵니다. 두 개의 황동 판자는 액체 질소 아래에서 조심스럽게 분리됩니다. 완벽하게 얼어붙은 세포의 돔은 외관상 유리질이며 균열과 얼음 핵 형성 균열이 없습니다.

극저온 마이크로톰을 사용하여 외부 돔 영역을 0.2제곱밀리미터 미만으로 형성하고, 빠른 절편 속도를 가진 다이아몬드 트리밍 도구를 사용하고, 낮은 각도의 나이프와 구리 지지 그리드를 향하는 정전기 방지 스프레이로 약 200마이크로미터 깊이를 유지합니다. 가까운 거리에서 초당 약 0.4mm의 절단 속도와 좁은 절단 창을 사용하여 다이아몬드 나이프를 연마된 블록 면으로 조심스럽게 전진시킵니다. 50-350나노미터 두께의 슬라이스를 절편하기 시작합니다.

미세한 속눈썹 어플리케이터를 움직여 초기 부분을 걸고, 낮은 각도의 다이아몬드 나이프 엣지에서 미끄러지고, 구리 그리드 지지대를 가로질러 섹션의 리본을 지지하고 안내합니다. 그리드가 로드되면 냉각된 광택 처리된 은색 프로브를 사용하여 리본을 단단히 누릅니다. 현미경이 준비될 때까지 그리드 상자의 그리드를 액체 질소 냉각 건조 배송업체에 보관하십시오.

그리드의 박테리아 세포는 극저온 광학 현미경을 사용하여 이미지화할 수 있습니다. 여기에서는 맞춤형 Nikon 도립 현미경인 TIB와 수정된 FEI 극저온 스테이지가 사용됩니다. 극저온 스테이션의 카트리지에 그리드를 로드하고 구리 클립 링을 사용하여 클립으로 고정한 다음 카트리지를 액체 질소가 담긴 튜브에 넣어 전송합니다.

최대 2개의 카트리지를 사전 냉각 크라이오 스테이지에 로드하고 그리드를 보기 창으로 이동합니다. 그런 다음 콘덴서 렌즈를 내리고 대물 렌즈를 그리드에 초점을 맞춥니다. 세포를 찾아 이미지를 촬영합니다.

상관 LM 및 EM 연구용. 그리드는 나중에 em에서 셀을 찾기 위해 셀 영역 주위를 스캔합니다. 그리드를 이미징한 후 카트리지를 튜브에 다시 넣고 EM에서 이미징하여 박테리아 세포의 3D TOM을 얻을 준비가 될 때까지 튜브를 액체 질소에 보관합니다.

여기에서 극저온 TEM에서 하나 또는 두 개의 E를 따라 샘플이 점진적으로 기울어지는 동안 일련의 투영 이미지가 촬영되며, 극저온 스테이션의 다중 선택 홀더에 최대 6개의 카트리지를 최대 6개의 카트리지를 로드하는 극저온 T-E-M-F-E-I-T-F 30 극지 로드와 함께 레곤을 사용하여 절차를 시연합니다. 그런 다음 TF 30 Polar Select one 카트리지에 연결하고 EM 컬럼에 삽입합니다. EM 컴퓨터에서 클라이언트 소프트웨어에 대한 범례를 시작합니다.

세션에서 범례에 대한 이미지 조건을 입력합니다. 가장 낮은 배율부터 시작하여 이미지에서 대상을 선택하고 더 높은 배율로 다음 단계로 보냅니다. 그런 다음 틸트 시리즈 수집을 위해 모든 대상을 대기열에 넣고 모든 대상을 최종 단층 촬영 단계에 제출합니다.

일련의 이미지를 획득합니다. 샘플은 cryo TEM에서 하나 또는 두 개의 축을 따라 점진적으로 기울어집니다. 실험이 완료된 후 완성된 틸트 시리즈를 재건을 위해 로컬 워크스테이션에 다운로드합니다.

박테리아 세포의 Tomo Grahams는 특수 소프트웨어를 사용하여 계산됩니다. 프로그램 랩터는 Toms를 자동으로 재구성하는 데 사용되며 e tomo는 반자동으로 수행하는 데 사용할 수 있습니다. Im MOD의 3D 모드 뷰어를 사용하여 틸트 시리즈를 검사하고 추적 또는 기타 오류로 인해 생성될 가능성이 없는 것은 폐기하십시오.

좋은 tommo raptor는 기본 설정을 사용하여 실험실의 Linux 머신에 분산되어 실행됩니다. 단층 촬영을 생성하는 데 파일 크기에 따라 20분에서 2시간이 소요됩니다. Raptor가 실패하거나 조사자가 재구성이 최적인지 확인하고자 하는 경우 EMO를 사용하여 이미지를 수동으로 신중하게 정렬할 수 있습니다.

e tomo GUI의 각 탭에 있는 단계를 따라 Tilt 시리즈의 Tom Graham을 재구성합니다. 우리는 웹 기반 사내 데이터베이스를 사용하여 단층 촬영 데이터를 구성, 매장 검색 및 배포합니다. 기본 검색 페이지에는 미리보기 이미지와 영화와 같은 추천 YouTube가 표시됩니다.

각 토모 그레이엄을 위해. Tommo, Grahams를 얻은 후 개별 기능을 세그먼트화하여 모양을 시각화할 수 있습니다. 3D 분할(segmentation)은 3D 이미지의 각 vle을 특정 영역 또는 재료에 할당하는 프로세스입니다.

여기서 미러 소프트웨어는 각 영역이 다른 색상으로 표시되고 토모의 3D 영화 및 애니메이션에서 볼 수 있는 표면 모델을 생성하는 데 사용됩니다. Grahams는 프로젝트를 요약하고 결과를 3D 그래픽으로 설명하도록 만들 수 있습니다. 표시. Amira나 Kymera와 같은 소프트웨어를 사용하여 영화 및 광고의 개별 스틸 프레임을 렌더링할 수 있습니다.

Adobe Premier와 같은 영화 편집 소프트웨어를 사용하여 영화 광고 소프트웨어를 편집할 수 있습니다. Maya는 애니메이션을 생성하는 데 사용됩니다. Amira의 표면을 가져와서 키 프레임을 구성하고 영화로 렌더링할 수 있습니다.

여기에서는 Spiro Treponema Promesa에 대한 전체 세포 데이터의 대표적인 기울기 시리즈가 표시되며, 그 다음에는 재구성된 Tom Agram의 슬라이스별 보기가 표시됩니다. T Promesa 세포의 세분화는 외부 멤브레인, 내부 멤브레인 및 표면 보울 및 표면 후크 아케이드를 포함한 표면 구조를 구별합니다. 박테리아는 편모(flagella)와 울라모터(ular motor), 주위 플라즈마 원뿔(peri plasmic cone) 및 필라이(pillai)입니다.

이 기계 모델은 스피로헤테 트레포네마 프로메사가 어떻게 헤엄치고 내부 실린더 또는 코어가 외부 덮개로 둘러싸여 있는지 보여줍니다. 편모는 내부 실린더와 외부 칼집 사이의 페인트 롤러처럼 움직입니다. 편모가 회전함에 따라 내부 실린더 카운터는 외피 내에서 회전합니다.

점성이 없는 환경에서는 세포가 쓸모없이 회전하지만 T Promesa가 자연에서 발견되는 것과 같은 점성 환경에서는 외부 섬유 또는 기타 물체가 외부 덮개의 회전에 저항하여 내부 실린더의 회전을 가속화하고 세포가 앞으로 뚫을 때 밀어낼 수 있는 재료를 제공합니다. 여기에 표시된 것은 광학 현미경을 통해 관찰된 실제 T 프로메우스 세포입니다. 박테리아 세포의 전자 극저온 단층촬영(electron cryo tomography)을 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

물론 이러한 유형의 작업에는 상당한 투자가 필요하다는 것을 알고 있습니다. 초저온 전자 현미경과 형광 현미경은 정교하고 비싸기 때문에 적절하게 인용해야 합니다. 예를 들어, 이 방의 기초는 기계적으로 격리된 콘크리트 슬래브이며, 몇 피트 두께의 콘크리트 슬래브가 특별히 압축된 땅 위에 놓여 있습니다.

에어컨 시스템은 또한 큰 덕트와 완만한 곡선으로 맞춤 설계되어 외풍이나 난기류 없이 일정한 온도를 유지합니다. 보이는 커튼은 음향 소음을 줄이기 위해 배치됩니다. 마지막으로 이 방에 간섭 전자기장이 없는지 확인합니다.

현미경으로 보여드린 작업은 이제 대부분 자동화되었지만, 여전히 문제가 자주 발생하고 전문가의 진단이 필요합니다. 그럼에도 불구하고 이 영화를 보면서 이러한 유형의 작업과 관련된 절차와 도구를 이해하는 데 도움이 되었기를 바랍니다. 경청해 주셔서 감사합니다.