Name: 세균성 세포의 전자 Cryotomography (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 배우세요 세균 세포의 전자 크라이오토모그래피를 통해 근본 상태의 초미세 구조를 고해상도로 시각화하는 방법을. 급속 동결과 고압 동결 기법을 활용하여 3D 이미지를 재구성하고 세포 내 구조를 분석합니다.

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이 작품은 GJJ에 보건 보조금 R01 AI067548, R01 GM081520, R01 GM086200, R01 AI049194 및 P01 GM066521 국립 연구소뿐만 아니라 하워드 휴즈 의학 연구소, Caltech에서 베크맨 연구소와에서 Caltech에 선물로 일부 지원이 고든 무어와 베티 재단과 Agouron 연구소. MSL은 파멜라 S. Björkman에 NIH 부여 2R37 - A1041239 - 06A1에 의해 지원됩니다. Leica 마이크로 시스템즈 주식 회사 친절 cryosection 컬렉션의 비디오 콘텐츠를 제공했습니다. Treponema primitia의 대표적인 결과가 수집 및 처리 가빈 E. 머피에 의해, 그리고 제목이 &quot;Treponema primitia 및 운동성 위해 의미의 소설 ultrastructures&quot;와 분자 미생물에 게시되었습니다. (머피, G. 외., 몰. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
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<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
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<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 박테리아 세포 요법을 수행하는 방법이 비디오를 문서에 표시됩니다. 공간과 시간에 의해 제한, 우리는 일반적인 프로토콜을 보여줍니다. 자세한 내용은 논문, 장비 및 소프트웨어 개발자의 제조에 의해 제공된 온라인 또는 기타 정보, 그리고 요법 연구 그룹에서 찾을 수 있습니다. 공부 다른 세균 종에 따라 사용하는 장비와 세포의 구조 관심, 프로토콜 및 실험 매개 변수를 테스트하고 최적화해야합니다.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>0.1% 용액</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>금 콜로이드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>우혈청 알부민</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10%</td></tr><tr><td>Nr 1 여과지</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15-25%, MW 39000</td></tr><tr><td>황동 돔형 플랜쳇</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal-Tec HPm 010 고압 동결기</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-ultra 마이크로톰 UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond cryo trim 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Static line II 이오나이저</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CX100 Dry shipper</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSH 로딩 스테이션</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E/B 도립 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>맞춤 제작</td></tr><tr><td>Cryo LM 스테이지</td><td>FEI</td><td></td><td>맞춤 제작</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>Gatan의 UltraCam 포함</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

세균성 세포의 전자 cryotomography

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

많은 이미 세균 세포의 기본적인 신진 대사에 대한 알려져 있지만, 많은 근본적인 문제는 여전히 놀라울 정도로 그들이 생성하고 유지 특정 셀 모양, 극성을 설립, 자신의 genomes을 분리하고, 어떻게 분할 예를 들어 포함 답이 있습니다. 이러한 현상을 이해하기 위해 이미징 기술이 필요합니다 그 다리 형광 조명 현미경 및 X - 레이 crystallography와 NMR 분광법으로 높은 해상도의 방법 사이의 해상도 차이. 전자 cryotomography (요법)는 세포의 ultrastructure이 &quot;macromolecular&quot;해상도 (~ 4nm)의 세 차원 (3D)에 가까운 원시 상태에 시각 수 있도록, 이번 않는 새로운 기술입니다. 1, 2 년 요법, 세포는 낮은 온도에서 cryo 전송 전자 현미경 (cryoTEM)에 &quot;냉동 수산화&quot;상태, 유리체에서 몇 군데 아르 (&lt;-180 ° C). 슬림 전지 (두께 3 최대 ~ 500 nm의)의 경우, 손상 세포 수 있습니다 플런지 - 냉동 등 에탄이나 에탄 / 프로판 혼합물로 cryogens에서 EM 격자를 통해 미디어 이내. 두꺼운 세포 biofilms도 처음엔 &quot;고압 동결 &#39;과하여 유리 상태로 몇 군데있을 수있다, 그들을&quot;cryo는 - sectioning. &quot; 그것이 점차적으로 하나 또는 두 개의 축을 따라 기울어져와 같이 2 차원 투영 이미지의 시리즈는 다음 예제를 통해 수집하고 있습니다. 3 차원 재건, 또는 &quot;tomogram&quot;는 다음 그림에서 계산하실 수 있습니다. 요법은 비싼 장비를 필요로하지만, 최근 몇 년 동안, 그것은 다양한 외부 부속의 구조를 밝힐 수있는 몇 가지 실험실에서 사용되고 있으며, 다른 세포 봉투, cytoskeletal 필라멘트의 위치와 구조, 그리고 위치 및 대형 macromolecular의 아키텍처의 구조 이러한 flagellar 모터, 내부 구획 및 chemoreceptor 배열로 조립. 1, 2 이 비디오를 문서에서 우리는 샘플 준비 프로세스, 데이터 수집, tomogram 재건 및 세분화를 통해 가벼운 현미경과 어떤 경우의 상관 관계에있는 결과의 해석을 포함한 요법과 이미지 세포 방법을 보여줍니다.

가까운 원시 상태에서 세균 세포의 ultrastructure 연구를 전자 cryotomography (요법)를 사용하는 방법을 우리는 &quot;macromolecular&quot;(~ 4 NM) 해상도, 여기를 보여줍니다.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

박테리아 세포의 기본 대사에 대해 이미 많은 것이 알려져 있지만, ...를 포함하여 여전히 놀라울 정도로 많은 근본적인 질문들이 해결되지 않은 채로 남아 있습니다.

본 영상에서는 전자 저온 토모그래피를 통해 분자 해상도에서 거의 천연 상태에 가까운 박테리아 세포의 3D 이미지를 생성합니다. 이는 먼저 온전한 세포를 급속 동결시키거나, 또는 세포 펠릿을 고압 동결한 후 저온 절편화하여 수행합니다. 일련의 M 투영 이미지를 획득하여 3D 재구성 이미지인 토모그램(Tomogram)을 생성하며, 이를 분할하여 추가적인 컴퓨터 분석을 진행합니다.안녕하세요, Caltech 생물학부의 Grant Jensen입니다. 그리고 이번 발표를 준비한 Sonya Chen입니다. 오늘은 박테리아 세포의 전자 저온 단층 촬영(electron cryo tomography) 방법을 보여드리겠습니다. 일반적으로는 한 사람이 전체 과정을 수행하지만, 저희 프로토콜은 공동의 경험을 통해 개발되었으므로 현재 실험실에서 근무하고 있는 모든 인원을 참여시켜 진행하겠습니다.비디오에 등장하는 Sonya와 저 외에도 Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, mark Rodinsky, Jen이 보일 것입니다. Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova, Dylan Morris를 포함한 다른 실험실 구성원들은 컴퓨터 화면 캡처를 제작하고 함께 제공되는 서면 프로토콜 준비를 도왔습니다. 먼저 Ariana가 박테리아 세포를 급속 냉동(plunge freeze)하는 방법을 보여드리겠습니다.얇은 박테리아 세포의 경우, 온전한 세포 현탁액을 EM 그리드 위에 급속 냉동(plunge freeze)합니다. 여기서는 상용 자동 급속 냉동기를 사용하여 이 과정을 시연합니다. 먼저 박테리아 배양물을 확인하여 오염 물질이 없고 적절한 합류도(confluence) 또는 농도인지 확인하십시오. 탄소 코팅된 EM 그리드를 2~4분 동안 글로우 방전(glow discharge) 처리합니다. 다음으로, 100 µL의 콜로이드 금 용액과 25 µL의 5% BSA 용액을 혼합하십시오.혼합물을 18,000 G에서 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 금 펠렛을 재현탁합니다. 20 µL의 세포 용액에 EM 그리드를 넣고 습도 100%의 Vitra bot에 배치합니다.그런 다음 글로우 방전 처리된 EM 그리드에 세포 혼합액 4 µL를 도포합니다. 그리드는 필터 페이퍼를 통해 양면에서 자동으로 블로팅되어 과잉 액체를 제거하며, 이후 액체 질소로 냉각된 에탄과 프로판 혼합 액체 속으로 빠르게 침강시킵니다. 에탄-프로판 혼합물에서 그리드를 조심스럽게 꺼내 액체 질소 하에 보관된 그리드 보관함으로 빠르게 옮깁니다. 세포의 두께가 더 두꺼운 경우에는 고압 동결법을 사용하여 얼음 결정 형성을 방지합니다.이후 동결절편 제작을 통해 샘플을 em 촬영이 가능할 정도로 얇게 만듭니다. 이미징은 세포 15 milliliters를 1000 RPM에서 3분 동안 원심분리하는 것으로 시작합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 제거하고, 남은 배양 펠릿 0.5 milliliters를 20% dextrin 동결보호제 0.5 milliliters와 혼합합니다.그런 다음 13,000 RPM에서 15초 동안 다시 원심분리합니다. 세포가 펠렛 형태로 가라앉으면 상층액을 제거하고, 이미 0.2 milliliters의 20% dextrin 동결보호제가 들어 있는 열 밀봉된 마이크로 피펫 팁에 슈퍼 펠렛 페이스트 0.1 milliliter를 피펫으로 옮깁니다. 마이크로 피펫 팁 내의 혼합물을 13,000 RBM에서 30초 동안 원심분리합니다.원심분리 후 상층액을 제거합니다. 밀폐된 팁 끝에 5~10 µL 정도의 단단한 펠렛이 형성된 것을 확인할 수 있습니다. 이 페이스트를 고압 냉동기 홀더 암에 이미 장착된 테플론 코팅 황동 돔형 플랜쳇의 한쪽 돔으로 옮긴 후, 평평한 파트너 황동 캡으로 밀봉합니다.그런 다음 즉시 준비된 고압 동결기에 암 어셈블리를 삽입하십시오. 2100 bar 압력에서, 세포가 담긴 황동 플랑셰 유닛 결합체가 고압 액체 질소 제트에 의해 빠르게 냉각됩니다. 세포가 냉각되면, 암 어셈블리를 신속하게 제거하고 플랑셰가 가열되는 것을 방지하기 위해 액체 질소 욕조에 빠르게 담그십시오.다음으로, 절편 제작을 위해 잘 동결된 세포 돔이 노출되도록 플랜셰트를 크라이오 마이크로톰 챔버 내에 단단히 고정된 사전 냉각된 크라이오 마이크로톰 바이스형 척으로 옮깁니다. 두 개의 황동 플랜셰트는 액체 질소 하에서 조심스럽게 분리합니다. 완벽하게 동결된 세포 돔은 외관상 유리처럼 보이며 균열이나 얼음 핵 생성 틈새가 없어야 합니다.크라이오 마이크로톰을 사용하여 다이아몬드 트리밍 툴로 외곽 돔 영역을 0.2 square millimeters 미만으로 성형합니다. 이때 빠른 섹셔닝 속도를 유지하고 약 200 micrometer 깊이를 유지하며, 저각도 나이프와 구리 지지 그리드에 정전기 방지 스프레이를 분사합니다. 다이아몬드 나이프를 연마된 블록 면에 매우 가깝게 위치시킨 후, 약 0.4 millimeters per second의 절단 속도와 좁은 절단 창을 사용하여 조심스럽게 전진시킵니다. 50 내지 350 nanometer 두께의 슬라이스 섹셔닝을 시작합니다.미세 속눈썹 어플리케이터를 조절하여 초기 섹션들을 낚아챈 뒤, 낮은 각도의 다이아몬드 나이프 엣지에서 미끄러지듯 밀어내어 섹션 리본이 구리 그리드 지지대 위로 이동하도록 지지하고 안내합니다. 그리드에 적재가 완료되면, 냉각된 연마 은 프로브를 사용하여 리본을 단단하게 누릅니다. 현미경 준비가 완료될 때까지 액체 질소로 냉각된 드라이 쉬퍼 내의 그리드 박스에 그리드를 보관하십시오.그리드 위의 박테리아 세포는 저온 광학 현미경을 사용하여 이미징할 수 있습니다. 여기서는 수정된 FEI 저온 스테이지가 장착된 맞춤형 Nikon 도립 현미경 TIB가 사용됩니다. 저온 스테이션의 카트리지에 그리드를 넣고 구리 클립 링을 사용하여 고정한 다음, 전송을 위해 카트리지를 액체 질소가 담긴 튜브에 넣으십시오.최대 2개의 카트리지를 사전 냉각된 저온 스테이지에 장착하고 그리드를 관찰창으로 이동시킵니다. 그런 다음 콘덴서 렌즈를 내리고 대물렌즈를 그리드에 맞춰 초점을 잡습니다. 세포를 찾아 이미지를 획득합니다.상관 광학 및 전자 현미경(LM 및 EM) 연구를 위한 단계입니다. 이후 EM에서 세포의 위치를 찾기 위해 세포 주변 영역의 그리드를 스캔합니다. 그리드 이미징을 마친 후, 카트리지를 튜브에 다시 넣고 박테리아 세포의 3D TOM을 얻기 위해 EM 이미징 준비가 될 때까지 튜브를 액체 질소에 보관합니다.시료를 cryo TEM에서 하나 또는 두 개의 축을 따라 점진적으로 기울이면서 일련의 투영 이미지를 촬영합니다. 여기서는 legon을 사용하여 해당 절차를 시연하며, cryo station의 다중 선택 홀더(multi selection holder)에 최대 6개의 카트리지를 로드합니다. 그다음 이를 TF 30 Polar Select에 연결하고 카트리지 하나를 선택하여 EM 컬럼에 삽입합니다. EM 컴퓨터의 클라이언트 소프트웨어에서 legend를 시작합니다.세션의 범례에 이미지 조건을 입력하십시오. 가장 낮은 배율의 이미지부터 표적을 선택하여 더 높은 배율의 다음 단계로 전송하십시오. 그런 다음 틸트 시리즈 수집을 위해 모든 표적을 대기열에 추가하고, 이를 최종 토모그래피 단계로 제출하십시오.일련의 이미지를 획득합니다. 샘플은 cryo TEM 내에서 하나 또는 두 개의 축을 따라 점진적으로 기울어집니다. 실험이 완료되면, 재구성을 위해 완성된 틸트 시리즈를 로컬 워크스테이션으로 다운로드합니다.박테리아 세포의 토모그램(Tomo Grahams)은 전용 소프트웨어를 사용하여 계산합니다. Raptor 프로그램을 사용하여 토모그램을 자동으로 재구성하거나, e tomo를 사용하여 반자동으로 재구성할 수 있습니다. IMOD의 3D mod 뷰어를 사용하여 틸트 시리즈(tilt series)를 검토하고, 추적 오류나 기타 오류로 인해 결과물을 생성하기 어려운 데이터는 폐기하십시오.기본 설정을 사용하여 실험실 내 Linux 머신들에 분산 처리된 상태로 tommo raptor를 실행합니다. 토모그램을 생성하는 데는 파일 크기에 따라 20분에서 2시간 정도가 소요됩니다. Raptor가 실패하거나 연구자가 재구성 결과가 최적임을 확인하고자 할 때는, EMO를 사용하여 수동으로 이미지를 정밀하게 정렬할 수 있습니다.e tomo GUI의 각 탭에 있는 단계를 따라 틸트 시리즈(Tilt series)로부터 토모그램(Tomogram)을 재구성하십시오. 당사는 웹 기반의 자체 데이터베이스를 사용하여 토모그래피 데이터를 정리, 저장, 검색 및 배포합니다. 메인 브라우징 페이지에는 썸네일 이미지와 유튜브 스타일의 특징 영상이 표시됩니다.각 토모그램(tomo Graham)에 대하여, 토모그램을 얻은 후 개별 특징들을 분할하여 그 형태를 시각화할 수 있습니다. 3D 분할은 3D 이미지의 각 복셀(vle)을 특정 영역이나 물질에 할당하는 과정입니다.여기서는 미러 소프트웨어를 사용하여 각 영역이 서로 다른 색상으로 표시되는 표면 모델을 생성하고, 이를 토모그램의 3D 동영상 및 애니메이션으로 관찰합니다. 프로젝트를 요약하고 연구 결과를 3D 그래픽 표현으로 설명하기 위해 그래함(Grahams)을 제작할 수 있습니다. Amira 또는 Kymera와 같은 소프트웨어를 사용하여 동영상 및 상업용 영상의 개별 정지 프레임을 렌더링할 수 있습니다.Adobe Premier와 같은 동영상 편집 소프트웨어를 사용하여 홍보 영상을 편집할 수 있습니다. 애니메이션 생성에는 Maya가 사용됩니다. Maya는 Amira에서 생성한 표면 데이터를 가져와 키 프레임을 구성하고 이를 영상으로 렌더링할 수 있습니다.여기에 Spiro Treponema Promesa의 전체 세포 데이터에 대한 대표적인 틸트 시리즈가 제시되어 있으며, 이어서 재구성된 Tom Agram의 슬라이스별 뷰가 이어집니다. T Promesa 세포의 분할을 통해 외막, 내막 및 표면 보울(surface bowls)과 표면 후크 아케이드(surface hook arcade)를 포함한 표면 구조들이 구분됩니다. 이 박테리아는 편모 및 극성 모터, peri plasmic cone, 그리고 pillai를 가지고 있습니다.이 기계적 모델은 스피로헤타(spirochete)인 treponema Promesa가 어떻게 헤엄치는지 보여주며, 내부 실린더 또는 코어는 외부 시스(sheath)에 의해 둘러싸여 있습니다. 편모는 내부 실린더와 외부 시스 사이에서 페인트 롤러처럼 움직입니다. 편모가 회전함에 따라 내부 실린더는 외부 시스 내에서 반대 방향으로 회전합니다.비점성 환경에서 세포는 무용하게 회전하지만, T. promesea가 자연 상태에서 발견되는 것과 같은 점성 환경에서는 외부 섬유나 다른 물체들이 외초의 회전에 저항하여 내측 실린더의 회전을 가속화하며, 세포가 앞으로 파고들 때 밀어낼 수 있는 지지물을 제공합니다. 여기 보시는 것은 광학 현미경으로 관찰한 실제 T. promesea 세포입니다. 지금까지 박테리아 세포의 전자 저온 단층 촬영 방법을 설명해 드렸습니다.물론, 이러한 종류의 연구에는 막대한 투자가 필요하다는 점을 알고 있습니다. 초저온 전자 현미경과 형광 현미경은 정교하고 고가이며, 적절한 설치 환경 또한 갖춰야 합니다. 예를 들어, 이 실험실의 바닥은 특수하게 다져진 지반 위에 수 피트 두께의 기계적 진동 절연 콘크리트 슬래브를 설치하여 조성되었습니다.에어컨 시스템 또한 대형 덕트와 완만한 곡선으로 맞춤 설계되어, 외풍이나 난류 없이 일정한 온도를 유지합니다. 보시는 커튼은 음향 소음을 줄이기 위해 설치되었습니다. 마지막으로, 이 공간에 간섭을 일으키는 전자기장이 없는지 확인합니다.지금까지 현미경에서 보여드린 조작들은 이제 대부분 자동화되었지만, 여전히 문제가 빈번하게 발생하며 전문가의 진단이 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 이 영상을 통해 이러한 종류의 작업에 수반되는 절차와 기기 구성에 대해 이해하는 데 도움이 되었기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Chetrit, D., et al. Legionella pneumophila dot/icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 생세포 이미징 및 냉동 전자 단층 촬영을 적용합니다. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 박테리아 배양, 금 나노입자 마킹 및 유리화 기술을 결합하여 극저온 전자 단층 촬영을 위한 레지오넬라 뉴모필라 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 공정은 천연 세포 구조를 보존하고 막 관련 분비 시스템 구성 요소의 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

극저온 전자 단층 촬영을 위한 Legionella pneumophila 의 준비

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

이 프로토콜에는 남조류에 과도 DNA 압축을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 동기 재배, 형광 현미경 검사 법, 급속 한, 및 높은 모니터링 전압 cryo 전자 단층 촬영 사용 됩니다. 이러한 방법론에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 미래의 응용 프로그램 및 개발 논의.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

이 프로토콜의 목표는 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 그리드의 표적 영역에 세포 접착 및 성장을 지시하는 것입니다. 이는 세포 종자 전에 패턴화된 영역에서 세포외 매트릭스 단백질의 증착에 따라 사용자 지정 패턴에서 절제되는 항 파울링 층을 적용함으로써 달성된다.

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

이 프로토콜은 고압 냉동(HPF)과 와플 방법, 극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 리프트아웃, 선량 대칭 병렬 채취를 통합하여 두꺼운 조직에 대한 냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)을 표준화하여, 쥐 해마에서 재 현 가능한 현장 분석을 위한 균일하게 얇은 층상과 유리화 표본을 제공합니다.

쥐 해마에서 입증된 두꺼운 조직을 위한 냉동 전자 단층촬영 워크플로우

배우세요 세균 세포의 전자 크라이오토모그래피를 통해 근본 상태의 초미세 구조를 고해상도로 시각화하는 방법을. 급속 동결과 고압 동결 기법을 활용하여 3D 이미지를 재구성하고 세포 내 구조를 분석합니다.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

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