C. 예쁜꼬마선충 이동 추적: 웜의 이동을 평가하는 방법

- 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 이동을 평가하려면 카메라를 사용하여 한천판에서 지렁이의 움직임을 기록하여 기록하는 동안 판의 균일한 조명을 보장합니다. 플레이트 주위에서 벌레의 움직임을 제한하려면 구리 링을 사용하십시오. 구리는 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 혐오하기 때문에 지렁이는 고리 안에 모여 있습니다.

하나의 플레이트에 여러 개의 구리 링을 배치하여 각 링의 웜을 동시에 추적합니다. 이를 통해 대조 동물과 실험 동물에 대한 평가를 동일한 조건에서 수행할 수 있으므로 일일 변동성을 줄이고 나란히 비교할 수 있습니다. 설정된 시간 간격 동안 지렁이의 움직임을 기록하고 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이동 속도 및 이동 거리와 같은 기관차 동작의 특징을 분석합니다.

예제 프로토콜에서는 알코올이 웜의 운동 속도에 미치는 영향을 테스트하는 움직임 추적 분석의 시연을 볼

- 시작하려면 2분 이내에 각 실험 그룹에서 10마리의 벌레를 적응 플레이트의 구리 고리 중앙으로 옮기십시오. 이것은 에탄올이 없는 접시입니다. 벌레와 함께 음식을 옮기면 움직임이 줄어들므로 피하십시오. 또한 벌레가 굴을 파고 들어갈 수 있으므로 한천 표면을 손상시키지 마십시오. 플레이트에 적재되는 시간을 기록하고 각 플레이트로의 웜 이동을 2분 이상 시차를 두어 각 플레이트를 적절한 시간 간격으로 개별적으로 촬영할 수 있도록 합니다.

각 적응 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 적응 플레이트에 웜을 배치하는 데 사용된 순서에 따라 웜을 분석 플레이트로 옮깁니다. 박테리아가 없는 얇은 모서리의 납작한 지렁이 픽을 사용하여 퍼내는 동작을 사용하여 평평한 픽 위에 있는 지렁이를 수집합니다. 그런 다음 실험실 필름으로 플레이트를 밀봉하여 기화로 인한 에탄올 손실을 최소화합니다.

- 이 단계에서 동물이 이송되는 속도는 이송 된 동물이 에탄올에 더 오래 노출되기 때문에 매우 중요합니다. 따라서 실험 반복실험에서 플레이트에 먼저 배치되는 균주를 회전하는 것이 좋습니다.

- 지금 벌레를 촬영하려면 고해상도 비디오 카메라가 장착된 현미경이 필요합니다. 3인치 정사각형 백라이트와 같은 조명도 분석에 필수적입니다. 그런 다음 대비를 유지하려면 플레이트 미디어 면이 위로 향하게 이미지화합니다.

초당 한 프레임으로 120프레임, 12비트, 그레이스케일, 타임랩스 동영상을 캡처할 수 있는 이미지 분석 소프트웨어를 준비합니다. 충분한 이미지 해상도를 유지하면서 출력 파일의 크기를 줄이려면 2×2 비닝 모드를 사용하십시오.

이제 마지막 지렁이를 해당 플레이트에 놓고 10분 후에 각 플레이트에서 2분 분량의 동영상을 녹화합니다. 그런 다음 접시에 지렁이를 놓은 후 30분 후에 두 번째 2분 녹음을 합니다. 이 데모에서는 다양한 다른 소프트웨어를 이 기술에 적용할 수 있으므로 Image-Pro Plus 소프트웨어가 사용됩니다. 영화를 2분 분량으로 분석합니다.

먼저 배경이 평평해지고 웜 개체의 대비를 향상시키는 필터를 이미지에 적용합니다. 메뉴에서 Process(프로세스), Filters(필터), Enhancement(향상), Flatten(평면화)을 차례로 선택합니다. 어두운 배경과 20 Pix 피처 너비에 대한 매개변수를 설정합니다.

이제 구리 고리와 겹치는 원형 관심 영역을 사용하여 각 고리에 있는 동물의 이동을 개별적으로 분석합니다. Measure 하위 메뉴 아래에 있는 Track Objects 명령으로 웜을 식별하고 추적합니다.

추적 데이터 테이블 창에서 추적 옵션 단추를 사용하여 특정 추적을 제외할 수 있도록 하고 실험적 아티팩트를 제한할 수 있습니다. Auto Tracking 탭에서 트랙 매개변수를 프레임당 400미크론의 속도 제한으로 설정합니다. 가속 제한을 자동으로 설정합니다.

최소 총 트랙 길이를 400미크론으로 설정하고 우세 모션 유형을 카오틱으로 설정합니다. 그런 다음 트랙 파라미터(Track Parameter) 에서 부분 트랙(Partial Tracks)의 최소 길이가 21프레임이고 추적 프로젝션 깊이(Tracking Projection Depth)가 1프레임이 되도록 오브젝트를 설정합니다.

이제 추적 프로세스를 시작하려면 먼저 모든 트랙 자동 찾기 기능 버튼을 클릭하십시오. 그러면 Count/Size Options 대화 상자와 Tracking 대화 상자가 나타납니다. Count/Size(개수/크기) 대화 상자에서 Intensity Range Selection(강도 범위 선택)에 대한 Manual(수동) 옵션을 선택합니다. 이는 중요한 임계값 단계를 제공합니다. 그런 다음 Intensity Threshold(강도 임계값) 슬라이더를 조정하여 어두운 개체를 강조하는 포함 범위를 만듭니다. 척도의 좋은 시작점은 0에서 1,500 사이입니다.

이제 크기 필터를 적용하여 단일 웜보다 크거나 작은 개체를 제외합니다. Measure(측정) 메뉴로 이동한 다음 Measurement(측정) 하위 메뉴를 선택합니다. 그러면 개수/크기 옵션 대화 상자가 열립니다. 여기에서 영역 범위를 28,000에서 120,000제곱 미크론으로 설정합니다. 그리고 주변 범위를 600에서 2,500미크론으로 설정합니다. 비정상적인 크기의 웜을 사용할 때 이러한 매개변수를 조정하십시오.

이제 추적 대화 상자에서 계속을 클릭하여 추적 프로세스를 완료합니다. 출력이 영화 장면과 함께 추적되는지 다시 확인하십시오. 필터링해야 할 명확한 이유가 없는 한 모든 웜이 표시되는지 확인하십시오. 그런 다음 웜이 아닌 개체에서 생성된 트랙을 수동으로 삭제합니다.

다음으로, 각 프레임 또는 초 사이에 이동한 거리의 평균을 구하여 각 웜의 속도를 계산하고 각 모집단의 트랙에 대한 평균 속도를 만듭니다. 이 최종 평균을 실험의 통계 분석을 위한 하나의 표본 점으로 간주합니다.