C. elegans 추적 및 행동 측정

표형 분석. *C. elegans*의 이동 능력은 *C. elegans*의 행동에 관여하는 유전자와 뉴런을 발견하는 데 중요한 도구입니다. *C. elegans*는 체형을 변화시켜 전진 및 후진 운동, 그리고 다양한 유형의 회전과 같은 정형화된 이동 행동을 보입니다. 이러한 움직임을 긴 거리에서 높은 공간 및 시간 해상도로 정량화하기 위해, 우리는 한천 배지 표면을 기어가는 *C. elegans*의 움직임을 포착하는 웜 트래커(worm tracker)를 구축하였습니다.

저희는 또한 LabVIEW와 MATLAB으로 작성한 맞춤형 프로그램을 사용하여 이러한 움직임을 정량적으로 분리하고 분석하는 소프트웨어를 개발했습니다. 모든 비디오 추적 시스템의 과제는 매우 고차원적인 방대한 양의 데이터를 생성한다는 점입니다. 저희의 이미지 처리 및 데이터 분석 프로그램은 벌레의 형태를 일련의 독립 성분으로 환원함으로써 이 문제를 해결하였으며, 이를 통해 벌레의 행동을 단 3~4차원의 함수로 포괄적으로 재구성하였습니다.

한천 배지는 파이버 광원에 의해 조명되며 카메라로 촬영됩니다. 이 시스템은 XY 이동 스테이지에 장착되어 있습니다. 스테이지는 스테퍼 모터 컨트롤러에 연결된 표준 스테퍼 모터에 의해 이동합니다.

컨트롤러와 카메라는 컴퓨터에 연결되어 있으며 LabVIEW로 작성된 맞춤형 프로그램으로 제어됩니다. 카메라는 한천 배지 플레이트의 표면을 촬영하여 밝은 배경 위의 어두운 객체를 식별합니다. 자동 보정 과정을 위한 보정 마크는 한천 표면을 찔러서 만듭니다.

웜 픽(worm pick)을 사용하여 컴퓨터 프로그램이 실시간으로 객체를 정량화할 수 있도록 이미지 품질을 조정합니다. 카메라의 게인(gain), 밝기 및 셔터 속도를 조정하여 흰색 배경에 어두운 객체가 나타나도록 설정할 수 있습니다. 추적 프로그램에서 사용하는 필터링된 이진 이미지를 확인합니다.

이 소프트웨어에는 테스트 객체를 일정 거리만큼 이동시켜 캘리브레이션 행렬을 계산하는 자동 캘리브레이션 기능이 있습니다. 캘리브레이션 행렬을 통해 픽셀 단위의 거리가 스테퍼 모터의 이동 단계(step)로 보정됩니다.

보정이 완료되면 시스템을 사용할 준비가 되며, 배율을 변경하거나 카메라 위치를 조정하지 않는 한 다시 보정할 필요가 없습니다. 벌레들이 플레이트 가장자리로 이동하는 것을 막고 한곳으로 모으기 위해 구리 링을 사용합니다. 먼저 구리 링을 히트 블록 또는 그와 동등한 장치 위에 올려 가열하십시오.

링을 약 1분 동안 가열해야 합니다. 링을 새로운 한천 배지 플레이트에 올리고 살짝 눌러 한천 표면에 매립시킵니다. 그리고 L4 및 성체 단계의 벌레에서 먹이 찌꺼기를 세척하기 위해 NGM 버퍼가 채워진 한천 배지 플레이트를 사용합니다.

벌레들을 NGM 완충액으로 옮긴 후, 몇 분 동안 헤엄치게 둡니다. 세척된 벌레 중 한 마리를 조심스럽게 추적 플레이트의 링 중앙 근처에 놓습니다. 이 플레이트는 나중에 벌레 추적기(worm tracker)에 사용됩니다.

준비된 플레이트를 웜 트래커 스테이지 위에 놓습니다. LabVIEW 프로그램을 실행하고 이미지 저장 위치, 이미지 유형, 측정 항목 및 카메라 설정과 같이 필요한 옵션을 선택합니다. 조이스틱을 사용하여 컴퓨터 화면의 시야에 벌레의 이미지가 들어올 때까지 현미경을 이동시킵니다.

그런 다음 track을 눌러 추적 프로그램을 실행합니다. 여기서는 실시간으로 추적되는 벌레를 보여주고 있습니다. 컴퓨터 프로그램은 표시된 것과 같이 이진 필터링된 이미지의 움직임을 측정하며, 이 이미지에 대해 실시간으로 측정을 수행할 수 있습니다.

추적 후, 스테퍼 모터의 움직임을 통해 전체 궤적의 재구성이 가능하며, 벌레의 국소적인 형태 변화를 상세히 관찰할 수 있습니다. 벌레는 파동형 운동을 통해 기어갑니다. 우리는 벌레를 하나의 중심 곡선으로 스켈레톤화(skeletonizing)하고, 이 곡선을 일련의 각도로 기술함으로써 이러한 움직임을 포착합니다.

그 다음, 스켈레톤을 고유 벡터(eigen vectors)로 알려진 기본 형상들로 분해합니다. 이러한 고유 모드(eigen modes)를 통해 벌레의 형태를 재구성하고 움직임을 정량화할 수 있습니다. 두 번째 패널에서 볼 수 있듯이, 처음 두 가지 모드를 사용하여 벌레의 파동성 주기(undulatory cycle)의 위상 위치를 구체적으로 포착할 수 있습니다.

첫 번째 패널은 모드 1과 2의 결합 분포를 보여주며, 원형의 리미트 사이클(limit cycle)을 강조합니다. 한 방향으로의 위상 이동은 전진 운동에 해당하며, 반대 방향으로의 위상 이동은 후진 운동에 해당합니다. 따라서, 위상 속도는 벌레의 속도에 대응합니다.

실제 공간에서 위상과 실제 세계 속도의 강한 상관관계는 마지막 패널에서 확인할 수 있습니다. 고유 모드(Eigen mode)로부터 도출된 위상 속도를 사용하면, 육안으로는 놓치기 쉬운 sea elegance 행동의 미묘한 세부 사항들을 밝혀낼 수 있습니다. 예를 들어, 위상 속도와 위상의 결합 분포는 벌레들이 특정 이동 위상에서 우선적으로 전진 상태로 진입하거나 이탈한다는 것을 명확하게 보여줍니다.

본 연구에서는 표면 및 ACA 플레이트 위를 기어가는 실리콘의 행동을 상세한 이미지로 기록하는 사용하기 쉬운 추적 시스템을 시연하였습니다. 이러한 이미지에 포함된 정보의 양은 매우 방대하고 고차원이므로, 데이터를 네 가지 기본 측정값으로 차원을 축소하는 방법 또한 개발하였습니다. 이 측정값들은 벌레의 행동과 관련하여 해석하기 용이합니다.

본 연구는 소규모 변형에서의 벌레 행동을 측정하기 위해 고안되었으며, 이 시스템은 유전적 및 코팅된 영역을 이용하여 신경 세포 활동을 측정하는 데에도 활용될 수 있습니다. 시스템 전체의 설계가 유연하여 Doof law, LOEs와 같은 다른 크롤링 시스템과 함께 사용할 수 있습니다.