Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Coloque um verme transgênico expressando GCaMP - uma proteína de sensoriamento de cálcio - em uma câmara de imagem juntamente com alimentos bacterianos para o verme. Em seguida, sele o prato com a tampa e filme de laboratório para evitar a evaporação. Vista-o sob um microscópio composto equipado para epifluorescência de campo largo.
Vermes transgênicos expressam uma proteína sensor GCaMP sob o controle de um promotor que impulsiona a expressão GCaMP em um neurônio específico. Quando esse neurônio é ativado, ele dispara um potencial de ação, que despolariza a membrana plasmática. Após a despoluição, canais de cálcio fechados de voltagem se abrem na membrana plasmática.
GCaMP no neurônio excitado liga os íons de cálcio. Isso faz com que o GCaMP fluoresce quando os vermes são imagens com uma luz de excitação de fluorescência de baixa intensidade. No protocolo de exemplo, usaremos imagens de cálcio para visualizar a atividade interneuron AVA em C. elegans transgênicos em microchambers agarose.
- A imagem de cálcio é realizada em um microscópio composto equipado para epifluorescência de campo largo. Para limitar a exposição à luz, use um sinal lógico transistor-transistor que acione um LED para iluminar a amostra ao mesmo tempo que a câmera registra um quadro.
Execute um filme estourado por 24 horas que imagens cada verme a cada 15 a 30 minutos. Primeiro, grave 20 segundos com DIC, depois 20 segundos com fluorescência GFP, e finalmente, uma imagem do sinal mKate2 para níveis de expressão de controle.
Para inspeção de dados visuais, use um mapa de cores falso para melhorar a visibilidade de pequenas mudanças na intensidade da fluorescência. Por fim, realize a análise de dados de cálcio usando procedimentos padrão.
