Mekanisk dissociation: En metod för att erhålla livskraftiga celler från en vävnad

Väg först ett vävnadsfragment och mät dess längd, bredd och höjd. Placera vävnaden i en kulturrätt med ett odlingsmedium och tärna den i små bitar med en skalpell. Överför allt till ett C-rör för homogenisering med en Pasteur-pipett.

Placera röret i en mekanisk dissociator och kör cykler efter behov. Apparaten använder mekaniska krafter för att extrahera livskraftiga enstaka celler från vävnadsprovet samtidigt som cellulär integritet bibehålls, inklusive ytproteinerna. Dekantera homogenatet genom en cellsil fastsatt på ett centrifugrör.

Rehomogenize den återstående vävnaden och spänn homogenatet genom cellsilen i röret. Centrifugera homogenatet och ta bort supernaten. Nu, återanvänd cellpelleten i odlingsmediet och överför en liten mängd cellfjädring till ett rör som innehåller trypanblå fläck.

Efter färgning, överför cellerna till en hemocytometerbild. Räkna de genomskinliga livskraftiga cellerna. De döda cellerna tar upp fläcken, eftersom deras cellmembran inte är intakt. I följande protokoll kommer vi att utföra icke-enzymatisk dissociation av färsk mänsklig vävnad för kvantitativ och kvalitativ analys av CD45 + celler.

- Börja med att väga vävnadsprovet och sedan mäta vävnadens längd, bredd och höjd. Överför sedan vävnadsfragmentet till en liten petriskål som innehåller 1 milliliter av lämpligt kemiskt definierat, serumfritt, hematopoetiskt cellmedium och använd en steril skalpell för att tärna proverna i små 1 till 2 kvadratmillimeterbitar. Överför sedan skålinnehållet till ett mekaniskt dissociator C-rör och skölj skålen och skalpellen med 2 milliliter medium.

Tillsätt tvätten i C-röret och kör sedan 8.01 mekanisk dissociatorprogram två gånger i följd för att försiktigt homogenisera vävnadsfragmenten till en enda cellupphängning. Efter den andra cykeln, dekantera homogenatet genom en 40-mikrometer cell sil i en 50-milliliter koniska rör. Använd sedan samma Pasteur-pipett från att tvätta petriskålen för att överföra eventuell vätska som finns kvar i C-röret till cellsilen.

Använd sedan en 1 milliliter mikropipett för att överföra den filtrerade vätskan till ett 15 milliliter koniskt rör och skölj C-röret med ytterligare 3 milliliter medium. Överför denna tvätt genom cellsilen till 50 milliliterröret. Flytta sedan försiktigt den ofhomogeniserade vävnaden runt silen med en ren 1 milliliter spets för att pressa den maximala mängden restvätska som fastnat i vävnaden i 50-milliliterröret. Placera nu cellsilen upp och ner ovanpå det ursprungliga C-röret och skölj silen med ytterligare 3 milliliter medium så att den oförhomogeniserade vävnaden faller tillbaka i C-röret.

Rehomogenize vävnaden för ytterligare två cykler som just visats, och häll sedan den andra homogenate genom cell silen igen. Skölj C-röret med ytterligare 3 milliliter medium. Filtrera sedan supernatanten genom silen och pressa ut restvätskan ur vävnaden, som just visats. Vid denna tidpunkt bör en volym på cirka 2,5 milliliter enkelcellsfjädring finnas i 15-milliliterröret, och cirka 9 milliliter bör observeras i 50-milliliterröret.

För att separera vävnaden supernatant från cellerna, först centrifugera båda rören av homogenitet i 15 minuter vid 600 Gs vid rumstemperatur. Dekanta supernaten från 15-milliliterröret i ett 1,5 milliliter rör, placera det på 4 grader Celsius och kassera supernaten från 50-milliliterröret. Knacka sedan försiktigt på varje rör på en hård yta för att bryta upp var och en av cellpelletsen.

Återanvände den lösa cellpelleten i 50-milliliterröret med 500 mikroliter medium och överför cellerna till 15-milliliterröret för att återanvända den andra pelleten. Skölj sedan 50-milliliterröret med ytterligare 500 mikroliter medium och överför tvätten till 15-milliliterröret för maximal cellåtervinning. Efter att ha räknat antalet livskraftiga celler genom trypan blå uteslutning, pellet cellen suspension.

Slutligen snurra ner den reserverade vävnaden supernatant. Överför sedan försiktigt supernatanten till minst ett rent rör utan att röra eller störa pelleten och lagra den vid negativa 80 grader Celsius för framtida nedströmsanalys.