Name: gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 배우세요 gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 비장에서 단일 세포 현탁액을 효율적으로 제조하는 방법을. 이 기술은 면역학 및 세포 생물학 연구에서 살아있는 세포 분석에 필수적입니다.

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장비 소개 <ol><li> 조직은 가능한 단일 셀 suspensions에 보라색 C 튜브를 사용하여 부드럽게 dissociated 있습니다. </li><li> PBS / BSA EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼는 세포를 떼어 놓다하는 데 사용됩니다. 버퍼는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 솔루션을 Rinsing autoMACS 20 부분 BSA 주식 솔루션 1 부분을 추가하여 준비가되어 있습니다. </li><li> 맥 사전 분리 필터는 성공적인 맥 분리 및 후속 분석을 추진, dissociated 조직 샘플은 모든 세포 대단히 짧은 시간 무료 수 있도록하는 데 사용됩니다. </li></ol> 비장 세포를 Dissociating <ol><li> 전체 spleens은 gentleMACS의 Dissociator를 사용 splenocytes의 단일 셀 suspensions에 disscociated 있습니다. </li><li> 절차를 시작하려면 spleens의 질량에 따라 버퍼의 볼륨 C 튜브를로드합니다. 젊은 성인 여성의 BALB / C 마우스의 건강한 비장은 80-120에 대한 MG 무게. 이 질량의 모든 1-2 spleens 버퍼 3 ML이 필요합니다. 감염과 오래된 동물이나 동물에서 Spleens는 종종 큰되며 버퍼에 무게해야합니다. 버퍼 볼륨 따라 크기를 조정해야합니다. 10 ML 총 버퍼 량을 초과하지 마십시오. </li><li> 버퍼 3 ML를 포함하는 C 튜브로 해부하는 비장을 추가합니다. </li><li> C 튜브 뚜껑이 꽉 있는지 확인하고 아래 뚜껑으로 dissociator에 C 튜브를 연결합니다. </li><li> dissociator 최대 전력. 1-2 spleens 들어, 프로그램 m_spleen_01을 선택합니다. 이 프로그램은 완료 56초를 취할 것입니다. spleens의 수가 큰 경우, 프로그램 m_spleen_04을 사용하여,이 프로그램은 비장 조직의 720 밀리그램을 위해 사용할 수 있습니다. </li><li> 프로그램의 완성 후에 기본 비장 조직 splenocyte 현탁액에 dissociated 있습니다. </li><li> 약 30 초에 대한 상온에서 300xg에서 전체 세포 현탁액을 스핀. 이것은 로터와 스테 이터가 C 튜브의 하단에 수집된 모든 세포의 해제되어 있는지 확인합니다. </li><li> 1000 microliter의 pipetter를 사용하여 C 튜브 캡의 심장 - 봉인 개방을 통해 샘플을 제거합니다. </li></ol> 여과 단계 <ol><li> 여과 단계를 시작하려면 사전 분리 필터 30 μm의 기공 크기가 셀 스트레이너에 dissociated 조직을 적용합니다. 스트레이너는 2 개 이상 spleens 1-2 spleens 또는 50 ML 튜브에 대한 15 ML 튜브에 맞게해야합니다. </li><li> 세포 현탁액이 통과하자. 그렇다면 버퍼의 5 ML을 적용하여 필터를 세척. </li><li> 자, 비장 세포 펠렛의 모든 splenocytes를 수집하는 10 분 동안 상온에서 300xg에서 세포 현탁액으로 튜브를 원심 분리기. </li><li> 이제 우리는 dissociated splenocytes의 펠렛을 가지고, 우리는 뜨는을 기음과 버퍼의 적절한 금액 세포 펠렛을 resuspend한다. </li></ol> gentleMACS의 Dissociator를 사용하여 비장의 분리는 MACSQuant 분석기를 사용 유동세포계측법으로 증명 가능한 splenocytes의 높은 비율을 얻을 것입니다. 죽은 세포는 propidium 요오드화물의로 물들어있다. 제공된 예제에서는 앞으로 사이드 분산형 점 줄거리는 준비된 splenocytes를 보여줍니다.

모든 프로토콜 및 데이터 시트는에서 구할 수 있습니다<a href="http://www.miltenyibiotec.com"&gt; http://www.miltenyibiotec.com.</a&gt;.

지루하고 고통스러운 종종 수동 dissociations를 방지하려면 gentleMACS의 Dissociator 하나는 제어하고 재현성 조건 하에서 매우 효율적으로 조직을 떼어 놓다 수 있습니다. 조직 분리 절차는 높은 생존 속도로 세포 수율 세포 suspensions에 부드러운 있습니다. C 튜브와 함께 gentleMACS의 Dissociator 다양한 조직에서 단일 셀 suspensions의 준비를 위해 설계되었습니다. 악기는 마우스 비장, 간, 폐, 또는 신경 조직을 떼어 놓다로 사전 설정된 프로그램의 숫자를 갖추고 있습니다. 프로그램 및 프로토콜의 범위는 지속적으로 추가 조직을 포함하도록 확장됩니다.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; 시작 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>13 mL 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-596</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS&amp;#8482; 세척액 </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS&amp;#174; BSA 스톡 용액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>&lt;장비 소개
조직은 violet C Tube를 사용하여 생존 가능한 단일 세포 현탁액으로 완만하게 해리됩니다. 세포 해리를 위해 PBS/BSA EDTA 완충액이 사용됩니다. 이 완충액은 BSA 스톡 솔루션 1부와 EDTA가 포함된 autoMACS Rinsing Solution 20부를 혼합하여 준비합니다. 해리된 조직 샘플에서 모든 세포 응집물을 제거하여 성공적인 MACS 분리와 후속 분석을 촉진하기 위해 MACS Pre-Separation Filter를 사용합니다.

비장 세포 해리
전체 비장은 gentleMACS Dissociator를 사용하여 비장세포의 단일 세포 현탁액으로 해리됩니다. 절차를 시작하려면 비장의 질량에 따라 적절한 양의 완충액을 C Tube에 넣으십시오. 건강한 성체 암컷 BALB/c 마우스의 비장 무게는 약 80-120 mg입니다. 이 정도 질량의 비장 1-2개당 3 mL의 완충액이 필요합니다. 노령 동물이나 감염된 동물의 비장은 흔히 더 크므로 완충액 내에서 무게를 측정해야 하며, 이에 따라 완충액의 양을 조정해야 합니다. 전체 완충액의 양이 10 mL를 초과하지 않도록 하십시오.

절제된 비장을 완충액 3 mL가 들어 있는 C Tube에 넣으십시오. C Tube 캡이 단단히 닫혔는지 확인하고 캡이 아래로 향하도록 C Tube를 해리기에 연결하십시오. 해리기의 전원을 켭니다. 비장이 1-2개인 경우 m_spleen_01 프로그램을 선택하십시오. 프로그램 완료까지 56초가 소요됩니다. 비장의 수가 더 많은 경우에는 m_spleen_04 프로그램을 사용하십시오. 이 프로그램은 최대 720 mg의 비장 조직까지 사용할 수 있습니다. 프로그램이 완료되면 천연 비장 조직이 비장세포 현탁액으로 해리됩니다.

전체 세포 현탁액을 실온에서 300xg로 약 30초 동안 원심 분리하십시오. 이렇게 하면 로터와 스테이터에서 모든 세포가 제거되어 C Tube 바닥에 수집됩니다. 1000 $\mu\text{L}$ 피펫을 사용하여 C Tube 캡의 격막 밀봉 개구부를 통해 샘플을 제거하십시오.

여과 단계
여과 단계를 시작하려면 해리된 조직을 Pre-Separation Filter 또는 공극 크기가 30 $\mu\text{m}$인 세포 스트레이너에 적용하십시오. 스트레이너는 비장 1-2개의 경우 15 mL 튜브에, 2개 이상의 경우 50 mL 튜브에 맞아야 합니다. 세포 현탁액이 통과하도록 둡니다. 그런 다음 완충액 5 mL를 가하여 필터를 세척하십시오. 이제 세포 현탁액이 든 튜브를 실온에서 300xg로 10분 동안 원심 분리하여 모든 비장세포를 비장세포 펠렛으로 수집하십시오.

해리된 비장세포 펠렛이 준비되면 상층액을 흡입 제거하고 세포 펠렛을 적절한 양의 완충액에 재현탁해야 합니다. gentleMACS Dissociator를 이용한 비장 해리는 높은 비율의 생존 비장세포를 얻을 수 있으며, 이는 MACSQuant Analyzer를 이용한 유세포 분석으로 증명됩니다. 사멸 세포는 propidium iodide로 염색됩니다. 제공된 예시에서 전방 산란 및 측방 산란 도트 플롯(forward side scatter dot plot)은 준비된 비장세포를 보여줍니다.&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>분리 전 필터 </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 용액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

gentlemacs dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 suspensions의 준비

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

단일 셀 suspensions는 세포 분리, 세포 분석 및 세포 배양 실험에 꼭 필요합니다. 지루하고 고통스러운 종종 수동 dissociations을 피하기 위해 gentleMACS의 Dissociator 하나는 제어하고 재현성 조건 하에서 매우 효율적으로 조직을 떼어 놓다 수 있습니다. gentleMACS의 Dissociator는 최적의 사용자 안전을 절약해주는 및 표준화를 결합, 마우스 비장을 떼어 놓다 수 있습니다. 이 동영상은 gentleMACS Dissociator, 기계적으로 생균 suspensions을 생산하기 위해 특수 튜브를 사용하여 조직을 중단 수있는 자동화된 벤치 - 탑 장치를 사용 마우스 spleens을 떼어 놓다하는 방법에 대해 설명합니다. 분리 후, spleens는 여과 centrifuged, 추가적인 애플 리케이션을위한 resuspended 있습니다.

이 동영상은 마우스 splenocytes의 단일 셀 suspensions를 준비하는 gentleMACS의 Dissociator를 사용하여 자동 조직 분리에 대한 간단한 시간 절약 기법을 설명합니다.

gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

단일 세포 현탁액은 세포 분리, 세포 분석 및 세포 배양 실험을 위한 필수 전제 조건입니다. 지루하고 종종 고통을 수반하는 수동 작업을 피하기 위해...

이 비디오 프로토콜에서는 특수 튜브를 사용하여 조직을 기계적으로 분쇄함으로써 생존 가능한 세포 현탁액을 생성하는 자동 벤치탑 장치인 Gentle Max를 사용하여 마우스 비장을 해리하는 방법을 살펴봅니다. 해리 후 비장은 Max Pres 분리 필터로 여과하고, 원심 분리하여 추가 응용을 위해 현탁시킵니다. 안녕하세요, 제 이름은 Melanie mlu입니다.저는 독일 BE Lab Park에 위치한 Milton Biotech의 연구원입니다. 오늘은 GenX dissociation을 사용하여 마우스 비장에서 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다. GenX dissociation을 이용하면 단일 세포 현탁액을 매우 쉽고 빠르게 준비할 수 있습니다.그럼 시작하겠습니다. 지루하고 때로는 고통스러운 수동 해리를 피하기 위해, gentle max di associator를 사용하면 제어 가능하고 재현 가능한 조건 하에서 조직을 매우 효율적으로 해리할 수 있습니다. 조직은 violet C tubes를 사용하여 생존 가능한 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 해리됩니다.C 튜브는 캡 중앙으로 이어지는 격막 밀봉 개구부를 제공하여, 멸균 상태를 항상 유지하면서 튜브 내부로 피펫팅을 할 수 있게 합니다. 해리된 세포를 부유시키려면 적절한 PBS-BSA-EDTA 완충액을 사용해야 합니다. 이 완충액은 BSA 스톡 용액 1분량에 EDTA가 포함된 AutoMax fencing 용액 20분량을 첨가하여 조제합니다.Max Pres 분리 필터를 사용하여, 해리된 조직 샘플에서 모든 세포 덩어리를 제거함으로써 성공적인 최대 분리와 후속 분석을 촉진합니다. 절차를 시작하기 위해 C 튜브에 일정량의 완충액을 넣습니다. 비장의 질량에 따르면, 6~7주 된 암컷 생검 마우스의 건강한 비장은 약 80~120 mg 정도입니다.이 정도 질량의 비장 1~2개당 3 mL의 완충액이 필요합니다. 총 부피가 10 mL를 초과하지 않도록 하십시오. 이제 분리한 비장을 3 mL의 완충액이 들어 있는 C 튜브에 넣을 수 있습니다. 고령의 동물이나 감염된 동물의 비장은 흔히 크기가 더 크므로 완충액 내에서 무게를 측정해야 합니다.이후 버퍼 부피를 그에 맞춰 조정해야 하며, 이때 총 부피가 10 milliliters를 초과해서는 안 됩니다. 이제 C tube 캡이 단단히 닫혔는지 확인하고 C tube를 해리 장치에 연결하십시오. 캡이 아래로 향하게 한 상태에서, 1~2개의 비장을 해리하기 위해 전원을 켜고 Program M spleen oh one을 선택하십시오. 프로그램 완료까지 56초가 소요됩니다. 비장의 수가 더 많은 경우에는 program M spleen oh four를 사용하십시오.이 프로그램은 최대 720 mg의 비장 조직까지 사용할 수 있습니다. 프로그램이 완료되면 천연 비장 조직이 PLE 세포 현탁액으로 해리되며, 다음과 같은 모습이 됩니다. 튜브 바닥에 샘플을 모으기 위해 잠시 원심 분리하십시오. 이렇게 하면 로터와 스테이터에 남아 있던 모든 세포가 C 튜브 바닥으로 수집되어 완전히 제거됩니다.1,000 µL 피펫을 사용하여 C 튜브 캡의 세푬 밀봉 개구부를 통해 샘플을 추출합니다. 여과 단계를 시작하려면 분리된 조직을 전분리 필터 또는 30 µm 공극 크기의 스트레이너에 적용합니다. 스트레이너는 비장 1~2개를 처리할 때는 15 mL 튜브에, 2개 이상의 비장을 처리할 때는 50 mL 튜브에 맞게 선택해야 합니다.세포 현탁액을 통과시킨 후, 버퍼 5 mL를 가하여 필터를 세척하십시오. 이제 세포 현탁액이 담긴 튜브를 상온에서 300 Gs로 10분간 원심분리하여 모든 세포를 비장 세포 펠렛으로 수집합니다. 분리된 세포 펠렛이 형성되었으므로, 상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠렛을 적절한 양의 비장 분리 버퍼에 다시 현탁해야 합니다.GentleMax를 사용하면 높은 비율의 생존 가능한 PLE 세포를 얻을 수 있으며, 이는 MaxQuant를 이용한 유세포 분석으로 입증됩니다. 죽은 세포는 Propidium iodide로 염색되며 예시가 제공됩니다. 전방 및 측방 산란점 도표는 준비된 SP 세포를 보여줍니다.Gentle X 해리를 사용하여 비장 조직을 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 샘플 크기에 맞게 버퍼 양을 조절하고 적절한 Gentle X 프로그램을 선택하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다.실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 항원에 특정한 T 림프구 쥐 라인의 체외 확장에 사용되는 T 세포 성장 인자의 준비를 설명합니다.

랫 Splenocytes에서 T 세포 성장 인자 준비

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직의 동요에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 폐 조직에서이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

특정 조직 유형의 세포를 Dissociating하면 조직 aggitation에 대한 특정 매개 변수가 가능한, culturable 세포의 높은 볼륨을 얻기 위해 필요합니다. Miltenyi gentleMACS Dissociator은 간단하고 실용적인 프로토콜이 작업을 최적화합니다. 이 발행물에서 nerual 조직이 장치의 사용이 설명되어 있습니다.

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

이 비디오는 고염 처리된 항원 제시 수지상 세포(DC)를 마우스로 입양하는 절차를 보여줍니다. 쥐 CD11c+ 수지상 세포(DC)는 다량의 나트륨을 함유한 배지에 노출되어 세포에서 이소레부글란딘(IsoLG)-단백질 부가물을 형성합니다. 이러한 부가물은 신생항원 역할을 하며 DC 표면에 표시됩니다. 고염 처리된 세포는 입양 세포 전달을 통해 마우스에 주입됩니다.

수지상 세포의 고염 처리 및 마우스로의 채택 전달 방법

이 비디오는 쥐의 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 뇌 조직에서 세포를 분리하기 위한 효소 소화와 밀도 구배 원심분리를 포함하여 밀도에 따라 면역 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

쥐 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액 준비

유동 세포 계측법하는 T 세포 내의 염색질의 상태를 평가하기 위해 이용 될 수있다. 이 프로토콜은 과학자 형광 히스톤 H3 항체의 평균 개화 강도 (MFI)의 증가에 의해 입증 T 세포 활성화시 염색질 decondensation의 기록을 해석 할 수 있도록...

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

여기, 선물이 자기 세포 분류와 순진한 쥐로 후속 입양 전송 murine spleens에서 수지상 세포를 분리 하는 프로토콜. 높은 소금 활성화 수지상 세포의 모델 입양 전송 및 cytometry의 단계별 절차를 설명 하기 위해 선택 되었다.

절연 및 높은 소금의 입양 전송 처리 수지상 세포를 항 원 제시

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

이 기사에서는 반고체 기저막 매트릭스 내에서 비장 세포를 응집하고 캡슐화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 기저막 매트릭스 구축물은 오가노이드 발달 연구 또는 생체 내 이식 및 조직 재생 연구를 위한 3차원 배양에 사용할 수 있습니다.

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여기에서는 콜라겐분해효소 I형과 초원심분리를 통한 소화를 조합하여 생쥐 비장 유래 엑소좀을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues(생쥐 비장 조직에서 유래한 엑소좀의 분리 및 특성 분석)

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