gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

이 비디오 프로토콜에서는 특수 튜브를 사용하여 조직을 기계적으로 분쇄함으로써 생존 가능한 세포 현탁액을 생성하는 자동 벤치탑 장치인 Gentle Max를 사용하여 마우스 비장을 해리하는 방법을 살펴봅니다. 해리 후 비장은 Max Pres 분리 필터로 여과하고, 원심 분리하여 추가 응용을 위해 현탁시킵니다. 안녕하세요, 제 이름은 Melanie mlu입니다.

저는 독일 BE Lab Park에 위치한 Milton Biotech의 연구원입니다. 오늘은 GenX dissociation을 사용하여 마우스 비장에서 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다. GenX dissociation을 이용하면 단일 세포 현탁액을 매우 쉽고 빠르게 준비할 수 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 지루하고 때로는 고통스러운 수동 해리를 피하기 위해, gentle max di associator를 사용하면 제어 가능하고 재현 가능한 조건 하에서 조직을 매우 효율적으로 해리할 수 있습니다. 조직은 violet C tubes를 사용하여 생존 가능한 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 해리됩니다.

C 튜브는 캡 중앙으로 이어지는 격막 밀봉 개구부를 제공하여, 멸균 상태를 항상 유지하면서 튜브 내부로 피펫팅을 할 수 있게 합니다. 해리된 세포를 부유시키려면 적절한 PBS-BSA-EDTA 완충액을 사용해야 합니다. 이 완충액은 BSA 스톡 용액 1분량에 EDTA가 포함된 AutoMax fencing 용액 20분량을 첨가하여 조제합니다.

Max Pres 분리 필터를 사용하여, 해리된 조직 샘플에서 모든 세포 덩어리를 제거함으로써 성공적인 최대 분리와 후속 분석을 촉진합니다. 절차를 시작하기 위해 C 튜브에 일정량의 완충액을 넣습니다. 비장의 질량에 따르면, 6~7주 된 암컷 생검 마우스의 건강한 비장은 약 80~120 mg 정도입니다.

이 정도 질량의 비장 1~2개당 3 mL의 완충액이 필요합니다. 총 부피가 10 mL를 초과하지 않도록 하십시오. 이제 분리한 비장을 3 mL의 완충액이 들어 있는 C 튜브에 넣을 수 있습니다. 고령의 동물이나 감염된 동물의 비장은 흔히 크기가 더 크므로 완충액 내에서 무게를 측정해야 합니다.

이후 버퍼 부피를 그에 맞춰 조정해야 하며, 이때 총 부피가 10 milliliters를 초과해서는 안 됩니다. 이제 C tube 캡이 단단히 닫혔는지 확인하고 C tube를 해리 장치에 연결하십시오. 캡이 아래로 향하게 한 상태에서, 1~2개의 비장을 해리하기 위해 전원을 켜고 Program M spleen oh one을 선택하십시오. 프로그램 완료까지 56초가 소요됩니다. 비장의 수가 더 많은 경우에는 program M spleen oh four를 사용하십시오.

이 프로그램은 최대 720 mg의 비장 조직까지 사용할 수 있습니다. 프로그램이 완료되면 천연 비장 조직이 PLE 세포 현탁액으로 해리되며, 다음과 같은 모습이 됩니다. 튜브 바닥에 샘플을 모으기 위해 잠시 원심 분리하십시오. 이렇게 하면 로터와 스테이터에 남아 있던 모든 세포가 C 튜브 바닥으로 수집되어 완전히 제거됩니다.

1,000 µL 피펫을 사용하여 C 튜브 캡의 세푬 밀봉 개구부를 통해 샘플을 추출합니다. 여과 단계를 시작하려면 분리된 조직을 전분리 필터 또는 30 µm 공극 크기의 스트레이너에 적용합니다. 스트레이너는 비장 1~2개를 처리할 때는 15 mL 튜브에, 2개 이상의 비장을 처리할 때는 50 mL 튜브에 맞게 선택해야 합니다.

세포 현탁액을 통과시킨 후, 버퍼 5 mL를 가하여 필터를 세척하십시오. 이제 세포 현탁액이 담긴 튜브를 상온에서 300 Gs로 10분간 원심분리하여 모든 세포를 비장 세포 펠렛으로 수집합니다. 분리된 세포 펠렛이 형성되었으므로, 상층액을 흡입하여 제거하고 세포 펠렛을 적절한 양의 비장 분리 버퍼에 다시 현탁해야 합니다.

GentleMax를 사용하면 높은 비율의 생존 가능한 PLE 세포를 얻을 수 있으며, 이는 MaxQuant를 이용한 유세포 분석으로 입증됩니다. 죽은 세포는 Propidium iodide로 염색되며 예시가 제공됩니다. 전방 및 측방 산란점 도표는 준비된 SP 세포를 보여줍니다.

Gentle X 해리를 사용하여 비장 조직을 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때는 샘플 크기에 맞게 버퍼 양을 조절하고 적절한 Gentle X 프로그램을 선택하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 마치겠습니다.

실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.