gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

이 비디오 프로토콜에서는 생존 가능한 세포 현탁액을 생성하기 위해 특수 튜브를 사용하여 조직을 기계적으로 파괴할 수 있는 자동화된 벤치탑 장치인 Gentle Max를 사용하여 마우스 비장을 해리하는 방법을 볼 수 있습니다. 다음 해리 비장은 Max Pres 분리 필터, 원심분리기로 여과하고 추가 적용을 위해 현탁합니다. 안녕하세요, 제 이름은 Melanie mlu입니다.

저는 독일 BE Lab Park에 있는 Milton Biotech의 과학자입니다. 오늘은 이 GenX 해리를 사용하여 쥐 비장에서 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여 드리겠습니다. GenX 해리를 통해 단일 세포 현탁액을 매우 쉽고 빠르게 준비할 수 있습니다.

시작하겠습니다. 지루하고 종종 고통스러운 수동 해리를 피하기 위해 gentle max di associator를 사용하면 제어되고 재현 가능한 조건에서 조직을 매우 효율적으로 해리할 수 있습니다. 조직은 보라색 C 튜브를 사용하여 생존 가능한 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 해리됩니다.

C 튜브는 캡 중앙으로 밀봉된 격막 개구부를 제공하여 항상 멸균 상태를 유지하면서 튜브에서 피펫을 사용할 수 있습니다. 해리된 셀을 일시 중단하려면 적절한 P-B-S-B-S-A-E-D-T-A 버퍼를 사용해야 합니다. 완충액은 EDTA를 함유한 AutoMax 펜싱 용액 20부에 BSA 원액 1부를 첨가하여 제조합니다.

Max Pres 분리 필터를 사용하여 해리 조직 샘플을 모든 세포 덩어리에서 분리하여 성공적인 max 분리 및 후속 분석을 촉진합니다. 절차를 시작하기 위해 C 튜브에 부피의 버퍼를 로드합니다. 비장의 질량에 따르면, 6-7주 된 암컷 생검 쥐의 건강한 비장의 무게는 약 80-120밀리그램이다.

이 덩어리의 비장 1-2개마다 3밀리리터의 완충액이 필요합니다. 총 부피가 10밀리리터를 초과하지 마십시오. 이제 해부된 비장을 3ml의 완충 비장이 들어 있는 C 튜브에 추가할 수 있습니다. 비장은 나이가 많은 동물이나 감염된 동물의 비장이 더 커서 완충 장치에서 무게를 측정해야 합니다.

그런 다음 버퍼 부피를 적절하게 조정해야 하지만 다시 총 부피가 10밀리리터를 초과할 수 없습니다. 이제 C 튜브 캡이 단단히 조여져 있는지 확인하고 C 튜브를 해리에 부착합니다 캡을 내린 상태에서 하나 또는 두 개의 비장에 대한 해리의 전원을 켜고 프로그램 M 비장 오 하나를 선택합니다. 비장의 수가 더 많으면 프로그램을 완료하는 데 56 초가 걸립니다 : M 비장 오 4.

이 프로그램은 최대 720mg의 비장 조직에 사용할 수 있습니다. 프로그램이 완료된 후, 천연 비장 조직은 PLE cyte 현탁액으로 해리되는데, 이는 튜브 바닥에서 샘플을 수집하기 위해 잠시 동안 이 원심분리기처럼 보입니다. 이렇게 하면 회전자와 고정자가 C 튜브의 바닥에 수집된 모든 세포가 제거되도록 할 수 있습니다.

1,000마이크로리터 피펫터를 사용하여 C 튜브 캡의 격막 밀봉 구멍을 통해 샘플을 제거합니다. 여과 단계를 시작하기 위해 해리된 조직을 pres 분리 필터 또는 30미크론 공극 크기의 스트레이너에 적용합니다. 스트레이너는 1-2개의 비장에 15ml 튜브를 장착하거나 2개 이상의 비장에 50ml 튜브를 장착해야 합니다.

세포 현탁액이 통과하도록 한 다음 5ml의 완충액을 적용하여 필터를 세척합니다. 이제 세포 현탁액이 있는 튜브를 실온에서 10분 동안 300Gs로 원심분리하여 비장 세포 펠릿의 모든 세포를 수집합니다. 이제 해리된 세포의 펠릿이 생겼으니, 슈퍼 나틴을 흡인하고 적절한 양의 완충 비장 해리로 세포 펠릿을 재현탁해야 합니다.

gentle max를 사용하면 생존 가능한 PLE cyte의 높은 비율을 얻을 수 있으며, 이는 max quant를 사용한 유세포 분석으로 입증됩니다. 죽은 세포는 Propidium iodide와 제공된 예에 의해 염색됩니다. 앞쪽 산점 플롯은 준비된 SP cyte를 보여줍니다. 그래.

이 부드러운 X 해리를 사용하여 비장 조직을 해리하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 버퍼 양을 샘플 크기에 맞게 조정하고 올바른 Gentle X 프로그램을 선택하는 것이 중요합니다. 좋아요, 그게 다입니다.

실험에 행운을 빕니다.