CAF를 이용한 폐암 세포의 3D 공동 배양: 종양 진행을 연구하기 위한 체외 모델 시스템

- 3D 공동 배양에서는 여러 세포 유형이 기저막 매트릭스와 같은 매트릭스에서 함께 성장하며, 이는 자연적인 세포 외 매트릭스 미세 환경을 모방하여 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 촉진합니다. 임베디드 3D 공동 배양을 확립하기 위해 기저막 매트릭스에서 암 관련 섬유아세포 또는 CAF와 폐암 세포를 두 개로 섭취한 폐암 세포의 균일한 현탁액을 준비합니다. 주변 온도에서 매트릭스 응고를 방지하기 위해 얼음 위에 현탁액을 유지하십시오.

적절한 부피의 현탁액을 세포 배양 플레이트로 옮깁니다. 세포를 매트릭스에 함께 삽입하기 위해 필요한 기간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 중첩된 3D 공동 배양을 설정하려면 기저막 매트릭스에서 원하는 세포 밀도로 폐암 세포의 현탁액을 준비합니다. 얼음 위에서 서스펜션을 유지하십시오. 이 세포 매트릭스 현탁액을 적절한 부피로 세포 배양 플레이트에 피펫팅합니다. 섭씨 37도에서 배양하여 내장된 암세포 단일배양을 설정합니다.

그 후, 바람직한 배양 배지에 현탁된 CAF의 원하는 부피를 내장된 암세포 위로 전달합니다. 3D 공동 배양에서 CAF는 암세포 스페로이드 형성을 강화하고 암세포를 끌어당겨 눈물방울과 같은 구조를 만듭니다. 이 프로토콜에서는 TUM622 폐암 세포와 CAF를 공동 배양하여 이들의 상호 작용을 연구할 것입니다.

- TUM622 및 CAF의 세포 현탁액을 준비한 후, 앞서 설명한 바와 같이 10 마이크로 리터의 세포 현탁액과 10 마이크로 리터의 트리판 블루를 혼합하여 CAF 세포 밀도를 계산합니다. 혈구계의 두 챔버 각각에 10마이크로리터의 혼합물을 추가하여 세포 밀도를 계산하고 계산합니다. TUM622 세포와 CAF를 기저막 매트릭스에 함께 삽입하려면 먼저 세포 밀도 정보를 기반으로 도금에 사용되는 원하는 세포 수를 계산합니다. CAF는 TUM622 세포의 2:1 비율로 파종됩니다. 계산된 TUM622 부피와 CAF 세포 현탁액을 동일한 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 스핀 다운하고 모든 매체를 흡인합니다. 기저막 매트릭스에 재현탁하고 혼합물 310마이크로리터를 24웰 플레이트의 각 웰에 플레이트화합니다. 면역형광을 위해 앞서 설명한 대로 60마이크로리터의 TUM622 및 CAF 혼합물을 챔버 슬라이드로 옮깁니다.

기저막 매트릭스에서 TUM622를 오버레이된 CAF와 공동 배양하려면 먼저 앞서 설명한 대로 TUM622 단일배양을 설정합니다. CAF 현탁액의 두 배를 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 300'g'의 속도로 스핀 다운합니다. 상층액을 흡인하고 1ml의 3D 배양 배지에 CAF를 재현탁합니다. 1밀리리터 CAF 현탁액을 내장된 TUM622 셀이 포함된 웰로 옮깁니다.