유세포 분석을 위한 마우스 폐 준비: 유세포 분석을 위한 폐 조직에서 세포 현탁액 생성

- 안락사된 쥐를 가져다가 실험실 테이프로 해부판에 고정하는 것으로 시작합니다. 가위를 사용하여 피부를 자릅니다. 횡격막을 통해 수직으로 절개하고 갈비뼈를 잘라 흉강에 도달하여 심장과 폐를 노출시킵니다. 다음으로 심장의 좌심실을 작게 절개합니다. 그런 다음 우심실을 찾아 PBS가 포함된 주사기를 심실 내강에 삽입합니다. 우심실을 통해 PBS를 관류하여 폐가 하얗게 변할 때까지 좌심실의 미리 만들어진 절개 부위에서 혈액이 흘러나오도록 합니다. 종양 결절이 있는 폐 조직을 꺼내 작은 조각으로 다집니다.

폐 소화 완충액에서 조각을 배양합니다. 폐 소화 완충액의 콜라겐분해효소는 세포를 분리하는 데 도움이 되며, DNAse는 죽은 세포에서 DNA를 제거하는 데 도움이 됩니다. 생성된 현탁액을 세포 스트레이너를 통해 변형시켜 덩어리를 제거하고 세포 현탁액을 균일하게 만듭니다. 펠릿을 원심분리하고 염화암모늄 칼륨 완충액에 재현탁시켜 잔류 적혈구를 용해시킵니다. 펠릿에서 WBC와 종양 세포를 수집하기 위한 원심분리기. 세포 안정성을 유지하기 위해 FCS가 보충된 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 다음 프로토콜에서는 유세포 분석을 위한 폐 세포 현탁액의 준비를 보여줍니다.

적절한 실험 종료 후 사체를 70% 에탄올에 담그고 동물을 해부 보드에 고정합니다. 복부 정중선을 절개하고 피부를 부드럽게 뒤집어 흉벽 근육과 복부 장기를 노출시킵니다. 가위를 사용하여 횡격막에 구멍을 뚫고 흉강을 노출시키는 갈비뼈를 자릅니다. 좌심실의 작은 구멍을 자르고 27게이지 바늘을 사용하여 우심실을 통해 폐를 3회 관류하고 주입당 6-8밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 주입합니다. 마지막 관류 후에는 폐에 피가 완전히 맑아지고 하얗게 보여야 합니다. 채취 후에는 가위를 사용하여 폐 조직을 작은 조각으로 다집니다.

폐 조각을 1.5ml의 폐 소화 완충액이 들어 있는 2ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 섭씨 37도에서 30-60분 동안 흔들면서 배양합니다. 분해가 끝나면 70미크론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50ml 튜브로 옮기고 멸균 10ml 주사기 플런저의 끝을 사용하여 필터를 통해 남아 있는 조직 조각을 누릅니다. 2% FCS가 보충된 PBS 15ml로 여과기를 헹구고 원심분리로 세포를 수집합니다. 펠릿을 1ml의 염화암모늄 칼륨 용해 완충액에 재현탁시켜 실온에서 5분 동안 배양하고 세포를 다시 원심분리합니다. 그런 다음 2% FCS가 보충된 PBS 1ml에 백혈구 펠릿을 재현탁하고 실험 프로토콜에 따라 유세포 분석을 위해 세포를 염색합니다.