Name: Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: 학습하세요 마우스 폐 조직에서 Hoechst 저발현 CD45 음성 폐 중간엽 줄기세포를 분리하고 특성화하는 방법을. 유세포 분석술과 콜로니 형성 분석을 통해 면역조절 특성을 평가합니다.

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AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105 - 01 :이 작품은 SMM에 부여하여 자금을했습니다. 추가 지원에 의해 제공되었다 : DW : NIH RO1DK075013, DDK 및 Kleberg 재단, UCCC 유동세포계측법 코어 (NIH 5 P30 CA 46934-15), UCCC Microarray 코어 (NCI P30 CA 46934-14).

1. 폐 격리 <ol><li> 멸균 기술을 사용 과다 다음 isoflurane의 과다와 생쥐 성인 쥐 (C57Bl6J,, 18-20그램 시대에 80~10주) 희생. 프로필 변종 사이에 약간 달라집니다. </li><li> 수술, 횡경막을 제거하려면 마우스의 양쪽 옆으로 ribcage를 절단하여 흉강을 엽니다. 인산의 3 5mls를 사용하여 부드럽게 오른쪽 심장 심실을 perfusing하여 폐에서 혈액을 플러쉬 식염수 (PBS)는 버퍼. </li><li> (HBSS) 염분 버퍼 행크스 가득 배양 접시에있는 기관 및 대형 기관지과 장소를 제거하는 폐 엽 (叶)을 해부하다. 모든 폐 엽 (叶)의 집게의 다음 컬렉션은 접시의 뚜껑에 조직을 배치하는 데 사용됩니다. 조직은 다음 그들은 부유하고 이동 있도록 많은 그들 촉촉한 아니지만 유지하는 충분한 액체와 일회용 scalpels를 사용하여 작은 조각으로 다진 있습니다. </li><li> 쥐를 중 하나 hindlimb을 해부하다와 플로 설정 얼룩 컨트롤로 사용할 수있는 골수를 분리w cytometry 게이츠. 골수 (BM)로 이전 한 설명을 얼룩. </li></ol> 2. 폐 조직에서 단일 세포 현탁액의 준비 <ol><li> , 무균 HBSS에 녹아있는 미리 예열 0.2 % 워딩턴 2 형 collagenase (CAT # LS004202 워싱턴의 Biochemicals, 레이크 우드, 뉴저지)의 5mls 각 폐는 0.2g의 부피 비율에 최적화된 조직 무게를 사용하여 소화됩니다. 혼합물은 30 분 2,3에 대해 37 ° C의 물을 욕조에 포장되어 있습니다. </li><li> 폐 조직 소화가 10ml 피펫 (약 10 반복)를 통해 쉽게 흐르는 때까지 샘플을 씹다. 37 추가 15 분 품어 ° C는 조직이보다 균일한 단일 세포 현탁액을 소화하고 보장 완료. </li><li> HBSS와 폐암 세포 현탁액을 희석하고 잔여 조직 조각을 해산하기 위해 5ml 피펫과 씹다. </li><li> 소화되지 않은 조직 파편을 제거하는 70μM 셀 스트레이너를 사용하여 현탁액을 필터링합니다. 샘플 multipl로 나눌 수 있습니다이 시점에서 전자 원뿔 튜브 하나의 셀 스트레이너를 오버로드 방지하고 시간을 감소합니다. </li><li> 펠렛 1,500 RPM과 가만히 따르다 뜨는 10 분 세포 현탁액. </li><li> 5 분 RT에서, 부화, Resuspend 세포 펠렛 부드럽게 방 온도 RBC 용해 버퍼를 (CAT # 00-4333-57 eBiosciences, 샌디에고, CA)를 사용하여. 용해 버퍼를 inactivate과 파편과 세포 집계를 제거하는 40μM 셀 스트레이너를 사용하여 세포 현탁액을 필터링하는 HBSS의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 각 샘플의 피펫 10μl는 스테인드하고 폐 및 hemocytometer를 사용하여 BM 샘플 모두에 대한 셀 번호를 계산합니다. 참고 : 세포의 전체 볼륨을 기록합니다. </li><li> 펠렛 10 분 1,500 rpm으로 원심 분리하여 폐 세포의 단일 세포 현탁액. </li><li> 포함하는 고양이 # 11965-092) 2퍼센트 태아 bovi, prewarmed에 1x10 6 셀 / ML (37 ° C) DMEM + (Dulbecco의 수정 이글 배지, 높은 혈당 (Gibco, Carlsbad, CA에서 폐 및 BM 세포 모두 ResuspendNE 혈청 (FBS)와 10mM HEPES. </li><li> Hoechst 33342 염색 (시그마 화학 회사, 세인트 루이스, MO, 고양이 # B2261)의 1mg/ml 재고 솔루션을 준비 물과 1,4을 소독 필터링합니다. Hoechst의 염료는 -80 ° C.에 aliquots으로 저장될 수 있습니다 </li><li> 단일 세포 현탁액에 5μg/ml의 최종 농도 (1mg/ml 주식의 200x 희석)에 Hoescht 33,342 염료를 추가합니다. </li><li> 37 정확히 90 분 ° C의 물을 욕조에 부드럽게 역전과 부화하여 세포를 섞는다. </li></ol> 3. 얼룩 및 유동세포계측법 분석을위한 폐 세포 현탁액의 준비 <ol><li> 90 분 후 Hoechst 스테인드 폐 세포의 모든 단계 ° C 또는 염료 유출을 방지하기 위해 얼음에 4 실행해야합니다. 4 10 분 1,500 rpm으로 원심 분리하여 펠렛은 세포 ° C와 얼음처럼 차가운 얼룩 버퍼 (PBS 2퍼센트 FBS)에 세포를 resuspend. </li><li> PBS 2 %를 포함하는 300 - 600μl를 사용하여 더 이상 7 1x10 이상의 세포 / 튜브의 농도에서 세포 ResuspendFBS 및 10mM HEPES를. </li><li> 폐 및 BM 샘플에 고양이 # 559864) 10-15 분 얼음 품어 동안 흠없는 컨트롤 포함,.. 적절하게 CD45 항체를 (일반적으로 CD45 - APC의 1:200 희석 (BD Pharmingen, 샌디에고, CA tittered 추가 실험 절차는 분석 성문을 설정하는 데 유용합니다. </li><li> 4 펠렛 세포 ° C 1500 rpm으로 5 분. 냉장 얼룩 버퍼 (PBS 2퍼센트 FBS) 500 μl에 뜨는 및 resuspend 세포를 가만히 따르다. (; 고양이 # 14-956 - 1D Fisherbrand, Schaumburg, IL) prechilled 스냅 캡 폴리 프로필렌 튜브로 전송. </li><li> 죽은 세포를 제외 2μg/ml의 최종 농도에 대한 샘플에 (PI, PBS에 200μg/ml 주식) propidium 요오드화물의를 추가합니다. PI는 흐름 cytometric 분석시 올바른 형광 프로필을 달성하기 위해 Hoechst 33342 염색와 함께 사용해야합니다. </li><li> 얼음에 저장 튜브는 유동세포계측법 분석까지 빛으로부터 보호. </li></ol> 4. 유동세포계측법 분석 정의 및 분리하는사이드 인구 (SP)를 감지하는 Hoechst 염료 유출을 사용하여 폐 Mesenchymal의 줄기 세포 (MSC 폐) 인구 <ol><li> 이 분석은 다음과 악기 요구 사항이 있습니다 : </li><ul><li> 488 NM 및 UV (350-355 nm의) 레이저 </li><li> 파란 (65분의 450)과 빨간색 (50분의 675) 필터와 UV 레이저 경로 2 경보기. </li><li> UV 붉은 감지기가 빨간 신호에 대한 높은 감도를 가지고 있어야합니다. 이것은 오래된 세포 sorters 문제있을 수 있습니다. </li><li> 50-10에서 샘플을 유지하기 위해 냉각기 장치 ° C. </li></ul><li> 레이저를 정렬하고 제조 업체의 프로토콜 다음과 같은 세포 분류에 설정합니다. </li><li> 빨간색 (X 축)과 파란색 (Y 축) 선형 스케일을 사용하여 Hoechst 신호를 수집합니다. </li><li> 후행 측면 인구의 적절한 표시할 수 있도록 줄거리 중심의 오른쪽 상단의 G0/G1 피크를 배치하는 photomultiplier 튜브 전압을 조정합니다. 세포주기의 S - 위상 및 전체 G2의 부분은 줄거리의 오른쪽 상단에있는 오프 스케일 수 있습니다. 파란색 시그마붉은 신호가 희미 동안 nal은 비교적 밝은 있습니다. 일반 MoFlo XDP (베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날, 마이애미, 플로리다) 전압은 파란색 425과 빨간색 6백50아르. </li><li> 죽은 세포는 PI를 사용하여 밖으로 문이 있습니다. 표준 PI 경로 (여기 488nm, 방출 630nm)을 사용할 수 있습니다. 또한, PI는 또한 UV 레이저에 의해 흥분하고 죽은 세포 인구 측면 인구의 오른쪽 (SP) 줄거리에 대한 규모를 놓여있다. 이것은 FITC와 PE 등 다른 fluorochromes에서 PI 신호를 보상하기 위해 필요 완화. 원래 Goodell 방법는 5-7 후자 절차를 따랐다. </li><li> 분석 기간 동안 상대적으로 낮은 압력 차등을 유지하고 측면 인구의 꽉 해상도를 보장하기 위해 정렬. </li><li> SP 떨어져 폐 세포의 주요 인구의 측면 팔로 나타납니다. 이 인구는 Hoechst 낮은 칭했다입니다. </li><li> Hoechst 낮은 / SP는 히스토그램 2,3 (F를 사용하여 CD45 긍정적이고 부정적인 인구를 분리하는 분석이다igure 1). </li><li> Hoechst 낮은 CD45 neg 폐 MSC 인구의 선택과 게이팅 다음 전지는 96 - 웰 플레이트 3에 클론을 분리 튜브 또는 하나의 세포로하거나 혼합 인구로 분류하여 수집될 수 있습니다. </li><li> 정렬 스트림 편향을 정렬 플레이트는 일반적으로 튜브 정렬에 사용되는보다 수직 정렬 스트림을 만드는 데 2​​5 % 조정에있다. </li><li> 왼쪽 상단에 테스트 스트림 펄스를 전송하고 다음 96 - 웰 플레이트 잘 오른쪽 아래로 정렬 스트림을 목표로하고 있습니다. </li><li> 각 우물에 세포의 원하는 번호를 입금 분류기 소프트웨어 플레이트지도를 설정합니다. </li><li> 단세포 클론을 분리하려면 단일 폐 MSC는 문화 매체의 150μl (α - 가상 20% FBS와 보충)에 96 - 웰 플레이트에 잘으로 정렬됩니다. 정렬 다음 미디어의 추가 100μl이 추가됩니다. </li></ol> 5. 폐 MSC와 클론의 분리, 문화 및 특성 <ol><li> Cultur정렬 아래의 E와 혼합 폐 MSC 인구 및 단일 세포 클론의 확장 표준 문화 조건을 사용하여 동일 (37 ° C 5 % CO 2와&gt; 95 % 습도). 세포는 16 시간 동안 다음과 같은 고립을 준수하기 위해 사용할 수 있습니다. 미디어는 (α - 가상 20% FBS와 보충) 매 48 시간 대체됩니다. 세포가 더 빨리 세포 분열 따위에 의해 번식하기 시작하고 그들이 passaged 아르 75-80%의 합류 (그림 2) 사이에 도달했을 때. </li><li> 세포 prewarmed HBSS로 씻어서 0.5 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Cellgro, 매나 사스, VA, 고양이 # 25-053 - CL)과 incubated 아르 37 ° 2 분 미만에 대한 C. 세포는 세포 현탁액의 모양을 확인하는 거꾸로 범위를 사용하여 모니터링할 수 있습니다. </li><li> 폐 MSC는 다음 문화의 현재 확산 속도에 따라 1시 2분 또는 1시 3분의 비율로 나누어집니다. </li><li> 전통적인 mesenchymal adipocyte와 chondrocyte osteoblast의 lineages 및 접수 mesenchymal 마커 그들의 세포 표면 표현으로 차별 폐 MSC의 기능 I의 각 세포 준비 평가. Cytogenetic banding 분석은 또한 총 염색체 이상 2,3,8-11의 부재를 확인하기 위해 수행됩니다. </li></ol> 6. 콜로니 형성 분석을 사용하여 폐 MSC의 열거 (CFU - F) <ol><li> 1x10 6 셀 / ML의 최종 농도를 완료 MesenCult 매체 (줄기 세포 기술, 밴쿠버, BC)에 세포를 희석. </li><li> 6x10 4 셀, 3x10 4 셀, 미디어 10ml에 1.5 X10 4 셀 및 0.75 X10 4 셀 100mm 접시에 최종 농도를 달성하기위한 일련 dilutions를 수행합니다. 분석은 각 세포 농도에 대한 중복 또는 세중의에 수행하고 작은 표면 영역에 대한 크기를 조정있을 수 있습니다. </li><li> 표준 조건 하에서 10 일간 문화 세포. 일 10 세포는 PBS로 씻어서 실온에서 5 분 100 % 메탄올을 사용하여 고정하고 있습니다. </li><li> 0.4 % W / V Giemsa 염색법의 솔루션 얼룩하여 CFU - F의 식민지를 감지(시그마 화학 주식, 세인트 루이스, 미주리)은 탈이온수와 1시 20분을 희석. 공기 건조에 샘플을 허용하고 식민지 회 이상 25 세포 (그림 3)이있는 콜로니의 수를 계량. </li></ol> 7. T - 세포 증식 및 Apoptosis에 폐 MSC의 Immunomodulatory 속성 분석 <ol><li> 물론 당 6.25x10 4 폐 MSC 세포는 96 - 웰 플레이트에 도금 및 야간 2 서 사용할 수 있습니다. </li><li> CD4 + ovalbumin 323-339 펩타이드를 인식 T 세포와 T 세포 수용체 (TCR) 유전자 변형 마우스, OT - II의 spleens의 세포는 +, CD19 +, MHC - II + 및 CD25 + 세포와 CD8을 파괴하여 정화 아르 Miltenyi AutoMACS 세포 분류기 (Miltenyi, 어번, CA). 항원 제시 세포 (APC)가 긍정적으로 MHC - II + 세포에게 12 정렬하여 절연하고 있습니다. </li><li> APC는 4 % paraformaldehyde에 고정 PBS / 5% BSA/2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 3 번 씻어 및 0.5μg/ml 또는 5μg / M와 함께로드됩니다리터 OVA323의 펩타이드. </li><li> APC를 체포 가상, 성장 96 - 웰 플레이트에있는 폐 MSC에 추가됩니다. </li><li> 이상 순도 95 프로지 CD4 + 1x10 5 세포 5μM Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE, 시그마, 세인트 루이스, 미주리 주)로 표시 아르 PBS와 어둠 속에 5 분 incubated, PBS - 5 % BSA로 씻은 다음에 추가 DMEM 5% FBS 미디어에 APC와 폐 MSC 세포. 전지는 다음 96시간에 대한 incubated 수 있습니다. </li><li> CD4 (APC - Cy7), CD8 (ViolBlue), T - 세포는 다음 안티 안티 CD40 (Cy5)에 묻은 게있다 Vbeta 5 (PE)와 Miltenyi MacsQuant 7 채널 흐름 cytometer (Miltenyi, Aurburn, CA)와를 사용하여 assayed FloJo 분석 소프트웨어 (Treestar, 애쉬 랜드, OR). 확산이 배경에 비해 CFSE의 의미 형광 강도의 감소로 측정, T 세포는 CFSE으로 표시하고 (그림 4) APC에 노출되지 않습니다. T - 세포는 trypan 파랑 제외로 평가된이 시간과 생존에 계산됩니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : 그림 1. 흐름 cytometric 분석과 폐에 MSC의 정의. 폐 조직 다이제스트의 단세포 정지는 Hoechst 33342 물들일하고의 차이를 감지 유동세포계측법에 의해 분석됩니다. 앞으로 흩어 (FSC)와 측면 산란 (SSC)와 B. Hoechst 파란색과 빨간색 형광. 사이드 인구 (SP)의 존재는 게이트 볼 수 있습니다. Hoechst 낮은 SP는 다음 C를 분리하는 분석이다. 폐 MSC의 CD45 부정적인 인구. 폐 SP의 부정적인 비율로 CD45 양성은 일반적으로 70:30 / 60:40입니다. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 폐에 MSC의 분리 및 문화. 셀 정렬하여 폐 MSC의 수집에 따라 세포는 α - 가상 supplem를 사용하여 30mm 요리를 도금 아르20% FBS와 ented.가. 갓 정렬 세포는 작은 원형 밝은 나타납니다. B는. mesenchymal 표현형로 ​​약 2-3 주 식민지가 분명지고 확산이 더 확실한되면. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 콜로니 형성 - Fibroblast 분석하여 MSC의 열거. 확대 폐 MSC는 A. 10 일 후에. CFU - F 분석에 대해 설명한 절차에 따라 도금 및 Giemsa 얼룩 식민지가 분명 있습니다. B. 식민지가 큰 및 구성 몇백 세포. C. 세포가 mesenchymal 표현형를 표시합니다. A &amp; B, 스케일 바 = 0.5 cm, C의 스케일 바 = 0.14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. CFSE 기반의 T 세포 증식 분석. 폐암의 MSC와 antige의 존재의 부재에N 발표 세포 (APC)는 + / - ovalbumin (OVA) CD40 양성 이펙터 T 세포는 (붉은 동그라미) 확산을 나타냅니다 CFSE 강도의 감소를 보여줍니다. T - 세포 막의 형광 강도 CFSE 모든 세포 분열의 예와 stoichiometrically 감소하게된다. 모든 부서를. 폐 MSC, APC의 면전에서 + / - OVA, CD40 양성 이펙터 T 세포는 (붉은 동그라미) 확산의 부족을 나타냅니다 CFSE 강도에 큰 변화를 입증하지 않습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 처음 주민 폐 MSC의 특정 인구를 분리 BM 조혈 세포를 식별하는 데 사용하는 방법을 적응했습니다. 고립의 재현성로 인해 이러한 세포도 잘 MSC로 특성화했다. 그들의 기원은 성인 마우스 폐에 거주합니다 (파생 BM 반대) 및 2 문서화 phenotypic와 분자 프로파일로 정의되었습니다. 반복이 특징 인구를 분리하는 능력은 조직의 항상성 및 질병 동안 생물 학적 중요성과 폐 MSC의 역할의 진학이 가능합니다. murine과 인간 모두 폐 조직의 생체내이 인구의 최근 정의는 부상과 질병 중 폐 복구를 촉진하는 내생 세포의 구조에 감독 치료 전략의 개발을 용이하게합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 인산염은 식염수 (PBS)를 버퍼 </td><td> 시그마 </td><td> P - 5368 </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 소금 솔루션을 버퍼 (HBSS) </td><td> 써모 과학 </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0.2 % 워싱턴 제 2 형 collagenase </td><td> 워싱턴의 Biochemicals </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> 붉은 혈액 세포 용해 완충액 </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Hoechst 33342 염색 </td><td> 시그마 </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45 - APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559,864 </td><td></td
></tr><tr><td> Propidium 요오드화물의 </td><td> 시그마 </td><td> 81,845 </td><td></td
></tr><tr><td> - 가상 </td><td> 써모 과학 </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0.5 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Cellgro </td><td> 25-053 - CL </td><td></td
></tr><tr><td> 완벽한 MesenCult 매체 </td><td> 세포 기술을 줄기 </td><td> 05,511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0.4 % W / V Giemsa 염색법의 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> 4 % paraformaldehyde </td><td> 전자 현미경 서비스 </td><td> 15,710 </td><td> 16 % paraformeldehyde는 PBS를 사용하여 4퍼센트로 희석합니다 </td
></tr><tr><td> Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르 (CFSE) </td><td> 시그마 </td><td> 21,888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

hoechst의 분리 및 특성 낮은 cd45 부정적인 마우스 폐 mesenchymal 줄기 세포

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

조직 주민 mesenchymal 줄기 세포 (MSC)는 조직 복구 또는 재생, 섬유증, 염증, angiogenesis 및 종양 형성의 중요한 규제하고 있습니다. 이러한 연구는 주민 폐 MSC 이러한 폐 섬유증 (PF) 및 동맥 고혈압 (PAH)와 같은 질병 중 폐 조직 항상성, 부상 및 수리하는 동안 역할을하는 것이 좋습니다 함께 찍은. 여기 주민 폐 MSC의 인구를 정​​의하는 기술을 설명합니다. 이 마커 세트 정의를 사용하여 생체내 폐 조직이 인구의 정의는 유동세포계측법 및 특정 세포 종류와 기능의 연구에 의해 잘 특징 줄기 세포 인구의 반복 고립을 용이하게합니다.

이 문서에서 우리는 murine 주민 폐 mesenchymal 줄기 세포 (MSC 폐), 그들의 확장, 특성화 및 immunomodulatory 속성의 분석의 절연을 보여줍니다.

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

조직 상주 중간엽줄기세포(MSC)는 조직 수복 또는 재생, 섬유화, 염증, 혈관 신생 및 종양의 중요한 조절자입니다...

본 영상에서는 호스트의 CD 45 음성 폐 중간엽 줄기세포를 분리하는 프로토콜을 시연합니다. 조직 상주 중간엽 줄기세포(MSC)는 조직 수복 또는 재생, 섬유화, 염증 및 혈관 형성의 중요한 조절 인자입니다. 먼저, 희생시킨 마우스에서 폐를 적출합니다.단일 세포 현탁액을 얻기 위해 폐 조직을 소화시킵니다. 세포를 hoax die와 CD 45로 염색한 후, 유세포 분석법으로 분류하여 호스트 유래 CD 45 음성 폐 MSC를 얻습니다. 이후 폐 MSC를 배양하여 증식시키고, MSC의 분화 능력을 평가하기 위해 콜로니 형성 분석을 수행합니다.그 후, 조직 항상성 및 질환 과정에서 MSC의 역할을 조사하기 위한 추가 연구를 수행할 수 있습니다. 본 과정에서 제시한 방법은 마우스 또는 인간의 폐 중간엽 줄기세포를 분리하는 데 사용될 수 있으며, 폐섬유화증, 폐고혈압 및 COPD와 같은 폐 질환 연구에 적용 가능합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 조직 준비 방법의 다양성뿐만 아니라, 유세포 분석기의 적절한 대조군 설정 및 분석 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다.세포의 최적 생존력을 위해 폐 조직을 다지고 소화하는 적절한 기술을 글로만 설명하기는 어렵기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 또한, 유세포 분석기의 설정 및 분석 과정 역시 시연을 통해 가장 잘 전달될 수 있습니다. 희생된 성체 마우스에서 중간엽 줄기세포를 얻기 위해 폐를 적출하는 것으로 이 프로토콜을 시작하십시오.작고 날카로운 가위로 마우스의 늑골 양측을 측면으로 절개합니다. 흉강을 연 다음 횡격막을 제거합니다. 20.5 gauge 바늘이 장착된 10 milliliter 주사기를 우심실에 삽입하고 플런저를 천천히 눌러 3~5 milliliters의 PBS로 관류하여 폐에서 혈액을 씻어냅니다.다음으로 가위를 사용하여 기관과 대기관지를 잘라내어 폐기합니다. 그 다음 핀셋을 사용하여 작은 흰색 폐엽을 집어 HBSS(hank's buffered saline)가 채워진 페트리 접시에 넣습니다.그런 다음 심장을 제거하고 폐엽을 분리합니다. 연구에 포함된 모든 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다. 분리한 폐엽을 디쉬 뚜껑으로 옮깁니다.조직이 마르지 않도록 적당량의 HBSS를 사용하여 적셔줍니다. 그다음 일회용 메스를 사용하여 폐엽을 잘게 다져 유세포 분석의 유지 대조군으로 사용할 골수를 얻습니다. 날카로운 가위를 사용하여 발목과 대퇴골 상단을 절단합니다.사지를 새 페트리 접시에 넣습니다. 그 후 무릎 부위를 절단하여 대퇴골의 직선 부분과 경골 및 비골이 포함된 두 번째 조각으로 나눕니다. 핀셋을 사용하여 근육을 제거해 경골, 비골 및 대퇴골이 드러나게 합니다.이제 26.5 gauge 바늘이 장착된 5 mL 시린지를 사용하여 바늘을 골수 개구부에 삽입하십시오. 경골(tibia)의 한쪽 끝을 잡고 다른 쪽 끝이 15 mL HBSS가 채워진 50 mL 원심 분리 튜브(conical tube)를 향하게 한 다음, 플런저를 눌러 HBSS를 주입함으로써 골수를 튜브 안으로 씻어내십시오. 비골(fibula)과 대퇴골(femur)에 대해서도 이 과정을 반복하십시오.보충된 고농도 포도당 DMEM에서 5 µg/mL의 최종 농도로 host 3 3 3 4 2 염색약을 사용하여 골수를 염색합니다. 다음으로, 분리된 조직으로부터 폐 조직의 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 각 폐를 예열된 0.2% Worthington이 포함된 튜브에 넣습니다.멸균된 HBSS로 제2형 콜라게나제(Type two collagenase)를 준비한 후, 튜브를 37 °C 항온수조에 담가 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 10 mL 피펫을 사용하여 소화물이 피펫을 통해 쉽게 흐를 때까지 샘플을 트리투레이션(trituration)합니다. 약 10회 반복한 뒤, 조직 소화를 완료하기 위해 37 °C에서 15분 동안 추가로 배양합니다.소화가 완료되면, HBSS로 세포 현탁액을 희석하고 5 mL 피펫을 사용하여 남아 있는 조직 파편을 다시 분산시킵니다. 다음으로, 소화되지 않은 조직 파편을 제거하기 위해 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원추형 튜브에 붓습니다. 샘플이 세포 스트레이너를 통해 원활하게 흐를 수 있도록 현탁액을 조금씩 추가합니다.소화되지 않은 조직 파편이 세포 현탁액의 흐름을 완전히 차단하는 경우, 새로운 세포 스트레이너를 통해 새 튜브에 부어줍니다. 세포 현탁액을 450 RCF에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 형성합니다.원심분리 후 상층액을 따라내고, 실온의 적혈구 용해 버퍼(Red blood cell lysis buffer)로 세포 펠렛을 부드럽게 재현탁하여 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그 다음, 동일한 부피의 HBSS를 첨가하여 용해 버퍼를 불활성화합니다.세포 현탁액을 40 µm 세포 스트레이너(cell strainer)에 부어 잔해물과 세포 응집체를 제거하고, 통과한 액체를 새로운 50 mL 원추형 튜브(conical tube)에 수집합니다. 다음으로, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 폐와 골수 샘플 모두의 세포 수를 측정합니다. 세포 현탁액의 농도와 총 부피를 기록합니다.그 다음, 단일 폐 세포 현탁액을 450 RCF에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 세포를 유지하기 위해 폐 세포와 골수 세포를 동시에 10⁶ cells/mL의 농도로 미리 데워둔 보충제 함유 고농도 포도당 DMEM에 재현탁합니다.DNA를 염색하기 위해 HOAXED 3 3 3 4 2 염료를 최종 농도가 5 µg/L가 되도록 첨가합니다. 다음으로, 세포를 부드럽게 전도 혼합하고 37 °C 항온수조에서 정확히 90분 동안 배양합니다. 그 후 4 °C에서 450 ×g로 10분 동안 원심 분리합니다.유세포 분석을 위한 준비 단계로, 폐 및 골수 조직을 anti CD 45와 propidium iodide로 염색합니다. 세포 염색이 완료되면 유세포 분석을 수행할 때까지 튜브를 빛이 차단된 상태로 얼음 위에 보관하십시오. 기기의 레이저 정렬 상태를 확인하고 세포 분리(cell sorting) 설정이 완료되었는지 확인하여 유세포 분석을 준비합니다.사용되는 기기는 488 nm 청색, 635 nm 적색 및 350~355 nm UV 레이저를 갖추어야 하며, UV 레이저 경로에는 청색 45/65 필터와 적색 675/50 필터가 장착된 두 개의 검출기가 있어야 합니다. 또한, UV 적색 검출기는 적색 신호에 대해 높은 민감도를 가져야 하며, 기기에는 샘플을 10 °C로 유지하기 위한 칠러 유닛이 장착되어 있어야 합니다. 기기 소프트웨어 설정에서 선형 전방 산란(forward scatter) 대 측방 산란(side scatter)을 표시하는 히스토그램 플롯과 해당 기기에 적합한 더블릿 식별(doublet discrimination) 플롯을 설정하십시오.로그 신호를 사용한 PI의 히스토그램 플롯, 선형 신호를 사용한 적색 대 청색 코스트, 그리고 로그 신호를 사용한 CD 45 A PC의 히스토그램 플롯입니다. 장비가 준비되면, 염색된 골수 샘플을 장비의 로딩 포트에 넣으십시오. 이 샘플은 염색 및 장비 설정 제어용으로 사용됩니다.이벤트를 수집하기 시작하고 전방 산란(forward scatter) 및 내부 산란(inside scatter) 선형 신호를 조정하십시오. 세포군을 명확하게 시각화하려면, x축이 전방 산란인 플롯의 하단 중앙 부근에 세포가 위치해야 합니다. 핵 염색 시약인 PI는 세포막 투과성이 없으므로, 살아있는 세포에서는 배제될 것입니다.PI 히스토그램에서 PI 양성 사멸 세포에 게이트 영역을 지정하십시오. 기기 소프트웨어에서 이 게이트 내의 사멸 세포를 빨간색으로 표시하도록 설정하십시오.색상으로 표시된 사멸 세포를 가이드로 사용하여 숙주 G0 G1 집단을 식별하는 것이 유용합니다. PI 염색 역시 UV 레이저에 의해 여기되므로, 대부분의 사멸 세포는 측정 범위를 벗어나 나타나야 합니다. 적색 대 청색 가상 형광 플롯의 우측에서, 골수의 G0 G1 집단이 적색 대 청색 가상 플롯 상의 조밀한 이벤트 군집으로 관찰되어야 합니다.검출기 전압을 조정하여 G zero G one 클러스터가 플롯의 중앙 상단 우측에 위치하도록 합니다. 세포 주기의 S-phase 일부와 G two 전체가 스케일을 벗어날 수 있습니다. 적색 대 청색 hoaxed 플롯의 상단 우측에서, side population hosts low가 G zero G one 클러스터의 왼쪽 면에서 시작하여 플롯의 왼쪽 하단 모서리까지 이어지는 모습이 관찰될 것입니다.이제 FSC 대 SSC 산점도에서 세포 군집 주위에 게이트를 설정하십시오. 더블렛 플롯에서 확인된 싱글렛 집단과 PI 히스토그램의 생존 세포를 플롯하십시오. 그런 다음, 이 게이트된 집단들만 표시되도록 hoax 플롯을 지정하십시오.호스트 플롯의 게이팅을 마친 후, 사이드 팝퓰레이션(side population) 주변에 영역을 지정합니다. 이 영역을 라이트 스캐터 싱글렛(light scatter singlet) 및 생존 세포 게이트와 함께 CD 45 A PC 히스토그램의 게이트로 설정합니다. 시스템 설정이 완료되면, 로딩 포트에서 샘플을 제거하고 폐 샘플을 로딩 포트에 넣습니다.이 샘플에 대해서는 기기 설정을 다시 조정할 필요가 없습니다. red versus blue hoax 플롯에서 이벤트 수집을 시작하십시오. 폐 샘플의 G zero G one 클러스터는 일반적으로 x축 방향으로 더 길게 나타나며 키보드의 물결표(~) 기호와 유사한 형태를 띱니다.사이드 팝플레이션(side population) 게이트 하단은 골수 샘플에 설정한 것과 유사한 위치에 있어야 합니다. 사이드 팝플레이션의 정밀한 분해능을 확보하기 위해 상하로 약간의 조정이 필요할 수 있습니다. 샘플 흐름 밸브가 너무 많이 열리지 않도록 하여 소팅 중 낮은 압력 차를 유지하십시오.MSC를 분리하기 위해 96-well 수집 플레이트를 소팅 챔버에 배치하고, CD 45 A PC 히스토그램에서 소팅 게이트를 설정하여 양성 및 음성 집단을 분리합니다. 마지막으로, 세포를 튜브에 혼합 집단으로 수집하거나 96-well 플레이트에 단일 세포로 수집하여 클론을 분리합니다. 세포 소팅을 통해 폐 MSC를 수집한 후, 20% FBS가 첨가된 α-MEM을 사용하여 30mm 디시에 세포를 플레이팅합니다. 우선, 소팅된 세포는 약 2~3주 후에 작고 둥글며 밝게 나타납니다.중간엽 표현형을 가진 콜로니가 나타나며, 각 세포 준비물에서 증식이 더욱 뚜렷해집니다. 폐 MSC가 전통적인 중간엽 계통인 조골세포, 지방세포 및 연골세포로 분화하는 능력과 공인된 중간엽 마커의 세포 표면 발현을 평가하십시오. 거시적인 염색체 이상이 없는지 확인하기 위해 세포유전학적 밴딩 분석을 수행하십시오.유세포 분석을 통한 분리와 단일 세포 클론 생성을 마친 후, MSC 세포의 특성과 분화 능력을 분석하기 위해 콜로니 형성 분석(colony forming assay)을 수행합니다. 밀리리터당 3×10⁴개의 세포로 희석된 상태에서 시작하십시오. 100 mm 디쉬 내의 불완전 배양 배지에서, 디쉬당 10 mL의 배지를 사용하여 2.6×10⁴, 3×10⁴, 1.5×10⁴, 0.75×10⁴개의 세포 농도로 단계별 희석을 3반복으로 수행합니다.그 다음 10일간 배양한 후 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 배지를 따라내고 PBS로 세포를 세척합니다. 이어서 상온에서 100%methanol을 5분간 첨가하여 세포를 고정합니다. 5분 후, methanol을 따라냅니다.그 다음 콜로니 형성을 검출하기 위해, 이온수로 1:20으로 희석한 0.4% weight by volume gza를 첨가하고 10~15분 동안 배양합니다. 이후 염색약을 따라내고 이온수로 헹굽니다. 시료를 공기 중에서 건조시킨 후, 도립 현미경 또는 시각화 장치를 사용하여 콜로니당 세포 수가 25개 이상인 콜로니의 수를 정량화합니다.여기에 나타난 바와 같이 콜로니는 수백 개의 세포로 구성된 크기가 큰 형태이며 중간엽 표현형을 보입니다. 이 비디오에 제시된 것처럼 MSC를 분리하여 96-웰 플레이트에 도말해 성장을 유도했습니다. 그 후, CFSE로 표지되어 정지된 항원제시세포를 폐 MSC에 추가했습니다.그 후 분리된 MSC의 증식은 배경값(이 그림에 표시된 것과 같이 CFSE로 표지된 T 세포 단독) 대비 CFSE의 평균 형광 강도 감소로 측정하였습니다. 폐 SC가 없고 항원 제시 세포가 있는 상태에서, APC와 OVA 알부민 및 CD40 양성 이펙터 T 세포가 함께 있을 때 CFSE 강도가 감소하며, 이는 빨간색 원으로 표시된 증식을 나타냅니다. T 세포 막의 CFSE 형광 강도는 세포 분열이 일어날 때마다 기하급수적으로 감소하며, 즉 분열 시마다 절반으로 줄어듭니다. 폐 MSC, APC 및 OVA CD40 양성 이펙터 T 세포가 함께 있는 경우에는 CFSE 강도에 유의미한 변화가 나타나지 않았으며, 이는 증식이 일어나지 않았음을 의미합니다. 이러한 기술은 폐 줄기세포 생물학 분야의 연구자들이 폐동맥 고혈압 및 폐섬유증과 같은 폐 질환에서 중간엽 줄기세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 기술을 숙달하면 본 절차에 따라 약 5시간 이내에 완료할 수 있습니다. 추정되는 폐 간엽줄기세포가 뼈, 지방 및 연골로의 적절한 다분화 능력을 나타내는지 여부를 포함하여 추가적인 질문에 답하기 위해 분화 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

isolation-characterization-hoechstlow-cd45negative-mouse-lung

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

쥐 MSCS는 대퇴골과 tibias으로부터 격리하고 자기 세포 분류에 의해 풍부하게되었다. 정렬 세포 유동세포계측법에 의해 표면 마커의 표현에 대해 확인했다. 이러한 세포는 하나의 식민지를 형성 clonal 밀도에 교양 있었다 그리고 이들 식민지는 복제 실린더로 구분했다.

분리 및 랫 Mesenchymal 줄기 세포의 농축 (MSCS)와 MSCS를 유래 단일 식민지의 분리

여기 우리는 전체 murine 간, 조직 소화, 세포 강화, 그리고 유동세포계측법 절연을 요구하는 과정에서 CD133 표현 간 줄기 세포와 암 줄기 세포의 절연을 설명합니다. 우리는 고급 단일 세포 분리 및 clonal 확장 메서드를 포함합니다.

Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

이 프로토콜은 소화 효소, 밀도 구배 분리, 수지 밀착성 및 CD146 + 자성 비드의 선택을 이용하여, 래트에서 일차 폐 상주 간엽 기질 세포를 얻기위한 분리 기술을 설명한다.

CD146의 분리<sup&gt; +</sup쥐 폐에서&gt; 주민 폐 중간 엽 기질 세포

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

우리는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)의 분리를 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

장기 및 단기 조혈모세포의 분리 방법

이질적인 인간 UC-MSC를 구성하는 세 가지 주요 하위 그룹 중 하나인 BAMBI높은MFGE8높은 MSC의 분리는 특정 질병에 대한 임상 효능을 개선하기 위한 향후 적용을 위해 이 하위 유형의 특성과 기능을 완전히 이해하는 데 도움이 됩니다. 여기에서는 BAMBIhighMFGE8high UC-MSC를 분류하는 방법을 제시합니다.

Human BAMBIhighMFGE8high Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells의 분리

이 프로토콜은 인플루엔자 감염 후 안정적인 상태에서 마우스 폐에서 살아있는 면역 및 비면역 집단을 격리하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 상피 및 골수성 세포 부분 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략을 제공합니다.

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

학습하세요 마우스 폐 조직에서 Hoechst 저발현 CD45 음성 폐 중간엽 줄기세포를 분리하고 특성화하는 방법을. 유세포 분석술과 콜로니 형성 분석을 통해 면역조절 특성을 평가합니다.

Hoechst의 분리 및 특성^낮은 CD45^부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

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