Hoechst의 분리 및 특성 ^낮은 CD45 ^부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

이 비디오는 숙주, 낮은 CD 45, 음성 폐 중간엽 줄기 세포의 분리를 위한 프로토콜을 보여줍니다. 조직 공명 중간엽 줄기 세포 또는 MSC는 조직 복구 또는 재생, 섬유증, 염증 및 혈관 신생의 중요한 조절자입니다. 먼저, 희생된 쥐의 폐를 해부합니다.

폐 조직은 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 소화됩니다. 세포를 hoax die 및 CD 45로 염색하고 유세포 분석으로 분류하여 숙주가 낮은 CD 45 음성 폐 MSC를 얻습니다. 그런 다음 폐 MSC를 배양에서 확장하고 집락 형성 분석을 수행하여 MSC 분화 능력을 평가합니다.

그런 다음 조직 항상성 및 질병 동안 MSC의 역할을 조사하기 위해 추가 연구를 수행할 수 있습니다. 여기에서 보여주는 방법은 마우스 또는 인간 폐 중간엽 줄기 세포를 분리하는 데 사용할 수 있으며 폐 섬유증, 폐 고혈압 및 COPD와 같은 폐 질환에 대한 이 연구에 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 조직 준비에 사용할 수 있는 다양한 방법과 유세포 분석기 설정, 적절한 제어 및 분석으로 인해 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 단어만으로 세포의 최적 생존력을 위해 폐 조직을 다지고 소화하는 적절한 기술을 설명하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 또한 유세포 분석 기기 설정 및 분석은 시연을 통해 가장 잘 전달됩니다. 희생된 성체 쥐에서 중간엽 줄기세포를 얻는 데 사용할 폐를 제거하는 것으로 이 프로토콜을 시작합니다.

작고 날카로운 가위를 사용하여 마우스의 양쪽에 있는 흉곽을 옆으로 자릅니다. 흉강을 열고 횡격막을 제거합니다. 20 및 1/2 게이지 바늘이 달린 10ml 주사기를 오른쪽 심실에 삽입하고 플런저를 부드럽게 눌러 3-5ml의 PBS를 관류하여 폐에서 혈액을 씻어냅니다.

그런 다음 가위를 사용하여 기관과 큰 기관지를 잘라 버립니다. 그런 다음 집게를 사용합니다. 작고 하얀 폐엽을 집어 행크의 완충 식염수 또는 HBSS로 채워진 페트리 접시에 넣습니다.

그런 다음 심장을 제거하고 폐엽을 분리합니다. 연구에 있는 모든 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다. 폐엽을 접시 뚜껑으로 옮깁니다.

조직이 건조해지지 않도록 충분한 HBSS로 조직을 적십니다. 그런 다음 일회용 메스를 사용하여 폐엽을 다져 골수를 얻고 유세포 분석을 위한 지속 제어를 사용합니다. 날카로운 가위를 사용하여 발목과 대퇴골 상단을 자릅니다.

팔다리를 새 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 무릎을 잘라내고 대퇴골의 선형 조각과 경골과 비골을 포함하는 두 번째 조각을 남깁니다. 겸자를 사용하여 근육을 당겨 경골, 비골, 대퇴골을 드러냅니다.

이제 5밀리리터 주사기에 26 게이지 반 게이지의 바늘을 가지고 골수 구멍에 바늘을 삽입합니다. 경골의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝이 15ml HBSS로 채워진 50ml 원뿔형 튜브를 향하도록 뼈를 잡고 플런저를 눌러 HBSS를 분배하고 골수를 튜브로 플러시합니다. 비골과 대퇴골에 대해 이 과정을 반복합니다.

숙주 3 3 3 4 2 다이가 보충된 고포도당 DMEM에서 밀리리터당 5마이크로그램의 최종 농도로 골수를 염색합니다. 다음으로, 분리된 조직으로부터 폐 조직의 단세포 현탁액이 생성될 것입니다. 각 폐를 prewarm.0.2%Worthington이 들어 있는 튜브에 넣습니다.

2형 콜라겐분해효소 멸균 HBSS에서 준비한 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 담그고 30분 동안 배양합니다. 배양 후 10ml 피펫을 사용하여 분해물이 피펫을 통해 쉽게 흐를 때까지 샘플을 삼중 처리합니다. 약 10회 반복하면 추가로 15분, 섭씨 37도 동안 배양하여 조직 소화를 완료합니다.

분해가 완료되면 HBSS로 세포 현탁액을 희석하고 5ml 피펫을 사용하여 잔류 조직 단편을 분산시키기 위해 다시 트라이얼합니다. 다음으로, 소화되지 않은 조직 조각을 제거하려면 70마이크로몰 세포 여과기를 통해 현탁액을 50ml 원뿔형 튜브에 붓습니다. 샘플이 세포 스트레이너를 통해 흐를 수 있도록 한 번에 조금씩 현탁액을 추가합니다.

소화되지 않은 조직 조각이 세포 현탁액의 흐름을 완전히 차단하면 됩니다. 새 세포 스트레이너를 통해 새 튜브에 붓습니다. 450 RCF에서 10분 동안 세포 현탁액을 펠렛

스핀 디캔트 후 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 실온에서 부드럽게 재현탁합니다. 적혈구 용해 완충액, 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 동일한 부피의 HBSS를 추가하여 용해 완충액을 비활성화합니다.

세포 현탁액을 40마이크로몰 세포 여과기에 부어 파편과 세포 응집체를 제거하고 새로운 50ml 원추형 튜브에 흐름을 수집합니다. 다음으로, 혈구 분석기를 사용하여 폐 및 골수 샘플의 세포 수를 결정합니다. 세포 현탁액의 농도와 총 부피를 기록합니다.

그런 다음 450 RCF에서 10분 동안 원심분리하여 단일 폐 세포 현탁액을 펠렛화합니다. 세포를 유지하기 위해 폐 세포와 골수 세포를 한 번에 다시 부유시킵니다. 10 밀리리터 당 6 개의 세포는 prewarmed 높은 포도당 DMEM을 보충했다.

DNA를 염색하기 위해 HOAXED 3 3 3 4 2 염료를 리터당 5마이크로그램의 최종 농도로 첨가하십시오. 다음으로, 부드러운 반전으로 세포를 혼합하고 섭씨 37도의 수조에서 정확히 90분 동안 배양합니다. 그런 다음 스핀 후 섭씨 450도에서 10분 동안 원심분리합니다.

유세포 분석에 의한 분석을 준비하기 위해 anti CD 45 및 propidium iodide로 폐 및 골수 조직의 염색을 진행합니다. 세포가 염색되면 유세포 분석이 수행될 때까지 빛으로부터 보호된 얼음 위에 튜브를 보관합니다. 기기 레이저가 정렬되어 있고 세포 분류를 위해 설정되어 있는지 확인하여 유세포 분석을 준비합니다.

사용되는 기기에는 청색 488 나노미터, 적색 635 나노미터 및 UV 350 - 355 나노미터 레이저가 장착되어 있어야 하며, 파란색 45 이상 65 및 빨간색 6 75 이상 50 필터가 있는 UV 레이저 경로에 두 개의 검출기가 있어야 합니다. 또한 UV 적색 검출기는 적색 신호에 대한 감도가 높아야 하며 시료를 섭씨 10도로 유지하기 위해 기기에 냉각 장치가 장착되어 있어야 합니다. 기기 소프트웨어에서 히스토그램 플롯을 설정하여 선형 전방 대 측면 산란을 표시하고, 기기에 적합한 이중 변별 플롯을 표시합니다.

로그 신호를 사용한 PI의 히스토그램 플롯, 선형 신호를 사용한 적색 대 청색 해안 및 로그 신호를 사용한 CD 45 A PC의 히스토그램 플롯. 기기가 준비되면 염색된 골수 샘플을 기기의 로딩 포트에 넣습니다. 이 샘플은 염색 및 기기 설정 제어로 사용됩니다.

이벤트 수집을 시작하고 산란 선형 신호 내부의 순방향을 조정합니다. 세포 집단을 명확하게 시각화하려면 세포가 x축으로 플롯 전방 산란의 아래쪽 중앙에 대략적으로 위치해야 합니다. 핵 염색 PI는 막 IMP 투과성이므로 살아있는 세포에서 제외됩니다.

PI 히스토그램에서 PI 양성 데드 셀에 보행 영역을 그립니다. 기기 소프트웨어에 죽은 세포에 색을 칠하도록 지시합니다. 이 게이트에서는 빨간색입니다.

color vented dead cells를 숙주 G zero G one 집단을 식별하기 위한 탐색기로 사용하는 것이 도움이 됩니다. PI 염색은 또한 UV 레이저에 의해 여기되며 대부분의 죽은 세포는 스케일을 벗어나야 합니다. 빨간색 대 파란색 가짜 형광 플롯의 오른쪽에서 골수의 G zero G 1 집단은 빨간색 대 파란색 가짜 플롯에서 이벤트의 밀집된 클러스터로 보아야 합니다.

검출기 전압을 조정하여 G zero G one 클러스터를 플롯 중앙의 오른쪽 위에 배치합니다. S-기의 일부와 세포 주기의 전체 G 2는 스케일을 벗어날 수 있습니다. 빨간색 대 파란색 사기 플롯의 오른쪽 상단에서 측면 인구 호스트 low가 G zero G one 클러스터의 왼쪽에서 플롯의 왼쪽 하단 모서리까지 이어지는 것을 볼 수 있습니다.

이제 FSC와 SSC의 세포 클러스터 주위에 게이트를 그립니다. doublet 플롯에서 식별된 singlet 집단과 살아있는 세포를 PI 히스토그램에 플로팅합니다. 그런 다음 이러한 게이트된 모집단만 표시하도록 사기 플롯을 할당합니다.

호스트 플롯을 게이트한 후 측면 개체군 주위에 영역을 그립니다. 이 영역을 CD 45 A PC 히스토그램에 광 산란 단일 항 및 라이브 셀 게이트와 함께 게이트로 할당합니다. 이제 시스템이 설정되었으므로 로딩 포트에서 샘플을 제거하고 폐 샘플을 로딩 포트에 놓습니다.

이 샘플에 대해 기기 설정을 다시 조정할 필요가 없습니다. 빨간색 대 파란색 사기 플롯에서 이벤트를 수집하기 시작합니다. 폐 샘플에 대한 G zero, G one 클러스터는 일반적으로 x축 방향으로 더 길쭉하게 나타나며 키보드의 틸다 기호와 유사합니다.

side population gait hoax low는 골수 샘플에 대해 설정된 위치와 유사한 위치에 있어야 합니다. 이러한 약간의 상향 또는 하향 조정은 사이드 모집단의 엄격한 해결을 보장하기 위해 필요할 수 있습니다. 샘플 흐름 밸브가 너무 많이 열리지 않도록 하여 분류하는 동안 낮은 차압을 유지하십시오.

다음으로 MSC를 분리하기 위해 분류 챔버에 96웰 수집 플레이트를 배치하고 CD 45 A PC 히스토그램에 분류 게이트를 설정하여 양성 및 음성 모집단을 분리합니다. 마지막으로, 세포를 튜브 또는 단일 세포에 혼합된 집단으로 수집하여 클론을 96웰 플레이트로 분리한 후 세포를 분류하여 세포를 20% FBS가 보충된 MEM을 사용하여 30mm 접시에 도금합니다. 첫째, 분류된 세포는 약 2-3주 후에 작고 둥글고 밝게 나타납니다.

중간엽 표현형을 가진 군집이 분명해지고 각 세포 준비에 대해 증식이 더 분명해집니다. 폐 MSC가 조골세포, 지방세포 및 연골세포의 전통적인 중간엽 계통으로 분화하는 능력과 허용된 중간엽 마커의 세포 표면 발현을 평가합니다. 세포유전학적 금지 분석을 수행하여 총 염색체 이상이 없는지 확인합니다.

유세포 분석에 의한 분리 및 단일 세포 클론 생성 후, MSC 세포와 분화 능력을 특성화하기 위해 콜로니 형성 분석이 수행됩니다. 밀리리터당 4개의 세포 중 10배로 희석된 세포로 시작합니다. 100 밀리미터 접시에 불완전한 cul 매체, 곡물 희석 2, 6 곱하기 10 4 개, 3 배 10 개 중 10 개, 1.5 곱하기 10 4 개 및 0.75 곱하기 10 접시 당 4 개의 세포를 10 밀리리터 3 회 수행합니다.

그런 다음 배양 10일 후 플레이트를 인큐베이터에 넣고 배지를 붓고 PBS로 세포를 헹굽니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 100% 메탄올을 첨가하여 고정합니다. 5분 후 메탄올을 붓습니다.

그런 다음 식민지 형성을 감지하려면 10-15 분 동안 이온수 인큐베이트로 1-20을 희석 한 부피 gza로 0.4 % 중량을 추가하십시오. 그런 다음 얼룩을 붓고 이온수로 헹굽니다. 샘플을 자연 건조시키고 도립 현미경 또는 시각화를 사용하여 콜로니당 25개 이상의 세포를 포함하는 콜로니의 수를 정량화합니다.

군체는 크고 여기에 표시된 것처럼 수백 개의 세포로 구성되어 있으며 중간엽 표현형을 나타냅니다. MSC는 이 비디오와 같이 분리되고 성장을 시뮬레이션한 96개의 웰 플레이트에 도금되었습니다. 그런 다음 정지된 CFSE 표지 항원 제시 세포를 폐 MSC에 첨가했습니다.

그런 다음 분리된 MSC의 증식을 본 그림과 같이 CFSE 표지 T 세포만 사용한 배경과 비교하여 CFSE의 평균 형광 강도의 감소로 측정했으며, 폐 SC가 없고 항원 제시 세포가 존재하는 경우, PC 플러스 마이너스 O 알부민 CD 40 양성 유효 T 세포는 CFSE 강도의 감소를 보여주고, 이는 빨간색 원으로 표시된 증식을 나타냅니다. T 세포 막의 CFSE 형광 강도는 폐 M-S-C-A-P-C 플러스에서 OVA CD를 뺀 모든 세포 분열, 즉 절반이 분열할 때마다 계량 경제학적으로 감소합니다. 40 양성 영향을 받은 T 세포는 CFSE 강도에 큰 변화가 없음을 나타내며, 이는 발달 후 증식이 부족함을 나타냅니다. 이 기술은 폐 줄기 세포 생물학 분야의 연구자들이 폐동맥 고혈압 및 폐 섬유증과 같은 폐 질환에서 중간엽 줄기 세포의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 기술을 마스터하면 이 절차에 따라 약 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 추정되는 폐 중간엽 줄기 세포가 적절한 다중 계통 분화, 뼈 지방 및 연골에 대한 잠재력을 나타내는지 여부를 포함한 추가 질문에 답하기 위해 분화 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.