흑색종의 표적 검증에 있어 CD133 양성 세포를 분리하는 것이 왜 중요한가요?

CD133-양성 세포를 분리하면 종양 형성 및 자가 재생 능력에 대한 기능적 테스트가 가능하며, 이는 흑색종의 암 줄기세포 표적을 검증하는 데 매우 중요합니다. 이러한 정제 과정은 비줄기세포로 인한 노이즈를 줄여 표적 의존성 분석의 신뢰도를 높여줍니다. 본 방법은 CD133 발현과 종양 개시 잠재력을 연결함으로써 기전적 리스크 감소를 지원합니다.

자기 활성 세포 분리법은 줄기세포 연구에서 어떻게 독립 변수의 분리를 가능하게 합니까?

자기 활성 세포 분류법은 비오틴화 항체와 마이크로비드를 사용하여 표적 집단만을 표지함으로써 CD133 양성 및 음성 분획을 분리하여 명확한 실험군을 형성합니다. 이러한 독립 변수(CD133 상태)의 분리를 통해 연구자는 기능적 차이가 구체적으로 줄기세포 농축에 의한 것임을 입증할 수 있습니다. 이 기술은 분석에서 관찰된 표현형이 혼합 집단이 아닌 분리된 변수와 연관되어 있음을 보장합니다.

CD133으로 정의된 멜라노마 분획을 분리함으로써 어떤 정량적 종속 변수 측정이 가능합니까?

분리된 분획을 통해 구 형성 효율, 체내(in vivo) 종양 개시 빈도 및 차등 약물 반응률과 같은 정량적 측정이 가능합니다. 이러한 종속 변수들은 CD133 양성 세포와 음성 세포 간의 줄기세포능 관련 표현형을 비교하기 위한 수치적 판독값을 제공합니다. 이 방법은 실험 조건 전반에 걸친 줄기세포 빈도와 기능적 효능의 통계적 분석을 지원합니다.

신뢰할 수 있는 CD133 양성 및 음성 흑색종 세포를 분리하는 데 있어 복제 요구 사항이 중요한 이유는 무엇입니까?

반복 실험은 분리 과정이 실험 전반에 걸쳐 CD133로 정의된 분획의 일관된 순도와 생존율을 보장하도록 하며, 이는 재현 가능한 기능 분석을 위해 필수적입니다. 분리 효율의 가변성은 줄기세포 집단과 비줄기세포 집단 간의 비교를 혼동시켜 표적 검증 노력을 저해할 수 있습니다. 반복 실행을 포함한 표준화된 프로토콜은 산업 현장에서 순도와 회수율에 대한 견고한 임계값을 설정하는 데 도움이 됩니다.

흑색종 줄기세포 워크플로우에서 CD133 분리를 구현하기 전에 어떤 통계 분석 역량이 필요한가요?

실행을 위해서는 분리 효율을 평가하기 위해 유세포 분석법(flow cytometry) 또는 유사한 방법을 통해 순도와 수율을 정량화할 수 있는 능력이 필요합니다. 분리된 분획 간의 기능성 분석(예: 종양 형성, 증식)에 대한 통계적 비교를 위해서는 유의성과 효과 크기를 계산하기 위한 도구가 필수적입니다. 반복 데이터 분석용 소프트웨어를 사용하면 줄기세포 표현형에서 관찰된 차이가 분리 과정의 변동성에 의한 것이 아니라 통계적으로 유효함을 보장할 수 있습니다.

흑색종 줄기세포 분리: 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 CD133 양성 및 음성 흑색종 세포를 얻는 방법

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구

0 조회수 • 5:40 분 • April 30th, 2023

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- 흑색종은 자가 재생과 종양 시작 능력을 모두 가진 암 줄기세포의 작은 하위 집단을 보유하고 있습니다. 펜타판 막관통 당단백질인 CD133 또는 Prominin-1은 전이성 흑색종 암 줄기세포에서 발현되는 주요 마커 중 하나입니다. CD133 양성 세포를 분리하려면 적절한 완충액에서 원발성 흑색종 세포를 현탁시키는 것으로 시작합니다.

세포 표면의 비특이적 결합 부위를 차단하는 단백질을 함유한 차단 시약으로 배양합니다. 비오틴화된 CD133 1차 항체로 세포를 처리합니다. 이 항체는 CD133 양성 세포에서 발현된 CD133 항원에 결합합니다. 이제 현탁액에 항비오틴 자성 마이크로비즈를 추가합니다. 마이크로비즈가 비오틴 표지된 세포에 결합할 수 있도록 배양합니다.

마지막으로, 배양된 현탁액을 자기장에 놓인 컬럼에 통과시킵니다. 자기 영향으로 마이크로비즈로 표지된 모든 CD133 양성 세포는 컬럼에 달라붙고 표지되지 않은 세포는 통과합니다. 이러한 비표지 CD133 음성 세포를 수집합니다. 자기장에서 컬럼을 제거합니다. 적절한 완충액을 사용하여 내용물을 세척하여 CD133 양성 세포를 용출하고 수집합니다.

다음 프로토콜에서는 종양 조직에서 얻은 원발성 흑색종 배양에서 CD133 양성 및 음성 암 줄기세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 80% 융합 세포를 예열된 PBS로 세척합니다. 적절한 양의 Accutase를 추가하고 세포가 배양 표면에서 분리될 때까지 배양합니다. Quantum 263 배지에서 세포를 수확하고 50ml 튜브로 옮깁니다.

셀을 열거합니다. 그런 다음 300 x g 및 섭씨 4-8도에서 5분 동안 필요한 수의 세포를 원심분리합니다. 상층액을 완전히 흡인하고 350 마이크로리터 MACS 완충액에서 8번째 세포까지 최대 1배까지 재현탁합니다. 100마이크로리터 FcR 차단 시약과 50마이크로리터 CD133/1-비오틴을 추가합니다. 잘 섞어 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.

10 millilit MACS buffer로 세포를 세척한 다음 300 x g 및 섭씨 4-8도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 완전히 흡인합니다. 두 번째 세척 후 세포 펠릿을 400마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁합니다. 100마이크로리터의 항비오틴 마이크로비즈를 넣고 잘 섞습니다. 섭씨 4-8도에서 15분 동안 배양합니다.

한편, 자기 분리를 위해 MACS 분리기를 준비하려면 QuadroMACS를 MACS 분리기 멀티 스탠드에 부착하십시오. 컬럼 날개가 있는 LS 컬럼을 필요한 수만큼 QuadroMACS의 자기장에서 앞쪽에 삽입합니다. 각 LS 컬럼에 사전 분리 필터를 배치하고 각 컬럼 아래에 적절한 수집 튜브를 놓습니다.

필터와 컬럼을 3ml MACS 버퍼로 헹구고 플로우 스루를 버립니다. 앞서 설명한 바와 같이 MACS 완충액에서 세포를 세척한 후 500마이크로리터 MACS 완충액에 세포를 재현탁하고 준비된 LS 컬럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 컬럼당 3ml의 MACS 버퍼로 3회 세척합니다. 표지되지 않은 CD133 음성 세포 분획의 총 폐수를 수집합니다.

그런 다음 Pre-Separation Filter를 버리고 분리기에서 컬럼을 제거한 다음 적절한 수집 튜브에 놓습니다. 5ml MACS 버퍼를 적용합니다. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 라벨링된 CD133 양성 세포를 즉시 세척합니다. 음성 분획의 순도를 높이려면 세포 현탁액을 새로운 평형 LS 컬럼에 적용하고 유출 CD133-음성 분획을 수집합니다.