흑색종 줄기세포 분리: 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 CD133 양성 및 음성 흑색종 세포를 얻는 방법

- 흑색종은 자가 재생과 종양 시작 능력을 모두 가진 암 줄기세포의 작은 하위 집단을 보유하고 있습니다. 펜타판 막관통 당단백질인 CD133 또는 Prominin-1은 전이성 흑색종 암 줄기세포에서 발현되는 주요 마커 중 하나입니다. CD133 양성 세포를 분리하려면 적절한 완충액에서 원발성 흑색종 세포를 현탁시키는 것으로 시작합니다.

세포 표면의 비특이적 결합 부위를 차단하는 단백질을 함유한 차단 시약으로 배양합니다. 비오틴화된 CD133 1차 항체로 세포를 처리합니다. 이 항체는 CD133 양성 세포에서 발현된 CD133 항원에 결합합니다. 이제 현탁액에 항비오틴 자성 마이크로비즈를 추가합니다. 마이크로비즈가 비오틴 표지된 세포에 결합할 수 있도록 배양합니다.

마지막으로, 배양된 현탁액을 자기장에 놓인 컬럼에 통과시킵니다. 자기 영향으로 마이크로비즈로 표지된 모든 CD133 양성 세포는 컬럼에 달라붙고 표지되지 않은 세포는 통과합니다. 이러한 비표지 CD133 음성 세포를 수집합니다. 자기장에서 컬럼을 제거합니다. 적절한 완충액을 사용하여 내용물을 세척하여 CD133 양성 세포를 용출하고 수집합니다.

다음 프로토콜에서는 종양 조직에서 얻은 원발성 흑색종 배양에서 CD133 양성 및 음성 암 줄기세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 80% 융합 세포를 예열된 PBS로 세척합니다. 적절한 양의 Accutase를 추가하고 세포가 배양 표면에서 분리될 때까지 배양합니다. Quantum 263 배지에서 세포를 수확하고 50ml 튜브로 옮깁니다.

셀을 열거합니다. 그런 다음 300 x g 및 섭씨 4-8도에서 5분 동안 필요한 수의 세포를 원심분리합니다. 상층액을 완전히 흡인하고 350 마이크로리터 MACS 완충액에서 8번째 세포까지 최대 1배까지 재현탁합니다. 100마이크로리터 FcR 차단 시약과 50마이크로리터 CD133/1-비오틴을 추가합니다. 잘 섞어 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.

10 millilit MACS buffer로 세포를 세척한 다음 300 x g 및 섭씨 4-8도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 완전히 흡인합니다. 두 번째 세척 후 세포 펠릿을 400마이크로리터의 MACS 완충액에 재현탁합니다. 100마이크로리터의 항비오틴 마이크로비즈를 넣고 잘 섞습니다. 섭씨 4-8도에서 15분 동안 배양합니다.

한편, 자기 분리를 위해 MACS 분리기를 준비하려면 QuadroMACS를 MACS 분