의 세포 상호 작용 Visualisation 및 부량 Neisseria meningitidis과 인간

다음 실험의 전반적인 목표는 내재화된 박테리아인 RIA 수막과 세포골격 단백질인 알파 액티닌(Alpha Actinin)의 공동 국소화 수준을 평가하는 것입니다. 이는 배양된 인간 뇌 미세혈관 세포를 3시간에서 8시간 동안 하룻밤 동안 배양한 박테리아로 감염시켜 박테리아가 표적 세포에 침투할 수 있도록 함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 세포 내 박테리아가 있는 세포를 세척하고 고정한 다음 투과하여 감염된 배양물을 내재화된 박테리아와 세포 내 알파 액티닌의 면역 염색을 준비합니다.

컨포칼 이미징 및 공동 국소화 소프트웨어의 적용에 따라 세포 내 공동 국소화의 이미지를 관찰할 수 있으며 OPC를 발현하는 Meninga Croci 및 막 단백질이 공초점 현미경 시각화 및 정량적 공동 국소화 분석을 기반으로 세포 내 알파 액티닌과 특이적으로 상호 작용할 수 있음을 보여주는 정량화된 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 브리 대학교(University of Bri) 세포 분자 의학과의 Mata TI Lab 교수의 Isel Maria입니다. 오늘 우리는 세포 내 박테리아와 세포 골격계 단백질의 비율, col의 수준을 추정하는 절차를 보여 드리겠습니다.

우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 자동 막 단백질 OPC를 발현하는 균사체 수막염과 세포골격 단백질 알파 액틴의 상호 작용을 연구합니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 작업은 적절한 안전 실험실에서 수행되어야 합니다.

면역 염색 절차 2일 전에 뇌 심장 주입에 관심 있는 박테리아 염색을 접종합니다. 10%의 가열된 말 혈액이 보충된 한천 플레이트는 면역 염색 전날 5%의 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도의 하룻밤 동안 자랍니다. 10마이크로리터 배양 루프를 사용하여 하룻밤 동안 박테리아 배양을 현탁합니다.

PBSB 2ml에 현탁액을 실온에서 5분 동안 그대로 두어 큰 박테리아 응집체가 침전되도록 합니다. 다음으로, 20 마이크로 리터의 박테리아 현탁액을 포함하는 두 개의 바이알에 1 % SDS 0.1 몰 수산화 나트륨 1 밀리리터를 첨가하여 펠렛을 방해하지 않고 현탁액의 상단 1 밀리리터를 멸균 튜브로 옮기고 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 박테리아 수를 추정합니다.

용액의 흡광도를 측정하여 핵산 함량을 측정합니다. 216 개미에서 박테리아 현탁액을 감염 매체에서 인간의 뇌 미세혈관 내피 세포를 감염시키는 데 필요한 밀도로 조정합니다. 면역 염색 이틀 전에 파종된 인간 뇌 미세혈관 내피 세포 또는 H-B-M-E-C-A는 16mm 유리 커버 슬립을 12개의 웰 플레이트의 웰에 넣고 HBME 바다를 50%로 시드 커버 슬립의 합류점은 다음 날 5% 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

우리 실험실에서 갓 준비한 박테리아 현탁액으로 세포를 감염시킵니다. 표적 세포당 200 - 300 집락 형성 단위의 감염 비율이 일상적으로 사용됩니다. 감염 기간이 끝날 때 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소를 넣고 3-8시간 동안 배양합니다.

PBS로 세포를 3회 세척하고 실온에서 2%파라 포름알데히드 500마이크로리터를 30-45분 동안 고정합니다.파라 포름알데히드를 세척한 후 PBS에 희석한 0.1%Triton X 100을 10분 동안 배양하여 파라알데히드 고정 세포를 퍼밍합니다. 마지막으로 PBS로 샘플을 세 번 세척하고 그림과 같이 면역 염색을 진행합니다. 다음으로 세포 내 박테리아와 dfor actinin의 염색을 동시에 수행할 수 있습니다.

12개의 웰 플레이트에서 30-60분 동안 500마이크로리터의 3%B-S-A-P-B-S-T로 투과성 세포를 포함하는 커버 슬립을 차단합니다. PBS 전사로 세척한 후 실온에서 각 커버 슬립을 12웰 플레이트의 새로운 드라이 웰에 박테리아와 알파 액티닌에 대한 1차 항체를 동시에 커버 슬립 당 80 내지 100 마이크로리터의 항체를 조심스럽게 첨가하면 커버 슬립의 표면을 덮을 수 있도록 조심스럽게 첨가하면 충분하며, 실온에서 1시간 동안 배양 종료시, 에 PBS 200마이크로리터를 추가하고, 커버 슬립을 잘 들어 올려 PBS 500마이크로리터가 들어 있는 새 우물에 넣습니다.5분 후 피펫팅으로 PBS를 제거한 다음 새 PBS를 추가합니다. 두 번 반복하고 덮개 슬립을 새 건조 우물로 옮깁니다.

다음으로, 1 % B-S-A-P-B-S-T에 희석 된 다른 형광 색소에 접합 된 적절한 2 차 항체를 첨가하고, 배양 세척이 끝나면 실온에서 1 시간 동안 배양 세척 한 다음 실온에서 5 분 동안 DPI로 DNA를 대조 염색하고,이 배양이 끝나면 PBS에서 커버 슬립을 한 번 세척 한 다음 마운팅 한 방울로 장착합니다. 중간 장착형 커버 슬립은 관찰할 준비가 될 때까지 어두운 곳에 보관해야 합니다. 현미경 아래에서는 도립 에피 형광 현미경에 부착된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 면역 표지된 샘플의 이미지를 관찰하고 캡처합니다.

대물렌즈에 한 방울 떨어뜨려 CLSM 절차를 시작하고 표본 슬라이드 커버를 놓고 현미경 스테이지에서 미끄러져 내려 현미경을 시각적 모드로 설정하고 현미경의 안안렌즈를 사용하여 관심 영역을 찾으면 이제 Leica 소프트웨어를 사용할 준비가 되었습니다. XY zed 획득 모드를 선택합니다. 공동 국소화 연구를 위해 5개의 12 x 5 12 형식을 선택합니다.

해상도가 높을수록 이미지가 더 정확해집니다. 그런 다음 양방향 X 모드를 선택하면 스캔 속도가 빨라지고 사진 표백을 줄이는 데 도움이 됩니다. 순차 스캔 설정을 지정합니다.

SEC 함수를 클릭한 다음 선 사이를 선택합니다. 2차 항체에 접합된 형광 색소에 따라 레이저 빔을 선택합니다. DPI 4 88 나노 미터의 경우 4 0 5 나노 미터 Alexa, Fluor 4 88 및 5 61 나노 미터.

trixy의 경우 광전자 증배관 1, 2, 3을 각각 활성화합니다. Z 스택 또는 시리즈의 상단 및 하단을 설정합니다. 다음으로 Zed 단계 크기를 0.2마이크로미터로 설정합니다.

RIA 맹자는 디플로 오커스(diplo occus)이며 각 코커스의 직경이 대략 0.5마이크로미터이기 때문에 0.2마이크로미터의 Z 스텝 크기는 각 코커스를 최소 두 번 스캔할 확률을 높입니다. 시작을 클릭하여 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 라인 평균을 3으로 선택하여 최종 스캔 매개변수를 설정합니다. 이중 또는 삼중 염색 이미지는 서로 다른 파장에서 순차적으로 스캔하고 각 채널에 대해 라인 간 모드를 사용하여 서로 다른 발색단 간의 누화를 제거하여 얻을 수 있습니다.

두 형광 색소의 공동 국소화를 표시하려면 오버레이 기능을 선택하여 선택한 채널을 단일 이미지로 병합합니다. 예를 들어, Alexa 4 88과 trissy Fluor Chromes가 모두 공동 국소화하는 경우 가능한 공동 국소화를 시각화하는 데 필요한 2D 재구성을 위해 오버레이된 이미지에 노란색이 나타나며 최대 투영 기능을 사용하여 Zed 스택 또는 시리즈를 컴파일합니다. Z 스택 또는 시리즈를 획득한 후 데이터를 처리하여 다양한 요소의 세포 내 국소화를 시각화하기 위한 직교 이미지를 얻을 수 있습니다.

공동 국소화의 정량화는 IMP 프로비저닝의 Vol City 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. CLSM 이미지가 있는 라이브러리를 만들려면 상단 표시줄의 이미지에서 확장 초점을 선택합니다. 이 도구는 분석할 2D 이미지에서 Zacks를 결합합니다.

이제 COLOCALIZATION 도구를 선택합니다. 분석할 두 채널은 색 농도가 같아야 합니다. 수량화할 영역을 선택합니다.

배경을 제거하도록 임계값을 설정합니다. Generate colocalization(공동 국소화 생성)을 선택하여 colocalization output을 생성합니다. Colocalization Statistics는 이전에 선택한 관심 영역에 대해 생성됩니다.

다음으로, mander의 계수 R과 ny를 선택합니다. 마지막으로, 여기에 표시된 데이터 표시를 위해 Excel 문서로 값을 내보내거나 통계 값을 내보내고, 여기에 표시된 것은 8시간 동안 수막수막에 감염된 인간 뇌 내피 세포의 대표적인 컨포칼 이미징 결과입니다. 박테리아의 위치는 빨간색으로 표시됩니다.

알파 악티닌의 위치는 녹색으로 표시되지만 화살표는 박테리아 주변에서 높은 수준의 알파 액티닌 축적이 발생한 것으로 보이는 영역을 나타냅니다. 이 오버레이 이미지에는 황갈색이 나타나는 여러 영역이 있는데, 이는 수막증 occi와 알파 액티닌 사이의 공동 국소화를 암시합니다. 다음 이미지에서 감염된 H-B-M-E-C 단층의 광학 해부는 세포 기저부에 위치한 세포 내 박테리아 주변의 공동 국소화를 나타냅니다.

감염된 H-B-M-E-C 단층의 3차원 이미지를 처리했을 때, 정점 표면의 비스듬한 모습은 빨간색 화살표로 표시된 빨간색으로 염색된 듀란트 박테리아를 보여주며, 노란색 화살표로 표시된 내피 세포의 기저 표면을 향해 위치한 여러 박테리아를 보여줍니다. 뚜렷한 주황색, 노란색의 기저 위치는 이 endon XZ 단면에서 더 명확하게 볼 수 있습니다. 멀리와는 대조적으로, 내재화된 박테리아와 멘톤 또는 액틴을 라벨링한 액티닌 실험에서는 액틴과 가끔 공동 국소화가 나타나지만 H-B-M-E-C 세포에서 발효되는 경우 드물게 공동 국소화

이전 실험에서 관찰된 바와 같이, 레틴은 흰색 화살표로 표시된 몇 가지 내재화된 박테리아 주위에 집중되어 있었습니다. 상대적 중복을 얻기 위해 데이터도 분석했습니다. Manda에 따르면 계수 R은 공동 국소화 IE의 실제 정도를 나타내며, 수막구균을 발현하는 OPC에 감염된 H-B-M-E-C에서 알파 액티닌, 멘팅 및 액틴의 총 픽셀 수와 비교하여 공동 국소화하는 픽셀의 수, 수막구균에서 고삐의 25% 이상 겹침을 얻었습니다.

계수와 Y는 덜 풍부한 수닝가 코코아 신호가 발생할 때마다 더 풍부한 고삐 신호의 통화 빈도를 측정한 것입니다. 이 측정은 내재화된 수막(meninga cockeye) 부근에서 알파 액티닌(alpha actinin)의 발생이 현저한 수준임을 보여줍니다. 이 실험에서 세포골격 요소를 사용하여 내재화된 박테리아의 도입을 시각화하고 정량화하는 방법을 보여줍니다.

구조의 무결성을 유지하고 높은 배경을 피하기 위해 고정 및 면역 줄기 프로토콜을 엄격하게 따르는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.