단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

여기에서는 살아있는 박테리아 세포에 대해 단일 분자 형광 현미경 검사를 수행하여 기능성 분자 복합체를 검출, 추적 및 정량화할 수 있는 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 형광 염료 분자에 태그가 지정된 단백질을 만드는 박테리아를 성장시키는 것으로 시작됩니다. 4-6시간 후, 배양액에서 소량의 세포를 추출하고 편모 필라멘트를 전단하여 절단합니다.

플로우 셀(flow cell) 내부의 유리 커버 슬립은 세포가 표면에 달라붙을 수 있도록 코팅되어 있습니다. 세포를 플로우 셀(flow cell)에 주입하고 겔러 스터브(gellar stub)를 통해 테더링하며, 이는 레이저 여기 현미경을 사용하여 형광으로 볼 수 있습니다. 그런 다음 높은 양자 효율 카메라가 태그가 지정된 분자 복합체의 밝은 명시야 및 형광 이미지를 기록합니다.

안녕하세요, 제 이름은 이안 도이(Ian Doy)이고, 옥스퍼드 대학교 생화학과의 마크 리(Mark Lee)와 함께 일하고 있습니다. 저는 물리학과에서 마크 리(Mark Lee)와 함께 일하고 있는 알렉스 로버트슨(Alex Robertson)입니다. 저는 물리학과에 있는 누출 연구소의 Nick De입니다.

오늘은 고급 형광 현미경을 사용하여 살아있는 박테리아의 단일 분자 복합체를 시각화하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 이 절차를 사용하여 기능적 상태에서 이것을 연구합니다. 우리는 또한 자연 생물학 기계와 나노미터 렌즈 스케일의 실시간 역학을 조사하는 데 사용하고 있습니다.

시작하겠습니다. 시작하려면 50마이크로리터의 얼어붙은 대장균 박테리아 줄기를 해동합니다. 이들은 유전적으로 변형된 것입니다.

단백질에 형광 염료 분자를 태그하려면 LB 성장 배지 5ml를 접종하고 섭씨 37도에서 밤새 호기적으로 흔드는 박테리아를 성장시킵니다. 다음날 아침, 50 마이크로 리터의 포화 배양액을 취하여 최소 M 63 포도당 배양 배지로 계소 배양하여 섭씨 30도에서 4-6 시간 동안 배양합니다. 여기에는 두 가지 다른 세포 균주가 사용됩니다.

1개는 GFP에 융합된 사이토크롬 수송 전자를 표현한다. 다른 하나는 박테리아 편모 모터에 관여하는 단백질을 발현합니다. GFP에 융합된 세포는 고정된 샘플로 보는 경우 성장하는 하위 배양에서 직접 수확할 수 있으며, 묶인 조건에서 볼 경우 박테리아 편모를 절단하기 위해 전단할 수 있습니다.

박테리아를 전단하려면 1-5ml의 하위 배양을 멸균 배관으로 두 개의 멸균 주사기로 구성된 장치에 넣습니다. 각 주사기 펌프를 번갈아 가며 좁은 튜브를 통해 배양물을 밀어 얻은 전단 정도에 따라 약 50-100회 다음 배양물을 원심분리하여 세포를 펠릿화한 다음 편모 조각을 제거하기 위해 최소한의 배지에서 세포를 재현탁합니다. 세포가 준비되면 수산화칼륨과 에탄올의 포화 용액에 20분 동안 담가 세척된 BK 7 유리 커버 슬립을 준비합니다.

탈이온수와 에탄올로 철저히 헹구고 최소 1시간 동안 자연 건조시킵니다. 다음으로, 현미경에 세포를 수용할 간단한 플로우 셀을 구성합니다. 이렇게하려면 BK seven 유리 현미경 슬라이드에 파라핀 그리스 선을 그린 다음 청소된 커버 슬립 중 하나를 위에 올려 터널 샌드위치를 만듭니다.

집게로 부드럽게 누릅니다. 이렇게 하면 플로우 셀의 부피가 5-10마이크로리터가 됩니다. 고정된 세포를 관찰하려면 0.1% poly L lysine 용액을 주입하여 플로우 셀을 채우고 실온에서 최소 1분 동안 배양합니다.

다음으로, 플로우 셀의 한쪽 끝에서 100마이크로리터의 최소 매체를 주입하고 동시에 다른 쪽 끝의 티슈 페이퍼로 플로우 셀을 통해 매체를 흡수하여 플로우 셀을 세척한 후, WIC는 200나노미터 직경의 라텍스 마이크로스피어를 최소 매체에 500회 희석하여 커버 슬립 표면을 표시하여 20마이크로리터를 던졌습니다. flow cell(플로우 셀)을 간단한 습도 챔버에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 플로우 셀은 커버 슬립이 아래를 향하도록 반전됩니다.

그런 다음 바인딩되지 않은 구슬은 티슈 페이퍼로 100마이크로리터의 최소 매체를 통해 심지화하여 씻겨 냅니다. 테더링된 세포를 관찰하려면 poly L lysine incubation 단계를 건너뛰고 플로우 셀에 밀리리터당 5마이크로그램의 Anti-Flag gellan 항체 용액을 채운 다음 습도 챔버에 10분 동안 넣습니다. 배양 후 티슈 페이퍼로 심지를 만들어 플로우 셀을 씻어냅니다.

다음으로, 조직 종이가 있는 플로우 셀을 통해 세포 배양의 WIC 20마이크로리터를 진행하고, 전단된 샘플을 사용하여 테더링된 세포를 관찰하거나 공유되지 않은 샘플을 사용하여 고정된 세포를 관찰한 후, 플로우 셀을 반전시켜 20분 동안 습도 챔버에 배치합니다. 그런 다음 결합되지 않은 세포는 100마이크로리터의 최소 매체를 통해 심지를 통해 세척됩니다. 커버 슬립의 상단 표면 중앙에 침지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다.

플로우 셀(flow cell)을 맞춤형으로 제작된 형광 현미경의 샘플 홀더에 부드럽게 놓습니다. 이것은 높은 개구수 대물 렌즈와 광학 접촉을 이루어야 합니다. 그런 다음 현미경의 전자 증식 카메라를 켜고 카메라를 섭씨 영하 70도로 냉각하도록 설정합니다.

이 소프트웨어는 25Hz의 일반적인 프레임 속도로 이미지를 획득하도록 설정되어 있습니다. 프레임 전송 모드에서. 명시야 조명을 켜고 이미지에 초점을 맞춥니다.

긴 축에 붙어 있는 것을 기준으로 이미징할 적절한 세포 또는 세포 그룹을 선택합니다. 커버 슬립 표면과 평행하게 초점을 조정하여 커버 슬립 표면에 부착된 200나노미터 라텍스 비드가 초점이 맞도록 합니다. 명시야에서 이미지 염기서열을 획득하여 세포체의 윤곽을 기록합니다.

그런 다음 명시야 조명이 꺼지고 잔디라고도 하는 전반사 형광을 사용하여 이미징을 위해 카메라 게인이 최대로 활성화됩니다. 카메라 획득을 시작하고 레이저 셔터를 열어 박테리아 내의 형광 단백질을 여기시킵니다. 레이저 강도 및 획득 속도에 대한 매개변수는 특정 생물학적 시스템에 맞게 최적화되어야 합니다.

연구 중인 샘플은 사진이 표백될 때까지 조명되며, 일반적으로 약 10초가 소요됩니다. 데이터가 수집되면 이미지는 맞춤형 서면 분석 프로그램에 입력되며, 이 프로그램은 몇 나노미터의 정밀도로 세포 내 형광 반점의 위치를 자동으로 감지하고 크기와 밝기를 추출합니다. 그런 다음 인력 분자 복합체의 시간에 대한 광 표백 트레이스의 밝기를 사용하여 화학량론 사용을 추정합니다.

이 방법을 사용하면 명시야에서 보이는 세포의 이미지가 매우 뚜렷하여 고정된 세포에 형광을 사용하여 세포체의 둘레가 흰색 회색 세포체에 비해 어둡습니다. 일반적으로 너비가 250-300 나노 미터인 강도의 뚜렷한 반점이 여기에 거짓 색상으로 표시되는 것을 볼 수 있습니다. 건강한 테더링된 세포는 형광 여기 하에서 명시야 이미지에서 테더 부착 지점 주위를 회전하는 것을 볼 수 있습니다.

일부 분자 복합체는 부착 지점에서 볼 수도 있으며, 이는 Geller 모터와 함께 탱크에 담긴 단백질의 국소화를 나타냅니다. 이 반점은 개별 분자 복합체입니다. 보이는 이러한 수의 수는 사용된 조명 모드와 한 번에 셀에 실제로 존재하는 복합체의 수에 따라 달라집니다.

여기에 사용된 라벨링된 사이토크롬의 경우와 같이 초기에 반점의 밀도가 매우 높은 경우 초기 프랩 표백제를 수행하면 이미징 대비를 개선할 수 있습니다. 반점의 이동성은 특정 생물학적 시스템에 따라 다릅니다. 연구 중에서는 고급 형광 현미경을 사용하여 단일 분자 복합체를 시각화하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때 플래그 모터의 기능을 손상시킬 수 있으므로 전단 셀을 사용하지 않는 것이 중요합니다. 또한 산소가 고갈될 수 있으므로 현미경 슬라이드의 세포를 한 시간 이상 방치하지 않는 것이 중요합니다. 최상의 이미징 조건을 찾기 위해서는 자동화가 필요합니다.

정제된 GFP를 단독으로 사용하여 특정 현미경 시스템에 적합한 레이저 출력을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.