단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

본 연구에서는 기능적 분자 복합체를 검출, 추적 및 정량화하기 위해 살아있는 세균 세포에서 단일 분자 형광 현미경법을 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 형광 염료 분자가 표지된 단백질을 생성하는 세균을 배양하는 것으로 시작됩니다. 4~6시간 후, 배양액에서 소량의 세포를 추출하고 전단력을 이용해 편모 필라멘트를 절단합니다.

세포가 표면에 부착될 수 있도록 플로우 셀 내부의 유리 커버슬립을 코팅합니다. 세포를 플로우 셀에 주입하고 젤러 스터브(gellar stub)를 통해 고정시킨 후, 레이저 여기 현미경을 사용하여 형광으로 관찰합니다. 그 후 고양자 효율 카메라로 태그된 분자 복합체의 밝은 명시야 및 형광 이미지를 기록합니다.

안녕하세요, 저는 옥스퍼드 대학교 생화학과의 Mark Lee 교수님과 함께 연구하고 있는 Ian Doy입니다. 저는 물리학과에서 Mark Lee 교수님과 함께 연구하는 Alex Robertson입니다. 저는 물리학과에 위치한 leak lab의 Nick De입니다.

오늘은 고급 형광 현미경을 사용하여 살아있는 박테리아 내의 단일 분자 복합체를 시각화하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 이 절차를 통해 기능적 상태의 이를 연구합니다. 또한 나노미터 수준에서 천연 생물학적 기계의 실시간 역학을 조사하는 데 이 방법을 사용하고 있습니다.

그럼 시작하겠습니다. 우선, 유전적으로 변형된 냉동 상태의 e coli 박테리아 줄기 50 µL를 해동하십시오.

단백질에 형광 염료 분자를 표지하기 위해, 5 mL의 LB 성장 배지에 접종하고 37°C에서 하룻밤 동안 호기성으로 진탕 배양합니다. 다음 날 아침, 포화 배양액 50 µL를 취해 minimal M 63 Glucose 배양 배지에 계대 배양하고 30°C에서 4~6시간 동안 배양합니다. 여기에서는 두 가지 서로 다른 세포 균주가 사용됩니다.

하나는 GFP가 융합된 전자 전달 시토크롬을 발현합니다. 다른 하나는 박테리아 편모 모터에 관여하는 단백질을 발현합니다. GFP 융합 세포는 고정된 샘플로 관찰하려는 경우 성장 중인 하위 배양액에서 직접 수확하거나, 결속 조건에서 관찰하려는 경우 박테리아 편모를 절단하기 위해 전단 처리할 수 있습니다.

박테리아를 전단하기 위해, 멸균 파이핑을 통해 1~5 mL의 하위 배양액을 멸균된 주사기 2개로 구성된 장치에 넣습니다. 전단 정도에 따라 각 주사기 펌프를 번갈아 밀어 배양액을 좁은 튜브 속으로 약 50~100회 통과시킵니다. 다음으로, 배양액을 원심 분리하여 세포를 펠렛화한 후, 세포를 최소 배지(minimal media)에 재부유시켜 편모 파편을 제거합니다. 세포 준비가 완료되면, BK7 유리 커버슬립을 수산화칼륨과 에탄올의 포화 용액에 20분 동안 담가 세척하여 준비합니다.

탈이온수와 에탄올로 충분히 헹군 후, 최소 1시간 동안 자연 건조시킵니다. 다음으로, 현미경 내에서 세포를 수용할 단순 유동 셀(flow cell)을 제작합니다. 이를 위해 BK 7 유리 현미경 슬라이드 위에 파라핀 그리스로 선을 긋고, 그 위에 세척된 커버슬립 중 하나를 덮어 터널 샌드위치 구조를 만듭니다.

포셉으로 가볍게 눌러 줍니다. 이렇게 하면 플로우 셀 부피가 5~10 µL가 됩니다. 고정된 세포를 관찰하려면 0.1% poly L lysine 용액을 주입하여 플로우 셀을 채우고, 실온에서 최소 1분 동안 배양합니다.

다음으로, 플로우 셀의 한쪽 끝에서 100 µL의 최소 배지를 주입하고 동시에 반대쪽 끝에서 티슈 페이퍼로 배지를 흡수시켜 플로우 셀 내부를 세척합니다. 그 후, 커버슬립 표면을 표시하기 위해 최소 배지에 1:500으로 희석한 200 nm 직경의 라텍스 미세구체를 20 µL 주입하여 흡수시킵니다. 플로우 셀을 간이 습도 챔버에 넣고 상온에서 5분 동안 배양합니다. 플로우 셀은 커버슬립이 아래를 향하도록 뒤집어 놓습니다.

결합되지 않은 비드는 티슈 페이퍼를 이용해 100 µL의 최소 배지로 위킹(wicking)하여 씻어냅니다. 테더링된 세포를 관찰하려면 poly L lysine 배양 단계를 생략하는 대신, 플로우 셀을 5 µg/mL Anti-Flag gellan 항체 용액으로 채운 후 습도 챔버에 10분 동안 둡니다. 배양 후, 티슈 페이퍼로 위킹하여 플로우 셀 내부를 세척합니다.

다음으로, 조직지를 이용하여 20 µL의 세포 배양액을 플로우 셀(flow cell)에 흡수시킵니다. 이때 테더링된 세포를 관찰하기 위해 전단된 샘플을 사용하거나, 고정된 세포를 관찰하기 위해 전단되지 않은 샘플을 사용합니다. 플로우 셀을 뒤집어 습도 챔버에 20분 동안 둡니다. 그런 다음 100 µL의 최소 배지를 흡수시켜 결합하지 않은 세포들을 세척합니다. 커버슬립 상단 표면 중앙에 이머전 오일을 한 방울 떨어뜨립니다.

플로우 셀을 맞춤 제작된 형광 현미경의 샘플 홀더 위에 조심스럽게 놓습니다. 이렇게 하면 고개구수 대물렌즈와 광학적으로 접촉하게 됩니다. 다음으로, 현미경의 전자 증배 카메라를 켜고 카메라 냉각 온도를 -70 °C로 설정합니다.

소프트웨어는 일반적인 프레임 속도인 25 hertz로 이미지를 획득하도록 설정되어 있습니다. 프레임 전송 모드에서 명시야 조명을 켜고 이미지의 초점을 맞춥니다.

장축 방향으로 부착된 적절한 세포 또는 세포군을 선택하여 이미징합니다. 커버슬립 표면과 평행하게 초점을 조절하여 커버슬립 표면에 부착된 200 nanometer 라텍스 비즈가 정확히 초점에 맞도록 합니다. 명시야(brightfield)에서 이미지 시퀀스를 획득하여 세포체의 외곽선을 기록합니다.

그 후 명시야 조명을 끄고, TIRF(전반사 형광 현미경)를 이용한 이미징을 위해 카메라 게인을 최대로 설정합니다. 카메라 획득을 시작하고 레이저 셔터를 열어 박테리아 내의 형광 단백질을 여기시킵니다. 레이저 강도와 획득 속도 매개변수는 특정 생물학적 시스템에 맞게 최적화해야 합니다.

연구 대상 시료는 광퇴색이 일어날 때까지 조명하며, 이는 보통 약 10초 정도 소요됩니다. 데이터 수집이 완료되면, 이미지는 자체 제작한 분석 프로그램으로 전송되며, 이 프로그램은 세포 내 형광 점들의 위치를 수 나노미터 정밀도로 자동 검출하고 그 크기와 밝기를 추출합니다. 시간 경과에 따른 attract 분자 복합체의 광퇴색 추적 곡선의 밝기를 이용하여 화학 양론적 비율을 추정합니다.

이 방법을 사용하면 명시야(brightfield)에서 관찰되는 세포 이미지가 매우 뚜렷하며, 고정된 세포의 형광 이미지를 통해 흰색 또는 회색의 세포체 대비 세포체의 테두리가 어둡게 나타납니다. 일반적으로 너비가 250에서 300 nanometers인 뚜렷한 강도 지점들이 여기서는 가색(false color)으로 표시되어 보입니다. 형광 여기 상태의 명시야 이미지에서는 건강하게 결합된(tethered) 세포들이 결합 지점을 중심으로 회전하는 것을 확인할 수 있습니다.

일부 분자 복합체가 부착 지점에서 관찰될 수 있으며, 이는 tanked 단백질이 Geller 모터와 함께 국소화되었음을 나타냅니다. 이러한 반점들은 개별 분자 복합체입니다. 관찰되는 복합체의 수는 사용된 조명 모드와 어느 한 시점에 세포 내에 실제로 존재하는 복합체의 수에 따라 달라집니다.

본 실험에서 사용된 표지된 시토크롬(cytochrome)의 경우처럼 초기 반점 밀도가 매우 높다면, 초기 FRAP 표백을 수행하여 이미징 대비를 높일 수 있습니다. 반점의 이동성은 연구 대상인 특정 생물학적 시스템에 따라 달라집니다. 지금까지 첨단 형광 현미경을 사용하여 단일 분자 복합체를 시각화하는 방법을 살펴보았습니다.

이 절차를 수행할 때, 편모 모터의 기능이 손상될 수 있으므로 세포에 전단력이 가해지지 않도록 하는 것이 중요합니다. 또한, 세포가 산소 부족 상태가 될 수 있으므로 현미경 슬라이드 위에 1시간 이상 방치하지 않는 것이 중요합니다. 최적의 이미징 조건을 찾기 위해서는 자동화가 필요합니다.

사용 중인 현미경 시스템에 적합한 레이저 출력을 확인하기 위해 정제된 GFP만을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.