Name: 단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 학습하세요 생활세포에서 단일분자 형광현미경법을 이용하여 기능적 분자복합체를 검출하고 추적 및 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 세균세포에서 분자역학을 실시간으로 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 교수 유디트 아미티지 (옥스포드 대학, 영국)와 교수 콘라드 뮬리노 (런던 퀸 메리 대학, 영국)의 그룹에서 세균성 긴장의 종류의 기부금을 인정합니다. IMD는 공동 생화학 뎁트 오브 (옥스포드 대학)과 OCISB에 의해 후원되며 AR는 공학 및 물리 과학 연구위원회 (EPSRC) DTC의 학생이기 의해 후원되며 ND는 생물 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC)에서 재정 지원되며 MCL입니다 로열 사회 대학의 연구 활동에 의해 자금.

<ol><li> 이 절차를 시작하려면, 대장균에게 박테리아 세포를 표현 형광 단백질의 냉동 주식의 50 μl가 처음 사인을 알아낼 수 없을 아침에 C. 37도에서 하룻밤 다섯 ML의 LB 성장 매체 잡고 aerobically 재배,이 포화 문화의 50 μl가 추출됩니다 , 4 일에서 6 시간 동안 30도 각도의 C에서 최소 잠복기 M63 포도당 문화 미디어로 하위 교양. 여기서 우리는 전자 - 수송을 표현 한 중 서로 다른 두 가지 세포 변종을 사용하여 보여주 GFP, GFP에 융합 박테리아 flagellar 모터에 관련된 단백질을 표현하는 다른 융합 시토크롬. </li><li> 세포 고정화 샘플로를 보는 경우도 증가하고 하위 문화에서 직접 수확하거나 그들이 &quot;곁에&quot;조건 하에서 볼 경우 박테리아 flagella을 잘라야 빠졌어 수 있습니다. </li><li> 전단은 멸균 배관으로 가입이 무균 주사기로 구성된 장치로 하위 문화의 일반적으로 1 - 5ml 배치 포함됩니다. 전단은 좁은 튜브를 통해 문화를 밀어 각 주사기 펌프에서 추진하고 교류에 의해 이루어집니다. 이것은 필요한 전단의 범위에 따라 50 ~ 100 배 한 것입니다. 문화 다음 flagella 조각을 제거하는 최소한의 미디어 resuspended입니다 펠릿 세포에 centrifuged 있습니다. </li><li> 우리는 그때 그때 드 이온화 물과 에탄올에 철저 rinsing하고 최소한 1 H. 위해 공중에 건조하기 위해 떠나는 20 분 에탄올에 코의 포화 용액에 immersing로 BK7 유리 coverslips 청소 준비 </li><li> 우리는 현미경으로 세포를 집에 간단한 흐름 셀을 구축. 이것은 BK7 유리 현미경 슬라이드에 파라핀 그리스의 라인을 그리기 다음 터널 - 샌드위치를​​ 만들어 상단에있는 청소 coverlips 중 하나를 배치하고, 포셉 한 쌍의로 부드럽게 아래로 눌러, 5-10 μl의 흐름 세포 볼륨을주는 관련 . </li><li> 고정화 세포를 관찰하는 우리는 폴리 - L - 라이신의 0.1 % W / V 솔루션으로 주입하여 흐름 세포를 기입하고, 그것이 최소한 1 분 상온에서 품어 수 있습니다. 우리는 다음의 흐름 세포의 한쪽 끝을에서 미디어를 주입하고 다른 조직에서 종이로 위킹 100 μl 최소한의 미디어를 사용하여 밖으로 몰아내. </li><li> 우리는 다음 coverslip 표면을 표시하는 최소한의 미디어에 200 nm의 직경 라텍스 microspheres (Polysciences)의 1:500 희석 20 μl를 통해 심지. 흐름 세포는 coverslip은 간단한 습도 챔버의 표면의 맑은 플랫폼에 배치 아래쪽에 직면해있다 이러한 거꾸로, 5 분 실온에서 incubated입니다. 언바운드 비즈 그런 다음 100 μl 최소한의 매체를 통해서도 위킹 씻겨 있습니다. </li><li> 우리가 곁에 세포를 관찰하고자하는 경우에는 우리는 폴리 - L - 라이신 단계를 생략하고 대신 5 MG / ML 방지 flagellin 항체와 흐름 - 세포를 작성하십시오. 흐름 세포는 10 분 습도 챔버에서 개최하고 다음 위킹로를 통해 플러시됩니다. </li><li> 세포 배양의 20 μl가 고정화 세포를 보는에 닿는 세포 또는 unsheared 샘플을 관찰하는 경우도 가지각색 샘플을 사용하여 흐름 세포를 통해 다음 사악한입니다. </li><li> 흐름 셀은 뒤집혀 20 분 습도 챔버에 배치됩니다. 언바운드 세포 그런 다음 100 μl 최소 매체를 통해서도 위킹에 의해 씻겨 있습니다. </li><li> 침지 기름 방울이 coverslip의 상단 표면의 중앙에 위치하며 흐름 세포 그 다음 높은 숫자 조리개 목적 렌즈와 광학 접촉을 만드는 사용자 정의 지어진 형광 현미경의 샘플 홀더에 가볍게 배치됩니다. </li><li> 현미경 전자 - 곱한 카메라가 켜져 있고 카메라가 -70도 C로 냉각되도록 설정이며, 소프트웨어는 처음에 게인 컨트롤을 disenabling, 프레임 전송 모드에서 25 Hz의 전형적인 프레임 속도로 이미지를 얻기위한 설정 카메라. </li><li> 브라이트 조명이 켜져 있으며, 이미지가 자신이 coverslip 표면 자신의 긴 축 병렬로 붙어되는 바탕으로 몇 군데로 세포의 적절한 셀 또는 그룹을 선택 초점으로 가지고있다. 초점은 잘게 coverslip 표면에 붙어있는 200 나노미터 라텍스 비즈 그냥 초점되는 것을 보장하기 위해 조정됩니다. </li><li> 이미지 시퀀스는 셀 본문의 개요를 기록 브라이트 인수입니다. 브라이트 조명이 꺼져되고 카메라 게인을 최대로 사용할 수 있습니다. </li><li> 총 내부 반사 형광 (또는 TIRF) 적절한 파장을 통해 레이저 광선을 (여기서, 녹색 형광 단백질 여기에 대해, 우리는 473 nm의 레이저를 사용)를 사용하여 표준 취득의 뒤쪽 초점 평면에 집중되는만큼 사전 설정 목적 렌즈지만 세포 샘플에 형광 여기에 대한 지극히 미미한 필드를 생성하는 광학 축에서 옆으로 있질. </li><li> 카메라 인수는 시작 레이저 셔터가 세균 내에 형광 단백질들을 흥분시키기 위해 열립니다. 인수의 레이저 강도와 속도에 대한 매개 변수는 다른 값으로 실험에 의해 조사를 받고 특정 생물 학적 시스템을 최적화할 필요가 있지만, 일반적인 범위 R세포막의 모바일 단백질 단지를 공부하는 elevant는 50-40 MS의 프레임 당 노출 시간, 직경 ~ 30 μm의의 원형 여기 영역 1-10 MW 레이저 파워입니다. 샘플은 photobleached, 일반적으로에 대한 ~ 10 S.까지 조명 아르 </li><li> 이 프로토콜은 두 세포의 시체가 coverslip과 flagellar 스텁 사이의 첨부 파일의 지점에 대한 회전되는 닿는 세포, 그리고 rigidly coverslip 표면에 고정되어 있습니다 고정화 세포를 사용할 수 있습니다. </li><li> 단지 높은 사본 번호가 일부 세포 변종 이전 TIRF 영상에 셀 중 하나를 장대에 초기 회절 - 제한된 초점을 맞춘 레이저 표백제의 혜택을 누릴 수 있습니다. 이 표백제 (또는 FRAP) photobleaching 후 형광 복구에 사용하는 것과 동일합니다. 우리의 사용자 정의 현미경 사용 여기 레이저 광 중 일부는 FRAP 타입 표백에 사용되는 두 번째 독립적인 경로로 내려 먹이 수 있습니다. 일반적으로 1 - 10mW 레이저 전원 범위 10-300 MS의 전형적인 표백 시간과 함께 사용됩니다. 이후보다 쉽게​​ 시각으로 그 지역에 확산 개별 단지를 허용 세포의 표백 영역에서보다 높은 영상 반면이 발생합니다. </li><li> &quot;slimfield&quot;라는 다른 조명 모드를 고용하는 세포막에서보다 훨씬 빠른 확산 세포 세포질에서 단지를 시각화하십시오. 여기 초점 레이저가 옆으로 단지 하나의 세포를 포괄하기 위해 확장됩니다. 이것은 일반적으로 밀리초의 속도가 훨씬 빠르고 노출을 취할 수있게 아주 강렬한 필드를 생성합니다. </li><li> 데이터 수집 후, 이미지가 사용자 정의 작성된 소프트웨어 (LabVIEW 8.5에서 코드)로 공급하고 있습니다. 이것은 자동으로 일반적으로 몇 나노미터의 정밀도로 세포에 형광 명소의 위치를​​ 감지하고 그들의 크기와 밝기를 추출합니다. 추적 분자 복잡한 시간과 관련하여 photobleaching 추적은 다음 stoichiometry을 추정하는 데 사용되는 brightnessof은 단일 분자 복잡한을 만들어 많은 개인 형광 단백질 즉. </li></ol> 대표 결과 : 프로토콜이 완료되면 브라이트에서 볼 세포의 정확하게 이미지는 흰색 / 회색 세포 기관 (그림 1A)에 대한 어두운 세포 기관의 경계와 함께 매우 독특한 것입니다. 형광 사용하여 고정화 세포에서, 우리는 폭 일반적으로 250-300 nm의 (그림 1B)의 독특한 명소 강도를 볼 수 있습니다. 건강 닿는 곳에 전지 브라이트 이미지의 테더 부착 지점 주위에 회전 볼 수 있습니다. 형광 여기에서 우리 사건의 일부 분자 단지도 flagellar 모터와 태그 단백질의 지방화를 나타내는, 첨부 파일의 시점에서 볼 수 있습니다. 이 반점은 개별 분자 단지이며, 본 그들의 숫자는 조명 사용 모드와 방법에 단지 많은 실제로 한 번에 세포에 존재에 따라 달라집니다. 반점의 이동성 연구에서 특정 생물 학적 시스템에 따라 다릅니다. 관광 명​​소의 밀도가 처음 매우 높다면, 그 다음 초기 FRAP의 표백제가 이미징 명암을 향상시킬 수 수행, 여기를 사용한 표시된 cytochromes 경우가 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="그림 1" /> 그림 1. (A) 브라이트와 고정화 대장균 세포에 대한 (B) TIRF 이미지 (거짓 색상)은 박테리아의 flagellar 모터에 관련된 것으로 알려진 녹색 형광 단백질 (GFP)을 융합 단백질을 표현. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol><li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential%2C+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

케어는이 이후 닿는 박테리아보고에 대해 &quot;이상의 전단&quot;세포가 flagellar 모터의 기능을 손상 수하지 않도록해야합니다. 그들은 산소가 고갈 될 수 있으므로 현미경 슬라이드에 한 시간보다 훨씬 오래 세포를 사용하는 것이 중요합니다. 상당한 최적화가 가장 현미경 이미징 조건 조사중인 특정 생물 학적 시스템에 음식을 제공 했었죠 찾을 수 필요할 수 있습니다. 그것은 특정 현미경 시스템에 필요한 정확한 강도 레이저 여기를 확인 혼자 정화 GFP를 사용하여 영상을 시도하는 것이 현명 수 있습니다.

단일 분자 단지를 떠올리 vivo에서 고급 형광 현미경을 사용하여

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

살아있는 세포의 메커니즘에 전체 통찰력은 세포 수준에서 사건을 이끌어하고 직접 핵심 프로세스를 조사하여 얻을 수 있습니다. 생물 학적 시스템의 전단 복잡 날짜하려면 대신 상대적으로 원유 대량 앙상블 평균 측정을 사용하여 단일 시스템 연구에 초점을 맞추고, 너무 요구하는 정확한 단일 분자 실험가 발생했습니다. 그러나 많은 중요한 과정은 단지 하나의 수준에서 살아있는 세포 또는 몇 분자에서 발생, 앙상블 측정은 일반적으로이 사건의 확률과 이기종 자연을 마스크. 여기, 고급 광학 현미경 및 분석 영상 분석 도구를 사용하여 우리는 하나의 살아있는 세균 단일 분자의 정밀도로 휴대 방법과 우리가 생물 학적 기계 작동에 분자 단지 내의 역학 관계를 볼 수 있습니다 내에서 단백질을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 기술은 생리학 직접 관련이있다. 그들은 최소한 - 섭동의 공부에서 생물 학적 샘플을 비침습이며, 완전히 살아있는 재료에 수사 숙련 있으​​며, 생물 물리학의 다른 단일 분자 접근법에 즉시 사용할 수 없습니다 있습니다. 또한, 생물 학적 표본은 모든으로 자연스럽게 발생하는 것보다 훨씬 더 많은 단백질을 생성하기위한보다 일반적인지만 그다지 좋지 접근 방식에 반대하는 수정되지 않은 세포 변종 ( &quot;게놈 인코딩&quot;) 거의 동일 수준의 찬란 - 태그 단백질 생산을 공부 ( &#39;플라스미드 표현&#39;). 따라서, 조사하게 될 실제 생물 학적 샘플이 자연의 생물에 매우 가까이 있으며, 실제 생리 프로세스에 따라서 관측 관련성이.

여기 기능성 분자 단지가 추적 및 계량, 감지 있도록 박테리아 세포를 생활에 단일 분자 형광 현미경을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

살아있는 세포의 메커니즘에 대한 완전한 통찰은 세포 수준에서 사건을 유도하고 지시하는 핵심 과정을 조사함으로써만 달성할 수 있습니다...

본 연구에서는 기능적 분자 복합체를 검출, 추적 및 정량화하기 위해 살아있는 세균 세포에서 단일 분자 형광 현미경법을 수행하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 형광 염료 분자가 표지된 단백질을 생성하는 세균을 배양하는 것으로 시작됩니다. 4~6시간 후, 배양액에서 소량의 세포를 추출하고 전단력을 이용해 편모 필라멘트를 절단합니다.세포가 표면에 부착될 수 있도록 플로우 셀 내부의 유리 커버슬립을 코팅합니다. 세포를 플로우 셀에 주입하고 젤러 스터브(gellar stub)를 통해 고정시킨 후, 레이저 여기 현미경을 사용하여 형광으로 관찰합니다. 그 후 고양자 효율 카메라로 태그된 분자 복합체의 밝은 명시야 및 형광 이미지를 기록합니다.안녕하세요, 저는 옥스퍼드 대학교 생화학과의 Mark Lee 교수님과 함께 연구하고 있는 Ian Doy입니다. 저는 물리학과에서 Mark Lee 교수님과 함께 연구하는 Alex Robertson입니다. 저는 물리학과에 위치한 leak lab의 Nick De입니다.오늘은 고급 형광 현미경을 사용하여 살아있는 박테리아 내의 단일 분자 복합체를 시각화하는 절차를 보여드리겠습니다. 우리는 이 절차를 통해 기능적 상태의 이를 연구합니다. 또한 나노미터 수준에서 천연 생물학적 기계의 실시간 역학을 조사하는 데 이 방법을 사용하고 있습니다.그럼 시작하겠습니다. 우선, 유전적으로 변형된 냉동 상태의 e coli 박테리아 줄기 50 µL를 해동하십시오.단백질에 형광 염료 분자를 표지하기 위해, 5 mL의 LB 성장 배지에 접종하고 37°C에서 하룻밤 동안 호기성으로 진탕 배양합니다. 다음 날 아침, 포화 배양액 50 µL를 취해 minimal M 63 Glucose 배양 배지에 계대 배양하고 30°C에서 4~6시간 동안 배양합니다. 여기에서는 두 가지 서로 다른 세포 균주가 사용됩니다.하나는 GFP가 융합된 전자 전달 시토크롬을 발현합니다. 다른 하나는 박테리아 편모 모터에 관여하는 단백질을 발현합니다. GFP 융합 세포는 고정된 샘플로 관찰하려는 경우 성장 중인 하위 배양액에서 직접 수확하거나, 결속 조건에서 관찰하려는 경우 박테리아 편모를 절단하기 위해 전단 처리할 수 있습니다.박테리아를 전단하기 위해, 멸균 파이핑을 통해 1~5 mL의 하위 배양액을 멸균된 주사기 2개로 구성된 장치에 넣습니다. 전단 정도에 따라 각 주사기 펌프를 번갈아 밀어 배양액을 좁은 튜브 속으로 약 50~100회 통과시킵니다. 다음으로, 배양액을 원심 분리하여 세포를 펠렛화한 후, 세포를 최소 배지(minimal media)에 재부유시켜 편모 파편을 제거합니다. 세포 준비가 완료되면, BK7 유리 커버슬립을 수산화칼륨과 에탄올의 포화 용액에 20분 동안 담가 세척하여 준비합니다.탈이온수와 에탄올로 충분히 헹군 후, 최소 1시간 동안 자연 건조시킵니다. 다음으로, 현미경 내에서 세포를 수용할 단순 유동 셀(flow cell)을 제작합니다. 이를 위해 BK 7 유리 현미경 슬라이드 위에 파라핀 그리스로 선을 긋고, 그 위에 세척된 커버슬립 중 하나를 덮어 터널 샌드위치 구조를 만듭니다.포셉으로 가볍게 눌러 줍니다. 이렇게 하면 플로우 셀 부피가 5~10 µL가 됩니다. 고정된 세포를 관찰하려면 0.1% poly L lysine 용액을 주입하여 플로우 셀을 채우고, 실온에서 최소 1분 동안 배양합니다.다음으로, 플로우 셀의 한쪽 끝에서 100 µL의 최소 배지를 주입하고 동시에 반대쪽 끝에서 티슈 페이퍼로 배지를 흡수시켜 플로우 셀 내부를 세척합니다. 그 후, 커버슬립 표면을 표시하기 위해 최소 배지에 1:500으로 희석한 200 nm 직경의 라텍스 미세구체를 20 µL 주입하여 흡수시킵니다. 플로우 셀을 간이 습도 챔버에 넣고 상온에서 5분 동안 배양합니다. 플로우 셀은 커버슬립이 아래를 향하도록 뒤집어 놓습니다.결합되지 않은 비드는 티슈 페이퍼를 이용해 100 µL의 최소 배지로 위킹(wicking)하여 씻어냅니다. 테더링된 세포를 관찰하려면 poly L lysine 배양 단계를 생략하는 대신, 플로우 셀을 5 µg/mL Anti-Flag gellan 항체 용액으로 채운 후 습도 챔버에 10분 동안 둡니다. 배양 후, 티슈 페이퍼로 위킹하여 플로우 셀 내부를 세척합니다.다음으로, 조직지를 이용하여 20 µL의 세포 배양액을 플로우 셀(flow cell)에 흡수시킵니다. 이때 테더링된 세포를 관찰하기 위해 전단된 샘플을 사용하거나, 고정된 세포를 관찰하기 위해 전단되지 않은 샘플을 사용합니다. 플로우 셀을 뒤집어 습도 챔버에 20분 동안 둡니다. 그런 다음 100 µL의 최소 배지를 흡수시켜 결합하지 않은 세포들을 세척합니다. 커버슬립 상단 표면 중앙에 이머전 오일을 한 방울 떨어뜨립니다.플로우 셀을 맞춤 제작된 형광 현미경의 샘플 홀더 위에 조심스럽게 놓습니다. 이렇게 하면 고개구수 대물렌즈와 광학적으로 접촉하게 됩니다. 다음으로, 현미경의 전자 증배 카메라를 켜고 카메라 냉각 온도를 -70 °C로 설정합니다.소프트웨어는 일반적인 프레임 속도인 25 hertz로 이미지를 획득하도록 설정되어 있습니다. 프레임 전송 모드에서 명시야 조명을 켜고 이미지의 초점을 맞춥니다.장축 방향으로 부착된 적절한 세포 또는 세포군을 선택하여 이미징합니다. 커버슬립 표면과 평행하게 초점을 조절하여 커버슬립 표면에 부착된 200 nanometer 라텍스 비즈가 정확히 초점에 맞도록 합니다. 명시야(brightfield)에서 이미지 시퀀스를 획득하여 세포체의 외곽선을 기록합니다.그 후 명시야 조명을 끄고, TIRF(전반사 형광 현미경)를 이용한 이미징을 위해 카메라 게인을 최대로 설정합니다. 카메라 획득을 시작하고 레이저 셔터를 열어 박테리아 내의 형광 단백질을 여기시킵니다. 레이저 강도와 획득 속도 매개변수는 특정 생물학적 시스템에 맞게 최적화해야 합니다.연구 대상 시료는 광퇴색이 일어날 때까지 조명하며, 이는 보통 약 10초 정도 소요됩니다. 데이터 수집이 완료되면, 이미지는 자체 제작한 분석 프로그램으로 전송되며, 이 프로그램은 세포 내 형광 점들의 위치를 수 나노미터 정밀도로 자동 검출하고 그 크기와 밝기를 추출합니다. 시간 경과에 따른 attract 분자 복합체의 광퇴색 추적 곡선의 밝기를 이용하여 화학 양론적 비율을 추정합니다.이 방법을 사용하면 명시야(brightfield)에서 관찰되는 세포 이미지가 매우 뚜렷하며, 고정된 세포의 형광 이미지를 통해 흰색 또는 회색의 세포체 대비 세포체의 테두리가 어둡게 나타납니다. 일반적으로 너비가 250에서 300 nanometers인 뚜렷한 강도 지점들이 여기서는 가색(false color)으로 표시되어 보입니다. 형광 여기 상태의 명시야 이미지에서는 건강하게 결합된(tethered) 세포들이 결합 지점을 중심으로 회전하는 것을 확인할 수 있습니다.일부 분자 복합체가 부착 지점에서 관찰될 수 있으며, 이는 tanked 단백질이 Geller 모터와 함께 국소화되었음을 나타냅니다. 이러한 반점들은 개별 분자 복합체입니다. 관찰되는 복합체의 수는 사용된 조명 모드와 어느 한 시점에 세포 내에 실제로 존재하는 복합체의 수에 따라 달라집니다.본 실험에서 사용된 표지된 시토크롬(cytochrome)의 경우처럼 초기 반점 밀도가 매우 높다면, 초기 FRAP 표백을 수행하여 이미징 대비를 높일 수 있습니다. 반점의 이동성은 연구 대상인 특정 생물학적 시스템에 따라 달라집니다. 지금까지 첨단 형광 현미경을 사용하여 단일 분자 복합체를 시각화하는 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때, 편모 모터의 기능이 손상될 수 있으므로 세포에 전단력이 가해지지 않도록 하는 것이 중요합니다. 또한, 세포가 산소 부족 상태가 될 수 있으므로 현미경 슬라이드 위에 1시간 이상 방치하지 않는 것이 중요합니다. 최적의 이미징 조건을 찾기 위해서는 자동화가 필요합니다.사용 중인 현미경 시스템에 적합한 레이저 출력을 확인하기 위해 정제된 GFP만을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이것으로 모두 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 메서드는 이전 가벼운 현미경 검사 법 (LM)에 의해 선택 된 셀에 전자 현미경 (EM)를 통해 바이러스-유도 된 세포내 구조 이미지에 적용 됩니다. LM 및 EM 바이러스-호스트 상호 작용의 통합된 보기를 달성 하기 위해 하이브리드 이미징 접근으로 결합 됩니다.

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

우리는 mScarlet이라는 형광 단백질을 사용하여 Epon post-embedding correlative light and electron microscopy에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 형광과 미세구조를 동시에 유지할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 생물학적 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

이 프로토콜은 상관광과 전자 현미경을 사용하여 각각 mEosEM 및 APEX2로 표지된 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 시각화하는 메커니즘을 설명합니다.

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interaction between Mitochondria and Lysosomes (미토콘드리아와 리소좀) 사이의 상호작용 시각화를 위한 Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy

학습하세요 생활세포에서 단일분자 형광현미경법을 이용하여 기능적 분자복합체를 검출하고 추적 및 정량화하는 방법을. 이 프로토콜은 세균세포에서 분자역학을 실시간으로 연구하는 데 활용됩니다.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

더 많은 동영상 탐색