Name: 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 학습하세요 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 이용하여 기질 경직성이 Listeria monocytogenes에 의한 HMEC-1 세포 감염에 미치는 영향을 정량적으로 분석하는 방법입니다. 이 기법은 기계생물학 및 숙주-병원체 상호작용 연구에 활용됩니다.

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M. 우리의 감사 합니다 바닥글, R. Lamason, M. Rengaranjan, 및 그들의 토론 및 실험적인 지원에 대 한 Theriot 연구소의 멤버. 이 작품은 고급 연구 (F.E.O.)에 스탠포드 대학원 친교 (F.E.O.), 및 미국 심장 협회 (E.E.B.)에 대 한 NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI 길 리엄 친목에 의해 지원 되었다. Cytometry는 스탠포드 공유 FACS 시설에서 수행 되었다.

저자는 공개 없다.

세포는 다양 한 세포의 형태 뿐만 아니라 그들의 유전자 표현과 단백질 활동, 따라서 영향을 미치는 중요 한 세포 기능 및 동작45,46에 영향을 미칠 수 있는 물리적 환경 신호를 느낄 수 있다. 셀의 ECM의 강성은 점점 세포 운동 성, 차별화, 확산, 그리고 궁극적으로 세포 운명47,,4849의 중요 한 변조기로 평가 됩니다. 비록 많은 최근 발전 셀과 그들의 ECM 간의 복잡 한 biomechanical 상호 작용 이해에 왔다, 거의 어떻게 환경 강성에 대 한 세균 감염에 세포의 민감성에 영향을 하는 것이 알려져 있습니다. 이러한 연구를 촉진 하기 위하여 우리는이 소설 다 잘 분석 결과 감염 분석50와 호환 되는 가변 강성의 polyacrylamide hydrogels의 기초가 튼튼한 제조에 따라 개발. 전통적으로, 조직 문화에 있는 세포의 세균성 감염 유리 또는 폴리스 티 렌 표면에 약 1-3 배나 가장 부착 세포8,51의 자연 ECM 보다 엄격한 공부 되었습니다 했다. 여기서 설명 하는 분석 결과 순수 관련 환경 강성 정권에서 박테리아-호스트 상호 작용의 연구를 활성화 하 여 새로운 고속도로 엽니다.
분석 결과 제시의 개념 증명에 대 한 HMEC-1 셀 모델 부착 호스트 세포와 Lm 모델 세균성 병원 체로 선택 되었다. 그러나, 적절 하 게 수정 하는 경우 분석 결과 추가 연구에 대 한 확장할 수 있습니다. 이러한 연구는 박테리아와 바이러스를 포함 하 여 다른 병원 균에 의해 다른 포유류 부착 호스트 세포 유형의 감염을 포함할 수 있다. 이 특정 분석 결과 대 한 젤은 단백질 코팅 콜라겐, 하지만 호스트 세포 유형에 따라 laminin 등 fibronectin, 다른 ECM 단백질-코팅는 하이드로 겔에 대 한 관심의 호스트 세포의 부착을 용이 하 게 사용 하는 52. 호스트 셀 형식에 따라 추가 고려 공부 하이드로 겔 강성 범위입니다. 경직성의 범위는 특정 호스트 셀 형식에 대 한 순수와 관련 되 고 얼마나 잘 그 호스트 첨부 주어진된 강성 히드로. 에 단층을 형성에 의존 해야 마찬가지로, 검사를 원하는 모델 병원 체에 따라 약간의 수정 여기에 설명 된 감염 분석 결과에 구현 해야 할 수 있습니다.
제조 polyacrylamide hydrogels24,,5053 특정 독특한 기능에서 속 인 다에 대 한 이전 방법에 비교 하 여 분석 결과의 혁신 제안된 감염 분석 결과에 통합. 먼저,는 hydrogels 특정 절차의 자동화 뿐 아니라 동시에 여러 조건의 심사를 가능 하 게 다 잘 유리 하단 접시에 만들어집니다. 자주 변경 동시 또는 이러한 접근의 결과 박테리아 감염 호스트에 추가의 정확한 수 호스트 셀 통로 같은 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다 이후 여러 복제는 중요 한 검토에서 여러 조건을 모니터링, 사이 독립 실험. 이 분석 결과의 추가 독특한 기능이입니다는 hydrogels 약 40 µ m, 높이 기존의 현미경을 사용 하 여 이미지를 충분히 얇은. 우리는 우리가 수 성공적으로 수행 하는 라이브 셀 현미경 셀 고정, 그리고 immunostaining 없이 높은 배경 형광 이미징, 다음 것을 보였다. 마지막으로,는 hydrogels 형광 microbeads, 단일 초점 평면에 포함 된 데 위쪽으로 두 개의 레이어로 만들어집니다. 이 특성은 이미징 동안 방해 밖으로의 초점 빛 있을 것입니다 보장 합니다. 구슬의 존재는 균일 하 고 TFM 및 MSM24,,3241의 성능을 향상 하 젤의 표면 지형 모두 시험을 수 있습니다. TFM 및 MSM, 셀 강성 행렬을 변화에 있는 각각의 세포-ECM 및 셀 힘을 계산 가능 하다. 이 새로운 분석 결과 사용 하 여, 그것은 모두 기여 환경 강성 및 감염을 동시에 비교 하 여 물리적 힘의 그런 측정을 만들 수 있습니다. 이러한 접근 방식은, 다음 효과 감염 역학 그것의 과정을 통해 결정 될 수 있다 주인 세포에 있다. 또한, 세포의 세포내 스트레스의 진화는 MSM을 사용 하 여 산출 될 수 있다 고는 단층의 방 벽 완전성의 측정으로 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 분석 결과의 멀티 잘 성격을 감안할 때, 동시에 세균 감염, 호스트 세포 역학과 감염 사이 복잡 한 상호 작용을 더 깊이 조사와 약리학 및 유전자 섭 소개 가능 하다.
기술의 고유한 제한 효과 기판 강성에 있다 하나 세포의 확산 속도에 할 수도 있습니다. 일반적으로, 감염 분석에서 우리가 다른 조건 하에서 호스트 세포 밀도 동일 확인 해야 합니다. 그건 셀 밀도 자체 호스트 감염의 민감성에 영향을 미칠 수 있기 때문에. 호스트 셀으로 사용 된 HMEC-1 세포는 hydrogels에 24 h에 대 한 시드 때 그들의 수에 큰 차이가 표시 되지 않습니다. 그러나, 다른 세포 유형 감염 연구 편견 수 있는 하이드로 겔 강성에 따라 차동 확산을 전시 수 있습니다. 마찬가지로, 감염 바이어스 셀 monolayers를 형성 하지 않는다 또는 hydrogels, 특정 세포 유형 (예를들면, 인간 탯 줄 내 피 세포 또는 Madin-다 비 개 신장 매우 부드러운 행렬에 시드는 때 발생에 첨부 하지 않습니다 때 발생할 수 있습니다. 상피 세포 시드 0.6-kPa hydrogels54,55에). 병원 균을 걱정 하는 만큼 특정 박테리아 (예를 들어, 보렐 리아 burdgorferi)에 연결할 수 호스트 세포와 그들을 침공 하지만 수 있습니다 또한 그들을 통해 transmigrate56. 우리는 아직 테스트 하지 경우이 분석 결과 병원 체 환생 연구 일 것 이다 호 중구 transmigrating PA hydrogels에 시드 내 피 세포에 대 한 이전 연구57성공적으로 작동 하도록 문서화 되었습니다 이후 가능한 것 같다. 연구 실시 polyacrylamide hydrogels 주어진된 탄성 계수의 아크릴 아 미드와 비스 아크릴 아 미드24,25,26의 적절 한 농도 혼합 하 여 제조 하는 방법을 보여 주는 많은 되었습니다. ,27. 그러나, 하나 다양 한 경직의 hydrogels에 세포에 TFM 실험을 수행 하고자, 특히 때 그것은 hydrogels AFM 또는 다른 들여쓰기 기법58의 예상된 강성을 확인 하는 중요 한. 예상 값에서 약간의 편차는 다른 용 매 사용 또는 세 아크릴 재고 솔루션을 발생할 수 있습니다 또는 방법 AFM으로 측정 수행 (예를 들어AFM 팁의 모양). 마지막으로, 여기에 소개 하는 접근은 더 현실적이 고 순수 관련 3D 시나리오에 따라 다를 수 있는 2D 매트릭스에 호스트 셀 시드에 기반 하 고 있다. 그러나, 가변 강성과 3D 젤을 제조, 호스트 세포와 그들을 시드 및 병원 체, 그들을 감염 아직도 포함 하는 특정 기술적인 어려움. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 가까운 장래에 우리 수 있을 것입니다 3D 설정에서 감염을 공부에 대 한 현재 분석 결과 확장 하는 예상.
정리해 보면, 예비 결과 함께 설명된 프로토콜이 소설 분석 결과 공부 양적 방식에서 및 훨씬 더에서 병원 성 박테리아 부착 호스트 세포의 감염에 대 한 매우 유용한 도구가 될 수 있다는 증거를 제공 이전 시험 보다 생리 적으로 관련 환경입니다. Polyacrylamide 제안 설정에서 hydrogels 거짓말 분석 결과 여러 기법 cytometry, immunostaining 등의 성능 호환에 날조의 뒤에 가벼운 현미경 검사 법, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법. 분석 결과 다른 부착 호스트 세포 유형의 감염을 포함 하는 연구에 모두 탈피는 병원 체 감염 호스트 전략의 개발 촉진에 큰 영향을 미칠 것입니다 기대 하는 병원 체에 의해 사용할 수 있습니다. 감염에 대 한 치료 적 중재

대부분 동물의 조직에서 세포는 일반적으로 부착 하 고, 이웃 세포와의 세포 외 기질 (ECM) 연결. 그들의 ECM에 세포의 앵커리지 확산 및 생존1,2셀을 셀 운동에서 배열 하는 많은 세포질 과정을 위해 중요 하다. ECM에 세포 앵커리지 ECM 구성과 강성에 따라 달라 집니다. 동적으로 자신의 골격, 차례로 비판적으로 변경할 셀 역학 및 기능3,,45,6 세포-ECM 및 셀 유착을 다시 정렬 하 여 후자에 있는 변화에 응답 하는 셀 . ECM 경직 시간 (즉, 노화), 그리고 pathophysiological 프로세스 (예를 들면, 동맥 경화, 암, 감염, 등) 공간 (즉, 해 부 위치), 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 그것은 널리 그 내 피 세포에 엄격한-부드러운 행렬에 비해 그들의 ECM을 서로 게 증가 된 힘을 발휘 하 고 증가 운동 성 및 확산7,8전시. 마찬가지로, fibroblasts 엄격한 행렬에 있는 그들의 ECM 높은 수축 성 힘을 느 꼈 고 증가 확산, 운동 성, 및 ECM 생산9,,1011. 비록 셀 역학 및 ECM 강성에 대 한 응답 연구 광범위 하 게 다양 한 세포 유형, 부착 호스트 셀 사이의 관계에 대 한 그들의 ECM, 그리고 세균 감염의 강성 여전히 크게 불명 하다.
ECM 강성 박테리아 호스트 세포 상호 작용의 역할을 연구 하기 L. monocytogenes (Lm) 모델 병원으로 선정 되었다. Lm은 다양 한 포유류 호스트에서에서 조직의 감염을 일으킬 수 있는 유비 쿼터 스 음식을 매개로 박테리아 이다. 이 facultative 세포내 병원 체는 혈관 endothelia의 다른 종류를 이동 하 여 먼 장기에 장 상피에서 이동할 수 있습니다. 혈액-뇌 장벽을 위반, Lm 수 막 염, 발생할 수 있습니다 하 고 태 반을 십자가, 그것은 자연 유산12,13발생할 수 있습니다. Lm 종류 다른 호스트를 감염 시킬 수 있습니다 그리고 뚜렷한 병원 성 전략을 사용 하 여 이렇게 수 있습니다. Lm 감염 Lm 감염 시킬 수 있는 방법에 대해 훨씬 덜 알려져 있지만 고 혈관14,,1516의 루멘을 일렬로 세우는 바이패스 내 피 세포 상피 세포의 맥락에서 주로 공부 되었습니다 했다. 또한, 그것은 하지 아직 크게 알려진 내 피 세포가 있는 ECM의 강성이 호스트 세포를 침입 하 고 다음 확산 Lm의 능력을 변조 하는 어떻게. Lm 및 몇 가지 추가적인 세균 종 (즉, 리케차 parkeri) 그들은 둘 다 감염 세포 그들의 세포질에 침략 하 고 촉진 셀 보급17 호스트의 말라 골격의 활용 , 18 , 19. 그들은 그들이 호스트 걸 중 합 경로와 방해 하 고 그들의 앞으로 추진16,20를 용이 하 게 말라 혜성 꼬리를 생산 하는 단백질의 표현을 통해 달성. 감염의 결과로 주인 세포의 말라 골격 특징 아직도 완전히, 잠재적으로 그들은 그들의 ECM에 고 각을 발휘 하는 물리적인 힘을 포함 하 여 호스트 셀의 역학에 영향을 미치는 방식으로 동적으로 다시 정렬할 필요가 다른. 이러한 프로세스 검사, 인간의 microvascular 내 피 세포 (HMEC-1) 선택 되었다 모델 호스트 셀 세 가지 이유: 1. 내 피 세포로 그들은 끊임없이 물리적 신호21; 변화에 노출 되는 mechanosensitive을 높은 것으로 알려져 있습니다 2. Lm 내 피 세포를 감염 시키기 위해 사용 하는 전략은 여전히 크게 알 수 없는22; 그리고 3입니다. HMEC-1는 불멸 하 게 셀 라인 고 수, 그러므로, 쉽게 경작 되며 유전자 조작 대상이.
호스트 세포의 세균성 감염 유리 또는 폴리스 티 렌 기판은 대부분 셀12,,1423의 생리 ECM 보다 훨씬 엄격한 셀 시드 여 공부 생체 외에서 주로 왔다. 누구의 강성은 순수 관련 매트릭스에 시드 세포의 감염을 확인 하 고 세균성 병원 체에 의해 세포의 감염에 ECM 강성의 역할을 명료 하, 우리 따라 얇은 조작에 따라 혁신적인 접근 microbead 임베디드 polyacrylamide hydrogels 다 잘 판에 가변 강성의. 제안 된 방법의 참신은 그는 다 잘 포맷으로 동시에 여러 조건을 모니터링 수 호환 기판에 내장 되어 특정 방법에의 한 여러 기술에 있습니다. HMEC-1 세포에이 단백질 코팅 hydrogels 시드 되었고 감염 되 고 국제화에 따라 형광 또는 constitutively 형광은 다른 Lm 긴장 된. 호스트 HMEC-1 세포의 감염 민감성에 ECM 강성 역할 cytometry에 의해 평가 되었다. 또한, immunostaining 및 형광 현미경 고집 하 고 내 면 박테리아를 사용 되었다. 마지막으로, 견인 힘 현미경 검사 법 (TFM) 감염 동안 그들의 행렬에 호스트 내 피 세포 발휘 견인 스트레스에 Lm 감염의 영향을 특성을 성공적으로 수행 되었다. 제시 분석 결과 다른 세포 또는 병원 체를 사용 하 여 부착 세포의 감염 민감성에 ECM 경직성의 영향에 대 한 연구를 더 사용 하도록 쉽게 수정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide 펠릿</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Sigma</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>25% 글루알데히드</td><td>Sigma</td><td>G6257-100ML</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드</td><td>Sigma</td><td>A4058-100ML</td><td></td></tr><tr><td>비스-아크릴아미드 용액(2%w/v)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP1404-250</td><td></td></tr><tr><td>형광구 카르복실레이트 변형 미세구, 0.1 &mu; m, 황록색 형광등 (505/515)</td> <td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>피셔</td><td>BP17925</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Proteochem</td><td>c1111-100mg</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐, 쥐 Sigma</td><td></td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>J.T. Baker</td>의 솔루션<td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 유리 산</td><td>J.T. Baker</td><td>4018-04</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz의 L-15 매체, 페놀 레드</td><td>Thermofischer</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 매체, 글루타민 없음</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td></td></tr><tr><td>Foundation Fetal Bovine Serum, Lot : A37C48A</td><td>Gemini Bio-Prod</td><td>900108 500ml</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자, EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200mM</td><td>피셔</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>피셔</td><td>SH30028FS</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 설페이트</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>194530</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>시그마</td><td>C0378-5G</td><td></td></tr><tr><td>DifcoTM 한천, 과립</td><td>BD</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>BBL TM 뇌-심장 주입</td><td>BD</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, 트리하이드로클로라이드, 트리하이드레이트 - 물 내 10mg/ul 용액</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 16% EM 등급</td><td>전자 현미경</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>안티 리스테리아 모노사이토제네스 항체</td><td>Abcam</td><td>ab35132</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-토끼 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor&reg; 546 공액</td><td>Thermofischer</td><td>A-11035</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA, 페놀 레드</td><td>Thermofischer</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>클로스트리듐 조직분해</td><td>시그마</td><td>C8051</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>3810-74-0</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>Calbiochem</td><td>8510</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산</td><td>나트륨Thermofischer</td><td>28364</td><td></td></tr><tr><td>MES 분말</td><td>Sigma</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>J.T. Baker</td><td>2444-1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>40991</td><td></td></tr><tr><td>Disposable lab equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm 원형 유리 커버슬립</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-81</td><td>No. 1.5 커버슬립 | 10mm 유리 직경 | 코팅되지 않은</td></tr><tr><td>유리 바닥 24 웰 플레이트</td><td>Mattek</td><td>P24G-1.5-13-F</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 폴리스티렌 튜브 35 &mu; M 셀 스트레이너 캡&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>T-25 플라스크</td><td>Falcon</td><td>353118</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>일회용 혈청 피펫 (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)</td> <td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 유리 피펫</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 (1-200 &mu; 엘, 101-1000 &mu; l)</td> <td>Denville</td><td>P1122, P1126</td><td></td></tr><tr><td>파우더 프리 검사 장갑</td><td>Microflex</td><td>XC-310</td><td></td></tr><tr><td>큐벳 박테리아</td><td>Sarstedt</td><td>67.746</td><td></td></tr><tr><td>면도기</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>주사기 바늘</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>0.2um 살균 병</td><td>Thermo Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 주사기</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>0.2um 필터</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>나무 막대기</td><td>Grainger</td><td>42181501</td><td></td></tr><tr><td>Saran 랩</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-3687</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 박테리아</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Large/Non-disposable lab equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 후드</td><td>Baker</td><td>SG504</td><td></td></tr><tr><td>Hemacyometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>IGS180</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 Incubator</td><td>NuAire</td><td>NU-8700</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>NIKON-DIAPHOT-200</td><td></td></tr><tr><td>케이지 인큐베이터</td><td>Haison</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Scanford FACScan 분석기&nbsp;</td><td>Stanford와 Cytek은 FACScan</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>피펫 보조 장치</td><td>Drummond</td><td>4-000-110</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors (10 &mu; 엘, 200 &mu; </td><td>Gilson</td><td>F144802, F123601, F123602</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>1 L 플라스크</td><td>Fisherbrand</td><td>FB5011000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 기계</td><td>Amsco</td><td>3021</td><td></td></tr><tr><td>교반 자석 플레이트</td><td>Bellco</td><td>7760-06000</td><td></td></tr><tr><td>자석 교반 막대</td><td>Bellco</td><td>1975-00100</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Beckman</td><td>DU 640</td><td></td></tr><tr><td>Scanford FACScan 분석기</td><td>Cytek Biosciences</td><td>맞춤형 Stanford 및 Cytek 업그레이드 FACScan</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope 소프트웨어 (&mu; Manager)</td><td>Open Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Matlab Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 이미지 분석 소프트웨어, CellC</td><td>https://sites.google.com/site/cellcsoftware/</td><td></td> <td>이 소프트웨어는 무료로 사용할 수 있습니다. 실행 파일 및 MATLAB 소스 코드는 https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ 에서 얻을 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석

A Multi-well Format Polyacrylamide-based Assay for Studying the Effect of Extracellular Matrix Stiffness on the Bacterial Infection of Adherent Cells

세포 외 기질 강성 일반적 기능, 세포질 행동과 운명에 영향을 잘 알려진 여러 환경 기계 자극 중 구성 되어 있습니다. 하지만 점점 더 많은 부착 세포 유형 응답 매트릭스 강성, 성격 어떻게 세포의 민감성 세균 감염에 매트릭스 강성에 따라 점착으로 크게 알려진 이다 세균성 감염의 효과에 호스트 세포의 역학입니다. 우리는 세균 감염을 호스트 내 피 세포의 민감성이이 세포 상주 하는 매트릭스의 강성에 따라 달라 집니다 그리고 그들의 역학 변경 됩니다 호스트의 감염 박테리아와 세포 가설. 이러한 두 가지 가설을 테스트 하기 위해 내 피 세포 모델 병원 체로 모델 호스트 및 Listeria monocytogenes 로 사용 되었다. 소설 다 잘 포맷 분석 결과 개발 하 여 우리는 L. monocytogenes 여 내 피 세포의 감염에 매트릭스 강성 효과 양적 cytometry 및 immunostaining 뒤에 현미경 검사 법을 통해 평가 될 수 있다 다는 것을 보여줍니다. 또한, 견인 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 호스트 내 피 세포 역학에 L. monocytogenes 감염의 효과 수 공부 될. 셀, 그들의 기질 간의 biomechanical 상호 이해를 향한 중요 한 단계는 부착 세포의 세균성 감염에 조직 관련 역학의 영향의 분석에 대 한 수 있습니다 제안된 된 방법 및 병원 성 박테리아입니다. 이 메서드는 또한 다양 한 다른 유형의 세포 역학 및 기판 강성에 대 한 응답에 대 한 연구에 적용 가능한 각 실험에 동시에 많은 복제를 수행할 수 있어야 하는 것이 중요 이죠.

ECM 강성 종속 민감성 HMEC-1 셀의 Lm 감염: 다양 한 경직의 PA hydrogels, 모든 표면 코팅 콜라겐과 나, 프로토콜의 1 단계 에 설명 된 대로 다 잘 유리 하단 플레이트에 건설 되었다 ( 그림 1참조). AFM 측정26,27 위에서 설명한 대로 hydrogels의 정확한 강성을 확인 수행 했다 ( 그림 2참조). 과거 연구는 내 피 세포의 지하실 멤브레인의 로컬 준수 범위 1 kPa (예를 들어, 뇌 조직)에서 70 kPa (예, 대동맥)36,,3738, 39 , 40. 따라서, 우리는 HMEC-1 세포와 다음 강성 행렬에의 감염을 테스트 하기로: 0.6 kPa, 3 kPa, 20 kPa, 및 70 kPa. 각 하이드로 겔 강성에 대 한 6 hydrogels 결과의 재현성을 평가 하기 위해 조작 했다.
Cytometry ECM 강성 종속의 자화 율 HMEC-1 셀 Lm 감염을 평가 하는 데 사용 되었다 ( 그림 3참조). HMEC-1 세포는 세포내 박테리아만 (참조 그림 1 L - 1N)의 탐지를 허용 국제화 (actAp::mTagRFP), 후 형광 마커를 표현 하는 Lm 스트레인 (JAT985) 감염 되었습니다. JAT985는 또한 ActA를, ActA 말라 혜성 꼬리와 연속적인 세균성 보급의 형성에 필요한 이므로 셀을 확산 박테리아 억제를 결여 된다. 7-감염 된 후 8 h, HMEC-1 세포의 감염 cytometry 사용 하 여 평가 했다. 단일 셀의 분석을 위해, 셀 카운트의 분포의 대량 측 점도 대 앞으로 사용 하 여 문이 했다 고 두 번째 제어 단계 autofluorescence를 전시 하는 셀을 제외 하 수행한 다음 ( 그림 3A - 3 C 참조 ). 예비 결과 그림 3 에 표시 된 표시 HMEC-1 감염 Lm는 약 두 배 HMEC-1 셀 소프트 0.6 kPa hydrogels에 있는 세포에 비해 뻣 뻣 한 70 kPa hydrogels에 있는 더 큰 (참조 그림 3B - 3D). 부드러운 행렬에 비해 뻣 뻣 한에 HMEC-1 세포의 증가 Lm 감염 민감성으로 인해 수: 1. HMEC-1;에 Lm 접착 증가 2. 증가 된 Lm 침공 HMEC-1; 또는 3입니다. 모두 위의 공동 발생입니다. 테스트는 가설 보유, HMEC-1 셀 소프트 (3 kPa)에 뻣 뻣 한 (70 kPa) hydrogels 시드 되었고 감염 constitutively GFP Lm 표현 된 ( 그림 4A - 4 C참조). 감염 직후 샘플 고정 하 고 외부 (접착) 박테리아 항 체로 얼룩진 했다. 양적 현미경을 사용 하 여, 우리는 호스트 셀 (참조 그림 4D) 소프트 젤에 비해 뻣 뻣 한에 있는 때 HMEC-1을 준수 하는 훨씬 더 많은 박테리아는 발견. 교류 cytometry 데이터와 일치, 거기는 훨씬 더 많은 세균 때 호스트 세포 ( 그림 4E참조) 소프트 젤에 비해 뻣 뻣 한에 있는 HMEC-1 내 면. 그러나, HMEC-1 셀에 Lm의 침공 효율성 (박테리아의 박테리아 내 면/총 수)은 기판 강성에 관계 없이 비슷한 (참조 그림 4F).
HMEC-1 Lm에 감염 된 세포의 견인 힘 현미경: HMEC-1 세포의 Lm 감염 첨부 파일 그들의 ECM 또는 서로 게 그들의 방 벽 완전성에 영향을 미치는의 강도 포함 하 여 감염 된 호스트 셀의 역학을 변경할 수 있습니다. 우리 세포-ECM 견인 힘 및 단층 스트레스 현미경41 세포내 긴장 힘을 계산 하기 위해 계산을 견인 힘 현미경32 를 사용 하 여 경우 될 수 있는 여부를 평가 하고자 했다. 그림 5 는 변형 필드, 견인 스트레스 필드, 및 HMEC-1에 감염 된 후 다른 시간 포인트에서 20 kPa hydrogels 세포의 세포내 긴장 분야의 지도 묘사 한다. 그림 5A - 5 D 그림 5E 동안 감염된 제어 HMEC-1 셀 참조- 5 H 300 박테리아/셀 크거나 감염의 다양성에서 Lm 감염 HMEC-1 셀 참조. 이 예비 작업 반면 그 감염 되지 않은 컨트롤 셀에 대 한 관찰 하지 감염된 HMEC-1 셀 Lm, 감염의 과정에서 그들의 세포-ECM 및 세포내 스트레스의 크기를 줄이기 위해 제안 합니다.
HMEC-1 monolayers에 걸쳐 ECM 강성 종속 Lm 보급: 시간 경과 현미경 효과 조사 하는 데 사용 되었다 HMEC-1 monolayers 통해 Lm 보급에 매트릭스 강성. Lm는 단층을 통해 확산, 박테리아 감염 (참조 그림 6A 및 비디오 그림 1 과 2) 시간의 기능으로 성장의 초점을 만들. 감염 초점 영역 볼록 선체, 작은 볼록 다각형 박테리아42주위 점의 집합을 포함 하 여 측정 했다. 호스트 세포의 단층을 통해 L. monocytogenes 세포-세포의 효율성을 측정 하는 필드에는 아무 표준 통계가입니다. 확산 효율 평가, 일부는 감염 초점41, 호스트 세포의 수를 계산 했습니다 그리고 다른 사람이 수동으로 감염 호스트 세포43의 그룹 주위에 그려진된 경계. 우리는 박테리아, 주위 볼록 다각형을 그리는 L. monocytogenes 확산의 효율성을 측정 하는 자동화 된, 일관성, 그리고 계산 저렴 한 과정 이기 때문에 선택 했습니다. 이렇게 함으로써, 우리는 70 kPa hydrogels 3 kPa 매트릭스 ( 그림 6B 및 비디오 그림 1 및 2참조)에 씨앗을 품고 그에 비해에 시드 HMEC-1 셀에 감염 초점 영역에서 약간의 감소를 발견. 감염 초점의 성장의 속도 확인 하려면 방사형 거리 감염 초점 영역의 제곱근 pi를 나눈이 여 시간의 기능으로 구성 했다. 이 수학적 변환 감염 초점의 모양을 대략 원형44가정 합니다. 초점 성장 속도 측정 하 두 3-70 kPa 행렬에 대 한 방사형 거리의 변화 (즉, 기울기)의 속도 측정 했다. 이 방법은 감염 초점 성장 3-kPa 행렬에 시드 HMEC-1 셀에 신속 하 고 단순하게는 해명. 그러나, 초점에서에서 성장 했다 상당히 느린 (첫 200 분)와 약간 느린 (200 ~ 600 분) 70 kPa 매트릭스 ( 그림 6C참조)에 시드 셀. 추가 데이터의 분석 그 감염 초점 성장, 평균, 2 배 느리게 70 kPa 행렬에 특히 첫 번째 200 분 동안 확인 하는 사실, ( 그림 6D참조).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57361/57361fig3.jpg"> 그림 3 : Lm 침공에 HMEC-1 셀의 ECM 강성 종속 민감성 cytometry 사용 하 여 측정 .  HMEC-1 셀 Lm (JAT985)에 감염 되었다 하 고 감염 cytometry에 의해 분석 되었다. A.이 패널 하나의 우물에서 오는 대표 HMEC-1 셀에 대 한 앞으로 점도 대 측면을 보여줍니다. 셀의 대량 배포 파편 (왼쪽)를 제외 하 고 세포 남자 또는 세 쌍둥이 (오른쪽) 게이팅을 통해 선정 됐다. B.이 그래프로 Lm 형광 강렬의 로그의 히스토그램 셀 당 HMEC-1 도금 부드러운 0.6 인민군에 대 한. C.이 그래프로 Lm 형광 강렬의 로그의 히스토그램 셀 당 HMEC-1 뻣 뻣 한 70 kPa hydrogels에 도금. N에 대 한 히스토그램 = 4-6 복제는 서로 다른 색상으로 표시 됩니다. 제어 감염 되지 않은 세포의 히스토그램은 보라색입니다. 어떤 감염을 정의 하는 데 사용 하는 게이트는 빨간색으로 표시 됩니다. 나는 100 이며 감염 된 감염 된 후 평가 8 h. D. 데이터 표시 하이드로 겔 강성 대 HMEC-1 세포 감염된의 비율 (N = 5). 가로 막대가 데이터의 평균을 묘사. P-값 계산 비패라메트릭 Wilcoxon 순위 합계 테스트와 함께. <a href="/files/ftp_upload/57361/57361fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video Figure 1" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov1.jpg"> 비디오 그림 1: HMEC-1 셀 단층 (단계)를 통해 세포내 Lm (빨강 채널)의 보급 3-kPa 기판에 시드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_1.mov" target="_blank"></a><img alt="Video Figure 2" src="/files/ftp_upload/57361/57361mov2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Video_Figure_2.mov" target="_blank"></a><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="Supplemental Material" src="/files/ftp_upload/57361/57361supfig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57361/Supplemental_Material_1.docx" target="_blank"></a>

우리는 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석 결과 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향 조사에 대 한 개발 했습니다. 이 분석 결과 cytometry, immunostaining, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법, 양적 측정 셀, 그들의 기질, 및 병원 성 박테리아 사이 biomechanical 상호 작용의 수와 호환 됩니다.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

Extracellular matrix stiffness comprises one of the multiple environmental mechanical stimuli that are well known to influence cellular behavior, ...

이 방법론의 전반적인 목표는 부착 세포의 박테리아 감염에 대한 세포 외 기질 경직의 효과를 매우 정량적인 방식으로 특성화할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 숙주 세포의 박테리아 감염 감수성을 조절하는 데 기계적 힘의 역할은 무엇인지와 같은 숙주-병원체 생체 역학의 새로운 분야에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 고해상도 타임랩스 비디오 시퀀스를 생성하는 동시에 여러 조건을 스크리닝하고 특정 절차를 자동화하는 데 도움이 됩니다.24웰 접시의 유리 활성화를 수행하려면 직경 13mm 웰당 500마이크로리터의 투말로 수산화나트륨을 추가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 수산화나트륨을 버리고 초순수를 사용하여 우물을 한 번 헹굽니다. 그런 다음 95% 에탄올에 2% 트리에톡시실란 500마이크로리터를 각 웰에 넣고 5분 동안 배양합니다.물로 우물을 한 번 헹굽니다. 그런 다음 각 웰에 500마이크로리터의 0.5%글루타르알데히드를 추가하고 플레이트를 30분 동안 배양합니다. 물로 한 번 헹군 후 뚜껑을 열고 접시를 섭씨 60도에서 건조시킵니다.강성을 조정할 수 있는 하이드로겔을 제조하려면 원하는 하이드로겔의 강성에 따라 40%의 스톡 아크릴아미드 용액 3-10%와 2%의 비스-아크릴아미드 용액 06-6%를 포함하는 수용액을 준비합니다. 그런 다음 물을 넣으십시오. 각 강성에 대해 Solution 1은 비드가 없는 반면, Solution 2에는 03%0.1마이크로미터 형광 마이크로비드가 포함되어 있습니다.용액 1과 2를 15분 동안 진공으로 탈기하여 중합을 억제하는 산소를 제거합니다. 그런 다음 신속하게 행동하면서 0.43%TEMED와 0.6%의 밀리리터당 10g 스톡 APS 솔루션을 Solution One에 추가합니다. 3.6 마이크로 리터의 용액을 24 웰 접시의 각 웰 중앙에 추가합니다.즉시 12mm 원형 커버 슬립을 사용하여 웰을 덮고 용액이 완전히 중합되도록 20분 동안 그대로 두십시오. 주사기 바늘을 딱딱한 표면에 부드럽게 두드려 커버 슬립을 쉽게 제거할 수 있도록 끝에 작은 고리를 만든 다음 바늘을 사용하여 커버 슬립을 들어 올립니다. 다음으로, 0.43%TEMED와 0.6%의 10g/밀리리터 스톡 APS 솔루션을 솔루션 2에 추가합니다.그런 다음 2.4mm 원형 커버 슬립 위에 12마이크로리터의 혼합물을 넣습니다. 첫 번째 폴리아크릴아미드 층 위에 용액 2 한 방울과 함께 원형 커버 슬립을 놓고 집게를 사용하여 두 번째 층의 두께가 최소화되도록 부드럽게 아래로 누릅니다. 그런 다음 용액 2를 20분 동안 중합시킵니다.각 웰에 500 밀리 몰 HEPES pH 7.5의 500 마이크로 리터를 추가하고 주사기 바늘과 집게를 사용하여 유리 커버 슬립을 제거합니다. 하이드로겔을 멸균하려면 조직 배양 후드에 넣고 1시간 동안 UV에 노출시킵니다. 이제 Sulfo-SANPAH의 부피 당 0.5 % 중량과 1 % DMSO 및 50 밀리 몰 HEPES pH 7.5의 혼합물을 준비하십시오.200마이크로리터의 용액을 하이드로겔의 상부 표면에 추가합니다. 그런 다음 신속하게 작업하여 302 나노 미터 UV를 10 분 동안 노출시켜 활성화하십시오. 50 밀리몰 HEPES pH 7.5 1 밀리리터를 사용하여 하이드로겔을 두 번 세척하고 필요한 경우 반복하여 과도한 가교 링크를 제거합니다.200마이크로리터의 밀리리터당 0.25밀리그램 쥐꼬리 콜라겐 I과 50밀리몰 헤페스로 하이드로겔을 단백질 코팅합니다. 하이드로겔을 콜라겐과 함께 실온에서 밤새 배양합니다. 관심 세포를 하이드로겔에 파스딩하기 전에 1ml의 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 평형을 이룹니다.인간 미세혈관 내피 세포를 파종하려면 텍스트 프로토콜에 따라 세포 현탁액을 배양하고 준비한 후 하이드로겔에서 배지를 제거한 다음 각 웰에 1ml의 세포 현탁액을 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 L.monocytogenes의 하룻밤 배양을 준비한 후 배양액 1ml를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 실온에서 2, 000회 g에서 4분 동안 스핀다운합니다. 조직 배양 등급 PBS를 사용하여 펠릿을 두 번 세척한 후 1ml의 PBS를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다.숙주 세포당 약 50개 또는 숙주 세포당 10개의 박테리아로 구성된 감염 다중성 또는 MOI를 위해 10 또는 50마이크로리터의 박테리아 현탁액과 1밀리리터의 MCDB 131 전체 배지를 결합하여 감염 혼합물을 준비합니다. 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 하이드로겔 또는 세포를 방해하지 않도록 주의합니다. 1ml의 MCDB 131 full medium을 사용하여 세포를 한 번 세척한 다음 각 웰에 1ml의 박테리아를 추가합니다.접시에 뚜껑을 덮고 누출을 방지하기 위해 폴리에틸렌 식품 랩으로 감쌉니다. 2, 000 시간 g에 내습을 동기화하기 위하여 10 분 동안 격판덮개를 원심 분리하고, 그 후에 30 분 동안 37 섭씨 온도에 배양물을 배양하십시오. MCDB 131 Full Medium을 사용하여 샘플을 4회 세척한 후 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다.추가로 30분 후, 배지를 겐타마이신 밀리리터당 20마이크로그램이 보충된 MCDB 131 전체 배지로 교체합니다. 유세포 분석을 수행하려면 감염 후 8시간 후에 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 조직 배양 PBS를 사용하여 웰을 한 번 세척합니다. PBS를 제거한 후 각 웰에 200마이크로리터의 트립신 EDTA 콜라겐분해효소 혼합물을 추가합니다.접시를 조직 배양 인큐베이터에 10분 동안 넣어 세포가 완전히 분리될 수 있도록 합니다. 각 웰을 8회 부드럽게 피펫팅한 후 200마이크로리터의 전체 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다. 각 웰에서 400마이크로리터의 세포 용액을 35마이크로미터 셀 스트레이너 캡이 있는 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.유세포 분석으로 샘플을 분석합니다. Pa 하이드로겔에 HMEC-1 세포를 파종하고 텍스트 프로토콜에 따라 겐타마이신으로 처리한 후, ActA 프로모터가 켜지고 mTagRFP 개방형 판독 프레임의 발현을 유도할 수 있도록 플레이트를 5시간 동안 배양합니다. 감염 4시간 후, 1밀리리터당 1밀리그램의 Hoechst 염료 1마이크로리터를 1밀리리터의 L-15 풀 배지와 혼합하고 각 웰에 첨가하여 핵을 염색합니다.세포를 10분 동안 배양한 후, 배지를 1밀리리터당 20마이크로그램의 겐타마이신이 보충된 1밀리리터의 L-15 전체 배지로 교체합니다. 자동 초점 기능을 사용하여 5분마다 여러 위치를 이미지화하여 다양한 강성 하이드로겔에 파종된 HMEC-1 단층을 통해 LM 박테리아가 어떻게 확산되는지 모니터링할 수 있습니다. 이 그래프에 보고된 바와 같이, 이 비디오의 프로토콜을 사용하여 준비된 Pa 하이드로겔의 정확한 강성을 확인하기 위해 AFM 측정이 수행되었습니다.여기서, 경직이 다른 매트릭스에 있는 HMEC-1 세포는 내재화 후 형광 마커를 발현하는 LM 균주에 감염되어 세포 내 박테리아만 검출할 수 있습니다. 세포는 forward-versus-side scatter plot을 사용하여 게이트되었고 두 번째 게이팅 단계에서는 자가형광을 나타내는 세포를 제외했습니다. 유세포 분석 분석은 0.6 킬로파스칼 하이드로겔에 비해 경직된 70 킬로파스칼에서 LM 감염이 약 2배 더 큰 것으로 나타났습니다.HMEC-1에 대한 LM 접착력 증가, HMEC-1에 대한 LM 침입 증가 또는 둘 다가 GFP를 구성하는 LM 감염 감염 직후 감염에 대한 감수성 증가의 원인인지 여부를 테스트하기 위해 HMEC-1 세포를 고정하고 부착된 박테리아를 항체로 염색했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 숙주 세포가 뻣뻣한 상태에 있을 때 연질젤에 비해 HMEC-1에 부착하는 박테리아가 훨씬 더 많았습니다. 유세포 분석 데이터와 일치하게, 숙주 세포가 뻣뻣한 상태에 있을 때 HMEC-1에 의해 내부화되는 박테리아가 소프트겔에 비해 훨씬 더 많습니다.일단 마스터되면 이 분석은 중간에 긴 배양 단계가 필요하기 때문에 약 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 하이드로겔과 숙주 세포가 오염되지 않도록 가능한 한 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 원자력 현미경 검사와 같은 다른 방법을 통합하여 감염 시 숙주 세포의 강성이 어떻게 변하는지, 이 효과가 매트릭스 강성에 따라 달라지는지 여부와 같은 질문에 답할 수도 있습니다.개발 후 이 기술은 기계생물학 분야의 연구자들이 상피 세포와 같은 다른 숙주 세포와 Rickettsia parkeri와 같은 다른 박테리아 병원체를 사용하여 숙주 세포 병원체 생체 역학적 상호 작용의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 다중 웰 플레이트에서 조정 가능한 강성의 하이드로겔을 제조하는 방법과 감염 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원성 박테리아와 함께 일하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.따라서 이 절차를 수행하는 동안 진입 장소와 병원체 사이에 장벽을 삽입하고 에어로졸 생성을 방지하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.

a-multi-well-format-polyacrylamide-based-assay-for-studying-effect

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

세포 기능에 substrata의 강성의 효과는 모델...

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

이 비디오는 부착 세포의 박테리아 감염에 대한 세포외 기질(ECM) 강성의 영향을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 콜라겐이 중첩된 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 생리학적 ECM의 강성을 모방하기 위해 멀티웰 플레이트에 층을 이룹니다. 하이드로겔에 인간 내피 세포를 오버레이하고 세포 내 형광 단백질을 발현하도록 조작된 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아로 세포를 감염시킨 후, 유세포 분석을 사용하여 더 단단한 하이드로겔에 존재하는 세포와 더 부드러운 하이드로겔에 존재하는 세포의 내재화된 박테리아를 비교합니다.

세포외 기질 강성이 박테리아 감염에 미치는 영향을 연구하기 위한 분석

이 비디오는 내피 세포를 통한 세포 외 기질 강성 의존성 리스테리아 모노사이토제네스 전파를 평가하기 위한 정량적 타임 랩스 현미경을 보여줍니다. 더 부드러운 하이드로겔은 더 단단한 하이드로겔에 비해 내피 세포를 통한 더 빠른 박테리아 전파를 촉진하며, 이는 박테리아 전파에 대한 매트릭스 강성의 영향을 강조합니다.

세포외 기질 강성에 따른 박테리아 전파를 평가하기 위한 정량적 타임랩스 현미경

종양 미세 환경에서 기계 강성이 invadopodia 활동을 증가시키고 수축력을 액토 마이 오신으로 악성 동작을 운전에 중요한 역할을한다. 사용하는 폴리 아크릴 아미드 겔 (PAAS)는, invadopodia 및 견인력 분석은 강성 매트릭스에 응답하여 암세포의 침윤 및 수축 특성을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

암 세포에 Invadopodia 및 견인 포스 시험 법에 대한 폴리 아크릴 아마이드 젤

여기에서는 멀티웰 플레이트 형식의 폴리아크릴아미드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 준비할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 특수 장비가 필요하지 않으며 모든 연구 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 경직성 의존적 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 특히 유용할 것입니다.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

세포외 기질(ECM) 강성은 세포 행동의 핵심 조절 요인이지만, 근본적인 감지 및 전도 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 이를 해결하기 위해, 세포-ECM 교차 대화에 대한 이해를 진전시키기 위해 강성을 조절할 수 있는 폴리아크릴아마이드 및 실리콘 기반 기판을 생성하는 프로토콜을 제공합니다.

세포 생물학 응용을 위한 명확한 강성을 가진 폴리아크릴아마이드 및 실리콘 세포외기질 기질 생성

감염 과정에서 핵심적인 단계는 호스트 세포로 병원균의 접착합니다. 대부분의 경우에서는이 유착 단계는 액체를 흐르는 의해 생성된 기계적 응력의 존재에 발생합니다. 우리는 세균 유착의 연구에 중요한 매개 변수로 전단 응력을 소개하는 기술을 설명합니다.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

우리는에 의해 중재 세균 경쟁 업체를 모니터 할 수있는 질적 분석을...

T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

이 방법은 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV) 변형 MP-12와 감염 후 숙주 세포의 전사의 변화를 측정하는 클릭 화학의 사용을 설명합니다. 결과는 형광 현미경을 통해 질적 시각 또는 유동 세포 계측법을 통해 정량적으로 얻을 수 있습니다. 이 방법은 다른 바이러스와 함께 사용하기위한 적응이다.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

체외에서 준수의 분석은 세포 단층 상피하는 등 폐렴 구균 식민지를 억제하기위한 프로 바이오 틱의 사용과 같은 잠재적 인 개입을 조사하기 위해 폐렴 구균의 부착을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

학습하세요 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 이용하여 기질 경직성이 Listeria monocytogenes에 의한 HMEC-1 세포 감염에 미치는 영향을 정량적으로 분석하는 방법입니다. 이 기법은 기계생물학 및 숙주-병원체 상호작용 연구에 활용됩니다.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

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