부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

이 방법론의 전반적인 목표는 부착 세포의 박테리아 감염에 대한 세포 외 기질 경직의 효과를 매우 정량적인 방식으로 특성화할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 숙주 세포의 박테리아 감염 감수성을 조절하는 데 기계적 힘의 역할은 무엇인지와 같은 숙주-병원체 생체 역학의 새로운 분야에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 고해상도 타임랩스 비디오 시퀀스를 생성하는 동시에 여러 조건을 스크리닝하고 특정 절차를 자동화하는 데 도움이 됩니다.

24웰 접시의 유리 활성화를 수행하려면 직경 13mm 웰당 500마이크로리터의 투말로 수산화나트륨을 추가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 수산화나트륨을 버리고 초순수를 사용하여 우물을 한 번 헹굽니다. 그런 다음 95% 에탄올에 2% 트리에톡시실란 500마이크로리터를 각 웰에 넣고 5분 동안 배양합니다.

물로 우물을 한 번 헹굽니다. 그런 다음 각 웰에 500마이크로리터의 0.5%글루타르알데히드를 추가하고 플레이트를 30분 동안 배양합니다. 물로 한 번 헹군 후 뚜껑을 열고 접시를 섭씨 60도에서 건조시킵니다.

강성을 조정할 수 있는 하이드로겔을 제조하려면 원하는 하이드로겔의 강성에 따라 40%의 스톡 아크릴아미드 용액 3-10%와 2%의 비스-아크릴아미드 용액 06-6%를 포함하는 수용액을 준비합니다. 그런 다음 물을 넣으십시오. 각 강성에 대해 Solution 1은 비드가 없는 반면, Solution 2에는 03%0.1마이크로미터 형광 마이크로비드가 포함되어 있습니다.

용액 1과 2를 15분 동안 진공으로 탈기하여 중합을 억제하는 산소를 제거합니다. 그런 다음 신속하게 행동하면서 0.43%TEMED와 0.6%의 밀리리터당 10g 스톡 APS 솔루션을 Solution One에 추가합니다. 3.6 마이크로 리터의 용액을 24 웰 접시의 각 웰 중앙에 추가합니다.

즉시 12mm 원형 커버 슬립을 사용하여 웰을 덮고 용액이 완전히 중합되도록 20분 동안 그대로 두십시오. 주사기 바늘을 딱딱한 표면에 부드럽게 두드려 커버 슬립을 쉽게 제거할 수 있도록 끝에 작은 고리를 만든 다음 바늘을 사용하여 커버 슬립을 들어 올립니다. 다음으로, 0.43%TEMED와 0.6%의 10g/밀리리터 스톡 APS 솔루션을 솔루션 2에 추가합니다.

그런 다음 2.4mm 원형 커버 슬립 위에 12마이크로리터의 혼합물을 넣습니다. 첫 번째 폴리아크릴아미드 층 위에 용액 2 한 방울과 함께 원형 커버 슬립을 놓고 집게를 사용하여 두 번째 층의 두께가 최소화되도록 부드럽게 아래로 누릅니다. 그런 다음 용액 2를 20분 동안 중합시킵니다.

각 웰에 500 밀리 몰 HEPES pH 7.5의 500 마이크로 리터를 추가하고 주사기 바늘과 집게를 사용하여 유리 커버 슬립을 제거합니다. 하이드로겔을 멸균하려면 조직 배양 후드에 넣고 1시간 동안 UV에 노출시킵니다. 이제 Sulfo-SANPAH의 부피 당 0.5 % 중량과 1 % DMSO 및 50 밀리 몰 HEPES pH 7.5의 혼합물을 준비하십시오.

200마이크로리터의 용액을 하이드로겔의 상부 표면에 추가합니다. 그런 다음 신속하게 작업하여 302 나노 미터 UV를 10 분 동안 노출시켜 활성화하십시오. 50 밀리몰 HEPES pH 7.5 1 밀리리터를 사용하여 하이드로겔을 두 번 세척하고 필요한 경우 반복하여 과도한 가교 링크를 제거합니다.

200마이크로리터의 밀리리터당 0.25밀리그램 쥐꼬리 콜라겐 I과 50밀리몰 헤페스로 하이드로겔을 단백질 코팅합니다. 하이드로겔을 콜라겐과 함께 실온에서 밤새 배양합니다. 관심 세포를 하이드로겔에 파스딩하기 전에 1ml의 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 평형을 이룹니다.

인간 미세혈관 내피 세포를 파종하려면 텍스트 프로토콜에 따라 세포 현탁액을 배양하고 준비한 후 하이드로겔에서 배지를 제거한 다음 각 웰에 1ml의 세포 현탁액을 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 L.monocytogenes의 하룻밤 배양을 준비한 후 배양액 1ml를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 실온에서 2, 000회 g에서 4분 동안 스핀다운합니다. 조직 배양 등급 PBS를 사용하여 펠릿을 두 번 세척한 후 1ml의 PBS를 사용하여 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

숙주 세포당 약 50개 또는 숙주 세포당 10개의 박테리아로 구성된 감염 다중성 또는 MOI를 위해 10 또는 50마이크로리터의 박테리아 현탁액과 1밀리리터의 MCDB 131 전체 배지를 결합하여 감염 혼합물을 준비합니다. 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 하이드로겔 또는 세포를 방해하지 않도록 주의합니다. 1ml의 MCDB 131 full medium을 사용하여 세포를 한 번 세척한 다음 각 웰에 1ml의 박테리아를 추가합니다.

접시에 뚜껑을 덮고 누출을 방지하기 위해 폴리에틸렌 식품 랩으로 감쌉니다. 2, 000 시간 g에 내습을 동기화하기 위하여 10 분 동안 격판덮개를 원심 분리하고, 그 후에 30 분 동안 37 섭씨 온도에 배양물을 배양하십시오. MCDB 131 Full Medium을 사용하여 샘플을 4회 세척한 후 조직 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다.

추가로 30분 후, 배지를 겐타마이신 밀리리터당 20마이크로그램이 보충된 MCDB 131 전체 배지로 교체합니다. 유세포 분석을 수행하려면 감염 후 8시간 후에 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 조직 배양 PBS를 사용하여 웰을 한 번 세척합니다. PBS를 제거한 후 각 웰에 200마이크로리터의 트립신 EDTA 콜라겐분해효소 혼합물을 추가합니다.

접시를 조직 배양 인큐베이터에 10분 동안 넣어 세포가 완전히 분리될 수 있도록 합니다. 각 웰을 8회 부드럽게 피펫팅한 후 200마이크로리터의 전체 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다. 각 웰에서 400마이크로리터의 세포 용액을 35마이크로미터 셀 스트레이너 캡이 있는 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.

유세포 분석으로 샘플을 분석합니다. Pa 하이드로겔에 HMEC-1 세포를 파종하고 텍스트 프로토콜에 따라 겐타마이신으로 처리한 후, ActA 프로모터가 켜지고 mTagRFP 개방형 판독 프레임의 발현을 유도할 수 있도록 플레이트를 5시간 동안 배양합니다. 감염 4시간 후, 1밀리리터당 1밀리그램의 Hoechst 염료 1마이크로리터를 1밀리리터의 L-15 풀 배지와 혼합하고 각 웰에 첨가하여 핵을 염색합니다.

세포를 10분 동안 배양한 후, 배지를 1밀리리터당 20마이크로그램의 겐타마이신이 보충된 1밀리리터의 L-15 전체 배지로 교체합니다. 자동 초점 기능을 사용하여 5분마다 여러 위치를 이미지화하여 다양한 강성 하이드로겔에 파종된 HMEC-1 단층을 통해 LM 박테리아가 어떻게 확산되는지 모니터링할 수 있습니다. 이 그래프에 보고된 바와 같이, 이 비디오의 프로토콜을 사용하여 준비된 Pa 하이드로겔의 정확한 강성을 확인하기 위해 AFM 측정이 수행되었습니다.

여기서, 경직이 다른 매트릭스에 있는 HMEC-1 세포는 내재화 후 형광 마커를 발현하는 LM 균주에 감염되어 세포 내 박테리아만 검출할 수 있습니다. 세포는 forward-versus-side scatter plot을 사용하여 게이트되었고 두 번째 게이팅 단계에서는 자가형광을 나타내는 세포를 제외했습니다. 유세포 분석 분석은 0.6 킬로파스칼 하이드로겔에 비해 경직된 70 킬로파스칼에서 LM 감염이 약 2배 더 큰 것으로 나타났습니다.

HMEC-1에 대한 LM 접착력 증가, HMEC-1에 대한 LM 침입 증가 또는 둘 다가 GFP를 구성하는 LM 감염 감염 직후 감염에 대한 감수성 증가의 원인인지 여부를 테스트하기 위해 HMEC-1 세포를 고정하고 부착된 박테리아를 항체로 염색했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 숙주 세포가 뻣뻣한 상태에 있을 때 연질젤에 비해 HMEC-1에 부착하는 박테리아가 훨씬 더 많았습니다. 유세포 분석 데이터와 일치하게, 숙주 세포가 뻣뻣한 상태에 있을 때 HMEC-1에 의해 내부화되는 박테리아가 소프트겔에 비해 훨씬 더 많습니다.

일단 마스터되면 이 분석은 중간에 긴 배양 단계가 필요하기 때문에 약 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 하이드로겔과 숙주 세포가 오염되지 않도록 가능한 한 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 원자력 현미경 검사와 같은 다른 방법을 통합하여 감염 시 숙주 세포의 강성이 어떻게 변하는지, 이 효과가 매트릭스 강성에 따라 달라지는지 여부와 같은 질문에 답할 수도 있습니다.

개발 후 이 기술은 기계생물학 분야의 연구자들이 상피 세포와 같은 다른 숙주 세포와 Rickettsia parkeri와 같은 다른 박테리아 병원체를 사용하여 숙주 세포 병원체 생체 역학적 상호 작용의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 다중 웰 플레이트에서 조정 가능한 강성의 하이드로겔을 제조하는 방법과 감염 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원성 박테리아와 함께 일하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

따라서 이 절차를 수행하는 동안 진입 장소와 병원체 사이에 장벽을 삽입하고 에어로졸 생성을 방지하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.