Name: Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 배우세요 마우스 시각 피질에서 해골 얇게 하기 기법을 이용한 만성 이미징 방법으로 수상돌기 가시 역학을 관찰하는 실험 절차입니다. 이 기술은 신경 가소성 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 의생명 과학 (AKM)에 버로우즈 웰컴 경력 수상에 의해 지원되었다, 화이트홀 재단 연구 그랜트 (AKM), 슬로언 재단 원정대 (AKM), NIH EY019277 (AKM), 그리고 네이 자금, 비전 교육 그랜트 EY013319 ( EAK).

<ol><li> 두 광자 현미경, 뉴런은 형광 마커로 표시하는 준비를 사용하여 손상 두뇌의 뉴런을 시각화하는 데 사용됩니다. 실험 여기서 소개 우리는 계층, 5 피라미드 세포 1 라벨 GFP - M 유전자 변형 마우스 라인을 사용합니다. 레이어 5 피라미드 세포는 피아의 수준 아래에 300 μm의 깊이 dendrites과 돌기 쪽이의 시각화를 허용, 표면 레이어로 돌기 프로세스를 프로젝트. 대체 접근법은 바이러스 마커를 (어리 외를 참조하십시오., 조브에 제출)를 사용하여 레이블 셀 수 있습니다. </li><li> 무균 수술을 70 % 에탄올과 압력솥 도구를 사용하여 작업 영역을 소독. 깨끗한 드레싱과 표면을 운영 커버. </li><li> IACUC 승인 절차를 사용 Avertin의 4 분의 1 분량 (0.0075 MG / ML)가 따랐다. 펜타 닐 칵테일 (;, midazolam 5 MG / kg metatomadin 0.5 MG / kg 펜타 닐 0.05 밀리그램 / kg)로 쥐를 마취 진통제와 함께 생쥐를 Pretreat, buprenorphine은 (0.5 밀리그램 / kg) (SQ) subcutaneously 관리. 꼬리 / 발가락 공략 테스트 반응에 의해 마취 비행기의 수준을 모니터링합니다. </li><li> 37.5에서 동물을 유지 ° C 첨부된 직장 온도계와 가열 담요를 사용합니다. </li><li> 밖으로 건조에서 눈을 방지하기 위해 눈 안과 연고를 적용합니다. 수술 중 광원으로부터 눈을 보호하기 위해 종이의 작은 시트와 후드 눈. </li><li> 가위를 사용하여 눈 머리 뒤쪽 (귀 뒤쪽)에서 머리를 제거합니다. </li><li> 70 % 에탄올의 연속적인 응용 프로그램과 함께 동물의 머리의 정상을 청소, betadine 스크럽과 betadine 솔루션으로 따라갔다. </li><li> 눈 정중선 (몇 군데하게됩니다 반구에 따라 다름) 중 하나를 오른쪽 또는 왼쪽 귀 최대 뒤에 L - 컷 절개를합니다. 피부를 통해 접어 거리 수술 사이트에서. 피부가 이미징 세션 다음 봉합한다로 피부를 제거하지 마십시오. </li><li> 좋은 집게를 사용하면 부드럽게 관심의 영역에서 피부를 당겨 멀리. </li><li> 부드럽게 청소 포셉 또는 microsurgical 블레이드와 두개골의 노출된 영역에서 골막 멀리 다쳤어요. 면봉을 사용하여 완전히 골막 멤브레인을 건조하고 그것이 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 두개골에 10 % 산화철 클로라이드의 작은 금액을 적용합니다. 두개골 (11 참조) 접착제의 적절한 준수를 보장하기 위해 완전히 건조하는 것이 중요합니다. 포셉 또는 microsurgical 블레이드를 사용하여 부드럽게 멀리 말린 골막 막을 다쳤어요. </li><li> 스테인리스 스틸 헤드 플레이트 (그림 1 참조)과 부착 두개골에 접시의 이미지 창 주위 cyanoacrylate 접착제의 얇은 레이어를 적용합니다. </li><li> 솜 면봉 스틱의 나무 끝​​을 사용하여 이미지 창 안쪽 솔기에 접착제를 적용, 이미징 플레이트와 두개골의 곡률 사이의 모든 간격을 작성​​해야하고. </li><li> 창에 접착제 가속기의 드롭 놓습니다. 빠르게 멀리 목화 면봉이나 김 닦아와 함께 여분의 접착제 가속기를 닦으십시오. 접착제가 완전히 드릴링 전에 확정되어야합니다. </li><li> 0.7 mm 스테인레스 스틸 버와 부착된 치과 드릴을 사용하여 이미지 윈도우의 두개골을 얇은 시작합니다. 0.9 % 멸균 생리의 가끔 응용 프로그램과 함께 대체 드릴링이 두개골에 너무 많은 열을 발생하지 않도록합니다. </li><li> 치과 드릴로 두개골 표면에 걸쳐 작은 스트로크를 사용하여 두개골의 얇은 4X4 mm의 창. 뭉툭한 끝 포셉와 두개골의 두께를 테스트합니다. 두개골 표면은 부드러운 압력으로 약간 들여쓰기됩니다. 이미징을위한 최적의 두개골 두께는 10 ~ 30 μm의 수 있습니다. </li><li> 두개골이 얇은이고 윈도우, 모든 파편의 두개골에 호수 장소를 청소하는 경우. 해부 범위에 장착된 디지털 카메라로 이미지 창을 사진에 담아보세요. 두뇌 vasculature의 사진과 사용 이후의 영상 세션에 대한 이미징 플레이트 곳으로 위치를 찾는데 도움이됩니다. </li><li> 2 - 광자 장비에 동물을 운송. 동물은 전체 영상 세션 동안 가열 담요 (직장 프로브)에서 유지됩니다. 참고 : 진정제를 맞았 는데도 있지만, 동물의 핵심 체온이 대뇌 피질의 손상 또는 사망 가능성의 결과 가열 장치의 부재에 크게 변동합니다. </li><li> 마이 타이 레이저, 최대 전력 및 수정할 올림푸스 Fluoview 공촛점 단위에 대한 10W 고체 펌프와 함께 두 개의 광자 현미경이 사용됩니다. 시스템은 깊은 조직 이미징에 최적화되어 있으며 두뇌에서 형광의 최대한의 검출을 허용하는 최대한 외부 감지기는 목표에 가까이 설치됩니다. 올림푸스 LUMPlan 층 / IR 20X/0.95NA 목표 렌즈가 사용됩니다. 0.9 %의 염분이 목적을 위해 이미징 잠수하는 동안 사용됩니다. </li><li> 이 현미경을 사용하고, 낮은 디지털 줌 (1 개)은 밝게 표시 뉴런을 포함하는 영역을 식별합니다. </li><li> 현미경 아이 조각에 부착된 디지털 카메라를 사용하여 이미지 영역의 사진을 가져가라. 또는 혈액 vasculature 패턴을 스케치. 이것은 다시하는 것이 필요합니다이후 시점에 동일한 이미지 위치를 설정합니다. </li><li> 돌기 분지의 범위를 보여주는 뇌 (보통 ~ 200 μm의를 스팬)의 전체 가시 범위를 통해, 낮은 배율 스택 (5 μm의 단계 x20 목표, 512x512 픽셀) 구합니다. 참고 :이 낮은 배율 이미지가 혈관과 dendrites 모두 젊은 성인 동물들의 구조를 유지하는 등 이후 시간 지점에서 이미지 영역을 찾습니다하는 데 사용됩니다. </li><li> 이미징 소프트웨어 (Fluoview, V. 5.0, FV300)를 사용, 8 배 디지털 확대를 향상시킬 수 있습니다. X, Y 좌표 (팬 좌표) 필요한 경우를 조정하고 위치 및 돌기 쪽이 구조를 포함한 상세한 돌기 형태를 보여줍니다 높은 배율 스택을 수집합니다. 각 스택 컬렉션, 즉 이동 좌표, 수집, Z - 단계 크기 및 스택에서 단계의 숫자의 범위에 관한 자세한 메모를 가져가라. 이후 시점에서이 dendrite 또는 축삭를 다시 방문할 경우 이러한 노트가 사용됩니다. </li><li> 이미지에 따라 부드럽게 두개골 표면에서 판을 분리하여 헤드 플레이트를 제거합니다. 포셉을 사용하여 두개골에 남아있는 잔여 접착제를 제거하고 0.9 % 멸균 식염수에 두개골 표면을 닦으십시오. # 6 suturing 스레드를 사용하여 함께 두개골을 통해 피부를 봉합. 70 % 에탄올로 영역을 닦아주십시오. 이후 수술 복구하는 동안 통증을 완화하기 위해, 0.1 MG / kg Buprenorphine의 진통, SQ를 관리할 수 있습니다. </li><li> 가열 램프 아래에 깨끗한 케이지에 넣어 동물이 깨어나면 및 모바일 때까지. 원래 케이지로 동물을 반환합니다. </li><li> 나중에 지점 (우리 이미징 시간 포인트가 2 일로부터 떨어져 여러 달 동안에 어디 에나있을 수 있음)에서 reimage 동물하려면, 실밥을 제거할 이상과 같은 무균 방법을 사용하여 머리에 피부를 다시 엽니다. 원래 이미지 위치를 찾습니다 두뇌 vasculature (첫 번째 수술 날짜에 촬영)의 디지털 이미지를 사용합니다. Reaffix 스테인리스 스틸 headplate (10-12 단계). 부드럽게 이미징 시간 지점 간의 다시 성장있을 수있는 뼈를 멀리 얇게하는 microsurgical 블레이드를 사용합니다. 경우, 필요한 치과 드릴 얇은. 지우기 이미징 파편의 창을 0.9 % 멸균 생리의 드롭을 적용합니다. </li><li> 두 광자 현미경을 동물을 운반하고 원본 이미지 필드를 찾습니다. 도움 첫번째 이미지 세션 중에 찍은 디지털 사진을 사용합니다. </li><li> Fluoview 프로그램을 열고 원래 낮은 배율 이미지를 엽니다. 접사 컴퓨터 화면과 스케치에 대한 투명성 시트 투명 펜을 사용하여 주요 혈관 패턴. </li><li> 라이브 이미지를 열고 투명 필름 스케치 패턴 혈액 vasculature를 재개. </li><li> 구조 확대할 8X를 reimage하려면 이전 이미지 세션에서 원하는 수집한 스택을 엽니다. 컴퓨터 화면에 부착된 구조 (glial, 돌기, 즉 axonal) 투명 필름에을 스케치. </li><li> 라이브 이미지에서 8 배속으로 확대하고 냄비를 설정 첫날 이미징 매개 변수를 조정합니다. 낮은 배율 위치를 정렬의 정확성에 따라, 또한 약간 이미지의 각도를 조정해야 할 수도 있습니다. 원하는 구조가 발견되면 귀하의 스케치 높은 배율 패턴의 구조를 일치합니다. 후속 분석을 위해 Z - 스택 이미지의 동일한 단계의 크기 및 숫자와 Z - 스택을 수집합니다. </li><li> 모든 높은 배율 이미지를 다시 수집 때까지 단계 29 30 단계를 반복합니다. </li><li> 이미징이 완료되면, 반복 22-24 단계를 반복합니다. 다시 영상은 2 개의 분리된 시간 지점에서 최대 반복 수 있습니다. </li><li> 동물 실험은 실험실 동물 관리의 평가와 인증을위한 협회에 의해 전체 인증에서 의학 및 치의학의 로체스터 대학의 실험실 동물 의학의 동식물 사육장과 본부가 정한 지침과 규정에 따라 수행되었습니다 주법, 연방 법령 및 NIH 정책을 준수 국제 (AAALAC)와 있습니다. </li></ol> 대표 결과 GFP - M 표현 생쥐에서 레이어 5 피라미드 세포 돌기와 해당 프로세스의 하위 집합은 쉽게 2 - 광자 레이저 스캐닝 현미경 (2PLSM 1)를 사용하여 시각하실 수 있습니다. 여기서 우리는 원하는 영상 위치에 걸쳐 두개골이 ~ 10-30 μm의에 thinned되는 thinned - 두개골 준비를 보여주었다. 제대로 수행, 우리 프로토콜은 우리가 명확하게 급성 또는 만성 분석 (그림 2)에 대한 손상 시각 피질에서 대뇌 피질의 dendrites 및 쪽이을 시각화 수있었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 사용자 정의 머리와베이스 플레이트. thinned - 두개골 수술 준비에 사용되는 사용자 정의 만든 머리와베이스 플레이트의 (A) 톱 볼 수 있습니다. 맞춤 만든 머리와베이스 플레이트의 (B) 사이드 볼 수 있습니다. (C, D) 헤드 판에 대한 상세한 약도와 이미지. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 생체내에 몇 군데. 이미지가 175 μm의의 최종 깊이 피아에서 매 5 μm의를 취득 하나의 이미지의 투영이다. 의 박스 영역의 확대 영역을 나타냅니다 (B)와 (C) 0 (D0), 넷 일 후 (D4) 하루에 몇 군데. 안정 쪽이 (흰색 화살표 머리)를 보여주는 B와 C의 박스 돌기 지점 (D, E) 고등 배율은 / retracting의 쪽이 (레드 애로우 헤드)와 새로운 쪽이 (녹색 화살표 머리)를 잃었습니다. 스케일 바 = A. 200 μm의, B, C. 20 μm의, D, E. 5 μm의.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

두 광자 현미경을 사용하여 만성 영상은 소성 2-5 동안 트리거 형태학의 변화를 연구하기 위해 점점 더 인기가 기술되고 있습니다. 여기 우리는 다른 이미징 일에 그대로 마우스의 뇌에 식별 돌기 쪽이에 따라 thinned - 두개골 준비를 보여줍니다. 이 프로토콜에서는 두개골은 피질에 최소한의 손상을 초래하고 두뇌 기능 6을 변경할 수도 있습니다 neuroinflammation 매우 낮은 수준의 결과로, 그대로 남아 있습니다. 이것은 동물이 바로 첫 번째 수술 후 나중 년 이후 reimaged 일 몇 군데 수 있습니다. 이 강력한 기술입니다뿐만 아니라 그 제한 사항이 있습니다. 두개골 창이 명확 동안 craniotomy하고 따라서 관련 glial 인증과 관련된 더 침입 창 준비, 이미지 세션의 임의의 숫자와 뇌의 반복 이미징 수 있습니다. 얇은 두개골 준비는 그러나, 마우스의 피부를 열고 닫기에 참여 수술로 인해 대부분의 세 이미지 세션으로 제한됩니다. 또한, 깊이 침투는 두개골 창 <su...

<table><tbody><tr><td>구연산 펜타닐</td><td></td><td>자체 제작</td><td></td><td>펜타닐 칵테일: 마취 칵테일;&lt;브레인/&gt;IP 투여량: 0.0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;최종 칵테일 농도: 0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>염산 메데토미딘</td><td></td><td>자체 제작</td><td></td><td>펜타닐 칵테일: 마취제 칵테일;&lt;br/&gt;복강 내 투여량: 0.0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;최종 칵테일 농도: 0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>염산 미다졸람</td><td></td><td>자체 제작</td><td></td><td>펜타닐 칵테일: 마취 칵테일;&lt;br/&gt;복강 내 투여량: 0.0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;최종 칵테일 농도: 0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-트리브로모&amp;#8211;에탄올 </td><td></td><td></td><td></td><td>Avertin 칵테일: 마취제;&lt;br/&gt;복강 내 투여량: 0.0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;최종 칵테일 농도: 1%</td></tr><tr><td>2-메틸-2-부탄올 (최종 농도: 0.775%)</td><td></td><td></td><td></td><td>Avertin 칵테일: 마취제;&lt;br/&gt;복강 내 투여량: 0.0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;최종 칵테일 농도: .775%</td></tr><tr><td>마우스용 TC-1000 온도 조절 시스템</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>TC-1000 마우스 고정 장치</td><td>체온 조절</td></tr><tr><td>토베라덱스(Toberadex)</td><td></td><td>원내(In House)</td><td></td><td>안연고</td></tr><tr><td>10% 염화 철</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>박층 두개골 준비법</td></tr><tr><td>미세수술용 메스 날</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>두개골 박층화 준비</td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 46551</td><td>두개골 박층화 준비</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 40140</td><td>두개골 박층화 준비물</td></tr><tr><td>Zip Kicker 접착 가속제</td><td></td><td>Pacer Technology</td><td>PT-29</td><td>두개골 박층화 준비법</td></tr><tr><td>마이크로 드릴 스틸 버, 팁 직경 0.7mm</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>두개골 박층화 준비법</td></tr><tr><td>마이크로토크 제어 박스 및 Tech2000 핸드피스</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td>박층 두개골 제작법</td></tr><tr><td>#6-0 (0.7 metric) 실크 봉합사</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>테이퍼 C-1</td></tr><tr><td>안과용 드레싱 포셉, 10cm, 팁 너비 0.5mm, 곡형</td><td>수술 도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>초정밀 Bonn 가위, 8.5cm, 직선형 팁, 절삭 날 13mm</td><td>수술 도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>표준 패턴 핀셋, 직선형, 팁 2.5mm x 1.35mm, 12cm</td><td>수술 도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (2PLSM)를 사용하여 생체내 이미징에서 그대로 뇌 속에 살아있는 세포와의 연결 프로세스의 연구는 있습니다. 여기에 제공 기술은 CNS에 postsynaptic 흥분성의 사이트의 대부분을 나타내는 작은 구조 아르 돌기 쪽이의 추적을 허용하는 미세한 해상도 몇 시간 포인트 (만성 영상)에서 두뇌의 동일한 지역의 영상을 허용합니다. 분명 몇 시간 동안 지점 미세 외피 구조를 해결하는 능력은 시냅스 및 회로 개조의 형태학의 변화가 근본적인 메커니즘을 설명할 수 있도록 도와있는 뇌 소성의 연구에서 특히 많은 장점이 있습니다. 이 비디오 및 보조 자료에서 우리는 thinned - 해골 준비를 사용하여 손상 두뇌의 생체내 이미징에서 만성위한 프로토콜을 보여줍니다. thinned - 두개골 준비 따라서 염증 반응의 발병을 줄일 수 두라 및 / 또는 피질에 잠재적인 손상을 피할 수 법으로서 접근 방식입니다. 이 프로토콜이 올바르게 수행되면, 그것은 분명 시간의 장기간 동안 손상 두뇌에 돌기 척추 특성의 변화를 모니터링 할 수 있습니다.

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을 표시<em&gt; 생체내에</emthinned - 해골 준비를 사용하여 손상 뇌&gt; 영상.

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

이광자 레이저 주사 현미경(2PLSM)을 이용한 생체 내 영상 촬영을 통해 온전한 뇌 내부의 살아있는 세포와 신경突起(neuronal processes)를 연구할 수 있습니다.

수지상 돌기 가시는 시냅스 입력을 받는 뉴런 수지상 돌기의 막 돌출부입니다. 가시의 길이 연장, 수축, 출현 또는 소멸은 특정 신경 활동 패턴으로 인해 발생하는 신경망 기능의 변화에 반응하여 일어납니다. 이러한 현상을 피질 가소성이라고 하며, 이를 통해 수지상 돌기 가시의 형태학적 변화를 관찰할 수 있습니다.살아있는 동물에서, 마우스의 두개골에 이미징 플레이트를 부착합니다. 두개골의 일정 영역을 외과적으로 얇게 만든 후, 저배율 및 고배율 이미지를 획득해야 합니다. 이후 일정 시간이 지난 시점에서 해당 영역을 다시 이미징합니다.결과를 통해 얇은 두개골 표본 준비법을 사용하여 여러 시점에서 수지상 돌기 가시의 형태를 명확하게 시각화할 수 있음을 확인하였습니다. 또한 가시 형태는 매우 가소성이 높으며, 구조적 변화뿐만 아니라 수지상 돌기 가시의 생성과 소멸이 나타남을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 신경생물학 및 해부학과의 Anaya Maka 연구실 소속 Emily Kelly입니다.오늘은 핀스(fins)라고 불리는 전처리를 거친 후 생쥐의 시각 피질을 만성적으로 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 수지상 돌기 가시(dendritic spine)의 교체를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.무균 수술을 위한 도구들을 멸균하여 절차를 시작합니다. 그다음 70% ethanol을 사용하여 작업 공간을 멸균하고, 수술 표면을 깨끗한 드레싱으로 덮습니다. 발가락 꼬집기 반응을 테스트하여 펜타닐 칵테일로 마취된 마우스의 마취 깊이를 모니터링합니다. 여기에 표시된 마우스는 GFP가 발현된 A-G-F-P-M 형질전환 마우스입니다.5층의 파라메탈 세포(parametal cells)는 가지돌기 돌기를 표면층으로 뻗습니다. 체온을 37.5°C로 유지하기 위해 동물을 가열 패드 위에 놓고 부착된 직장 온도계로 모니터링하십시오. 그런 다음 가위(또는 도구)를 사용하여 안구의 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포하십시오.귀 뒤쪽부터 눈까지 생쥐 머리 뒷부분의 털을 제거합니다. 그런 다음 70% ethanol을 도포하여 동물의 머리 윗부분을 세척하고, 이어서 Betadine scrub과 Betadine solution으로 세척합니다. 귀 뒤쪽에서 시작하여, 영상 촬영 예정인 반구에 따라 정중선의 오른쪽 또는 왼쪽을 따라 눈 방향으로 LCU 절개를 실시하고, 피부를 수술 부위에서 바깥쪽으로 젖혀 고정합니다.나중에 미세 핀셋을 사용하여 봉합해야 하므로 피부를 제거하지 마십시오. 피부를 조심스럽게 들어 올려 관심 부위에서 멀어지게 당깁니다. 깨끗한 핀셋을 사용하여 노출된 두개골 부위에서 골막을 부드럽게 긁어 제거합니다.10% fair chloride를 두개골에 소량 도포하여 골막을 완전히 건조시키고, 골막이 완전히 제거되었는지 확인합니다. 두개골을 완전히 건조시키는 것이 중요합니다. 접착제가 적절히 부착될 수 있도록, 미세 수술용 칼로 건조된 골막을 부드럽게 긁어냅니다.다음으로, 스테인리스 스틸 헤드 플레이트의 이미징 창 주변에 Sano 아크릴 접착제를 얇게 도포하고 플레이트를 두개골에 부착합니다. 면봉의 나무 끝부분을 사용하여 이미징 창의 내부 이음매에 접착제를 도포하며, 이미징 플레이트와 두개골의 곡면 사이의 모든 틈새가 충분히 채워졌는지 확인합니다. 창 내부에 접착 촉진제를 한 방울 떨어뜨립니다.그 후 남은 접착제를 빠르게 닦아냅니다. 접착제가 완전히 마를 때까지 기다립니다. 0.7 millimeter 스테인리스 스틸 버(burr)가 장착된 치과용 드릴을 사용하여 영상 윈도우 내의 두개골을 얇게 깎아내기 시작합니다.두개골에 과도한 열이 발생하는 것을 방지하기 위해 0.9% 멸균 식염수를 간헐적으로 도포하며 교대로 드릴링합니다. 두개골 표면을 가로질러 짧게 쳐내는 동작을 통해 두개골에 4x4 mm 크기의 창을 얇게 냅니다.치과용 드릴을 사용합니다. 뭉툭한 끝의 포셉으로 두개골의 두께를 확인합니다. 가벼운 압력을 가하면 두개골 표면이 약간 들어갑니다.이미징을 위한 최적의 두개골 두께는 10에서 30 micron 사이입니다. 두개골을 얇게 만든 후, 윈도우의 모든 잔해물을 제거하고 두개골 위에 식염수를 도포하십시오. 해부 현미경에 장착된 디지털 카메라로 이미징 윈도우를 촬영하십시오.이 사진의 뇌 혈관 구조는 이후의 이미징 세션에서 이미징 플레이트를 배치할 위치를 찾는 데 도움이 됩니다. 동물을 이광자 현미경 장치로 이동시키십시오. 동물은 가열 패드 위에 유지되어야 하며, 이미징 세션 전반에 걸쳐 체온을 지속적으로 모니터링해야 합니다.Mi Tai 레이저가 장착된 이광자 현미경입니다. 최대 출력을 위해 10 watt 고체 펌프와 수정된 Olympus flow view 공초점 유닛이 사용됩니다. 이 시스템은 심부 조직 이미징에 최적화되어 있으며, 뇌에서 발생하는 형광을 최대한 검출할 수 있도록 외부 검출기를 대물렌즈에 최대한 가깝게 설치합니다. 낮은 디지털 줌을 사용하여 이미징 창에 식염수를 한 방울 추가하십시오.현미경에 고정된 디지털 카메라를 사용하여 밝게 표지된 뉴런이 포함된 영역을 확인합니다. 그런 다음, 촬영 영역의 사진을 찍습니다. 이는 이후 시점에서 동일한 촬영 위치로 되돌아가기 위해 필요합니다.수지상 돌기 분지의 범위를 보여주는 뇌의 가시적 전체 영역에 대해 저배율 스택을 획득하십시오. 혈관과 수지상 돌기가 어린 동물과 성체 동물 모두에서 구조를 유지하므로, 이는 이후 시점의 이미징 영역을 지정하는 데 사용될 것입니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 이를 수행하십시오.디지털 배율을 8배로 높이고, 필요한 경우 XY 좌표를 조정한 후, 수지상 돌기의 가시(spine) 위치와 구조를 포함한 상세한 수지상 돌기 형태가 나타나는 고배율 스택을 수집하십시오. 팬 좌표, 수집 범위, Z-단계 크기 및 스택 내 단계 수를 포함하여 각 스택 수집에 관한 상세한 기록을 작성하십시오. 이 기록은 이후 시점에서 해당 수지상 돌기나 축삭으로 돌아올 때 사용됩니다.이미징 후, 핀셋을 사용하여 헤드 플레이트를 두개골 표면에서 조심스럽게 분리하여 제거합니다. 잔여 접착제를 모두 제거하고 0.9% 멸균 식염수로 두개골을 닦아냅니다.6번 봉합사로 두개골 위의 피부를 봉합합니다. 영상 촬영 절차가 끝나면 해당 부위를 70%ethanol로 닦아냅니다. 동물이 깨어나 움직일 수 있을 때까지 가열 램프가 있는 깨끗한 케이지에 둡니다.그 후 동물을 원래의 케이지로 돌려보내고, 2일에서 수개월 후의 임의의 시점에 다시 촬영하기 위해 봉합사를 제거하고 머리 부분의 피부를 다시 엽니다. 무균법을 사용하여, 첫 번째 수술 중에 촬영한 뇌 혈관의 디지털 영상을 통해 원래의 촬영 위치를 찾습니다. 그런 다음 이전과 동일하게 헤드 플레이트를 다시 고정합니다.필요한 경우, 미세 수술용 칼날을 사용하여 영상 촬영 시점 사이에 다시 자라났을 수 있는 뼈를 조심스럽게 깎아냅니다. 치과용 드릴로 얇게 깎아낸 후 영상 촬영 창의 잔해물을 제거하고 0.9% sterile saline 한 방울을 떨어뜨립니다. 동물을 이광자 현미경으로 옮기고, 이전 세션 중에 촬영한 디지털 형광 이미지를 사용하여 원래의 영상 촬영 영역을 찾습니다.플로우 뷰 프로그램을 시작합니다. 원본 저배율 이미지를 열고, 컴퓨터 화면에 투명 필름을 부착한 뒤 투명 펜을 사용하여 주요 혈관 패턴을 스케치합니다. 그다음, 라이브 이미지를 열고 혈관 구조를 투명 필름에 스케치한 패턴에 맞춰 다시 정렬합니다.8배 확대된 구조물을 다시 촬영하기 위해 투명 필름을 제거합니다. 이전 촬영 세션에서 수집된 스택 중 원하는 파일을 엽니다. 컴퓨터 화면에 부착된 투명 필름 위에 구조물을 스케치합니다.실시간 이미지에서 8배 확대하고 이미지를 투명 필름과 정렬합니다. 저배율 위치 정렬의 정확도에 따라 이미지 각도를 약간 조정해야 할 수도 있습니다. 스텝 크기와 이미지 수를 포함하여 첫째 날의 이미징 파라미터로 팬 좌표를 설정하고 Z-stack 이미지를 수집합니다. 재이미징은 최대 두 번까지 수행할 수 있습니다. 두개골의 무결성을 저해하여 GFP를 발현하는 마우스에서 이미징 해상도가 낮아지는 것을 방지하기 위해 두피를 여는 횟수를 제한해야 합니다.생체 내 이광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 5층의 파라메탈 세포(parametal cells) 일부와 그에 해당하는 수지상 돌기를 시각화하였으며, 여기에는 GFP로 표지된 시각 피질 수지상 돌기가 표시되어 있습니다. 이 이미지는 PIA부터 최종 깊이 175 µm까지 5 µm 간격으로 획득한 단일 이미지들의 투영 영상입니다. 상자 표시된 영역을 0일 차에 고배율로 보여주고, 다시 4일 차에 보여주며, 0일 차와 4일 차의 수지상 분지 이미지를 고배율로 비교하였습니다.이 이미지들은 흰색 화살표 머리로 표시된 안정적인 가시, 빨간색 화살표 머리로 표시된 소실되어 수축 중인 가시, 그리고 녹색 화살표 머리로 표시된 새로운 가시를 보여줍니다. 지금까지 얇은 두개골 준비법을 사용하여 마우스 시각 피질에서 만성 2광자 이미징을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때, 두개골과 그 아래의 경막에 손상을 주지 않도록 두께를 얇게 만드는 과정에서 특별히 주의하는 것이 중요합니다. 손상이 발생하면 이미징 해상도가 낮아지므로 주의해야 하며, 상세한 기록을 남기시기 바랍니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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