Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

수상돌기 가시는 시냅스 입력을 받는 뉴런의 수상돌기에서 나온 막 돌출부입니다. 척추의 길어짐, 축소 또는 소실은 신경 활동의 특정 패턴으로 인한 신경망 기능의 변화에 대한 반응으로 발생합니다. 이 현상은 수지상 가시의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 피질 가소성(cortical plasticity)으로 알려져 있습니다.

살아있는 동물의 경우, 영상판이 쥐의 두개골에 부착되어 있습니다. 두개골 부위는 수술로 얇아지며 저배율 및 고배율의 이미지가 필요합니다. 그런 다음 영역은 나중에 다시 이미지화됩니다.

얻어진 결과는 여러 시점에서 얇은 두개골 준비를 사용하여 수지상 척추 형태를 명확하게 시각화할 수 있음을 보여줍니다. 그리고 그 척추 형태는 매우 가소성이어서 구조의 변화와 수지상 가시의 모양과 소멸을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 신경생물학 및 해부학과의 아나야 마카 연구실에 있는 에밀리 켈리입니다.

오늘은 준비(preparation)라고 하는 지느러미를 따라 마우스 바이알 피질의 만성 이미징 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 실험실에서 이 절차를 사용하여 수지상 척추 회전율을 연구합니다. 시작하겠습니다.

무균 수술을 위한 도구를 소독하여 절차를 시작합니다. 그런 다음 70% 에탄올을 사용하여 작업 공간을 살균하고 깨끗한 드레싱으로 수술 표면을 덮습니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응을 테스트하여 펜타닐 칵테일 마취 마우스의 마취 깊이를 모니터링하십시오. 여기에 표시된 마우스는 GFP가 발현되는 A-G-F-P-M 형질전환 마우스입니다.

층에서 5 개의 파라메탈 세포는 수지상 과정을 표재성 층으로 투영합니다. 체온을 섭씨 37.5도로 유지하려면 동물을 난방 담요에 눕히고 부착된 직장 체온계로 모니터링하십시오. 그런 다음 가위를 사용하여 눈이 건조해지지 않도록 안과 연고를 바릅니다.

귀 뒤에서 눈까지 마우스의 머리 뒤쪽에서 머리카락을 제거합니다. 그런 다음 70% 에탄올을 바르고 베타딘 스크럽과 베타딘 용액으로 동물의 머리 윗부분을 청소합니다. 귀 뒤와 정중선의 오른쪽 또는 왼쪽을 따라 위로 LCU를 절개하고, 눈에 이미지를 만들 반구에 따라 피부를 수술 부위에서 멀리 접습니다.

나중에 가는 집게를 사용하여 봉합할 수 있으므로 피부를 제거하지 마십시오. 관심 부위에서 피부를 부드럽게 위로 당깁니다. 깨끗한 집게를 사용하여 두개골의 노출된 부위에서 골막을 부드럽게 긁어냅니다.

소량의 10% 공정한 염화물을 두개골에 바르면 골막막이 완전히 건조되고 완전히 제거되었는지 확인합니다. 두개골이 완전히 건조되는 것이 중요합니다. 접착제가 제대로 접착되도록 미세 수술 블레이드로 건조된 골막막을 부드럽게 긁어냅니다.

다음으로, 스테인리스 스틸 헤드 플레이트의 이미징 창 주위에 Sano 아크릴 접착제를 얇게 바르고 플레이트를 두개골에 부착합니다. 면봉의 나무 끝으로 이미징 창의 내부 이음새에 접착제를 바르고 이미징 플레이트와 두개골의 곡률 사이의 모든 틈을 채웁니다. 접착제 가속기를 창에 한 방울 떨어뜨립니다.

그런 다음 초과분을 빨리 닦아내십시오. 접착제가 완전히 건조되면 접착제를 건조시킵니다. 0.7mm 스테인리스강 버가 부착된 치과용 드릴을 사용하여 이미징 창에서 두개골을 얇게 만들기 시작합니다.

0.9%멸균 식염수를 가끔 적용하는 교대 드릴링. 두개골에 너무 많은 열이 발생하지 않도록 합니다. 두개골 표면을 가로질러 작은 획을 사용하여 두개골의 4 x 4mm 창을 얇게 만듭니다.

치과용 드릴과 함께. 뭉툭한 끝 집게로 두개골의 얇음을 테스트합니다. 두개골 표면은 부드러운 압력으로 약간 움푹 들어가게 됩니다.

이미징을 위한 최적의 두개골 두께는 10미크론에서 30미크론 사이입니다. 두개골이 얇아지면 창문의 모든 파편을 청소하고 두개골에 식염수를 놓습니다. 해부 내시경에 장착된 디지털 카메라로 이미징 창을 촬영합니다.

이 사진의 뇌 혈관 구조는 후속 이미징 세션을 위해 이미징 플레이트를 배치할 위치를 찾는 데 도움이 됩니다. 동물을 두 개의 광자 리그로 운반합니다. 동물은 발열 담요 위에 있어야 하며 이미징 세션 내내 체온을 지속적으로 모니터링해야 합니다.

mi tai 레이저를 사용한 이광자 현미경. 최대 출력을 위한 10와트 솔리드 스테이트 펌프와 수정된 Olympus 플로우 뷰 컨포칼 장치가 사용됩니다. 이 시스템은 심층 조직 이미징에 최적화되어 있으며 외부 검출기는 뇌에서 형광을 최대한 검출할 수 있도록 대물렌즈에 최대한 가깝게 설치되고 낮은 디지털 줌을 사용하여 이미징 창에 식염수 한 방울을 추가합니다.

현미경에 고정된 디지털 카메라를 사용하여 밝게 라벨링된 뉴런이 포함된 영역을 식별합니다. Ips, 이미징 영역의 사진을 찍습니다. 이는 후속 시점에서 동일한 이미징 위치로 돌아가는 데 필요합니다.

뇌의 가시적 범위 전체를 통해 수지상 파급 효과의 정도를 보여주는 낮은 배율 스택을 얻습니다. 이것은 후속 시점에서 이미징 영역을 혈관과 수상돌기로 찾는 데 사용됩니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 어린 동물과 성인 동물의 구조를 유지합니다.

디지털 배율을 8배 늘리고, 필요한 경우 XY 좌표를 조정하고, 수지상 가시의 위치와 구조를 포함한 상세한 수지상 형태를 보여주는 고배율 스택을 수집합니다. 이동 좌표, 수집 범위, Z 단계 크기 및 스택의 단계 수를 포함하여 각 스택 컬렉션에 대한 자세한 메모를 합니다. 이 메모는 다음 시점에서 이 수상돌기 또는 축삭돌기로 돌아갈 때 사용됩니다.

이미징 후에는 두개골 표면에서 헤드 플레이트를 부드럽게 분리하여 제거합니다. 겸자 사용. 잔여 접착제를 제거하고 0.9% 멸균 식염수로 두개골을 닦습니다.

6번 봉합사를 사용하여 두개골 위의 피부를 함께 봉합합니다. 이미징 절차에 따라 70% 에탄올로 해당 부위를 닦습니다. 동물이 깨어나 움직일 수 있을 때까지 열 램프 아래의 깨끗한 케이지에 동물을 놓습니다.

그런 다음 동물을 원래 우리로 되돌려 놓고 나중에 이틀에서 몇 달 후에 동물의 이미지를 다시 만들고 실밥을 제거하고 머리의 피부를 다시 엽니다. 무균 방법을 사용하여 첫 번째 수술 중에 촬영한 뇌 혈관 구조의 디지털 이미지를 사용하여 원래 이미징 위치를 찾습니다. 그런 다음 이전과 같이 헤드 플레이트를 다시 고정합니다.

필요한 경우 미세 수술용 칼날을 사용하여 이미징 시점 사이에 재성장했을 수 있는 뼈를 부드럽게 얇게 만듭니다. 치과용 드릴로 얇게 이미징 창에서 이물질을 제거하고 0.9%의 멸균 식염수를 한 방울 떨어뜨립니다. 동물을 이광자 현미경으로 옮기고 이전 세션에서 촬영한 디지털 형광 이미지를 사용하여 원래 이미징 영역을 찾습니다.

플로우 뷰 프로그램을 시작합니다. 원본 저배율 이미지를 열고 투명 시트를 컴퓨터 화면에 부착한 다음 투명 펜을 사용하여 주요 혈관 패턴을 스케치합니다. 그런 다음 라이브 이미지를 열고 혈액 혈관 구조를 투명 필름의 스케치된 패턴에 다시 정렬합니다.

투명도를 제거하여 8x 확대된 구조를 다시 이미지화합니다. 이전 이미징 세션에서 원하는 수집된 스택을 엽니다. 컴퓨터 화면에 부착된 투명 필름에 구조를 스케치합니다.

라이브 이미지에서 8배 확대하고 이미지를 투명도에 맞게 정렬합니다. 저배율 위치 정렬의 정확도에 따라 이미지의 각도를 약간 조정하고 팬 좌표를 첫날의 이미징 매개변수로 설정해야 할 수도 있으며, 단계 크기 및 수집 이미지 수를 포함하여 Zack 재이미징을 두 번 수행할 수 있습니다. 두개골의 무결성을 방해하지 않도록 두피를 여는 횟수를 제한해야 하며, 이로 인해 GFPM이 마우스를 발현할 때 이미징 해상도가 저하됩니다.

여기에 생체 내 2 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 층 5 파라메탈 세포의 하위 집합과 해당 수지상 돌기가 시각화되었으며, GFP 표지 시각 피질 수상돌기가 표시됩니다. 이 이미지는 PIA에서 5미크론마다 얻은 단일 이미지를 175미크론의 최종 깊이까지 투영한 것입니다. 박스형 영역은 여기에서 0일째에 더 높은 배율로 표시되며, 여기에서 다시 4일째에 0일째와 4일째의 수지상 가지 이미지의 더 높은 배율을 비교합니다.

이 이미지는 흰색 화살촉이 사라지고 후퇴하는 가시로 표시되는 안정적인 척추를 보여주며, 빨간색 화살촉으로 표시되고 녹색 화살촉으로 표시되는 새로운 가시를 보여줍니다. 우리는 방금 얇은 두개골 제제를 사용하여 쥐의 시각 피질에서 만성 이광자 이미징을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 두개골과 기저 경막의 손상을 방지하기 위해 얇게 하는 과정에서 특별한 주의를 기울여야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.