인간 iPSC에서 PiggyBac Transposon-매개 유전자 편집: PiggyBac Transposon 시스템을 사용하여 인간 iPSC에 관심 유전자를 통합하는 절차

적절한 전기천공법 완충액에서 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)를 현탁하는 것으로 시작합니다. PiggyBac transposase 인코딩 플라스미드와 donor 플라스미드로 구성된 용액을 추가합니다. 혼합물을 전기천공합니다.

전기 펄스는 세포막을 일시적으로 투과시켜 플라스미드의 세포 흡수를 촉진합니다. 공여 플라스미드는 트랜스포손 특이적 역말단 반복(ITR)으로 구성되며, 이는 서로의 역보체이며, 그 측면에는 표적 단백질과 항생제 내성 유전자를 브라케팅하는 TTAA 반복이 있습니다.

발현된 PiggyBac transposase 단백질은 TTAA 반복 내부의 ITR의 3' 말단에 흠집을 생성합니다. 노출된 3'-하이드록실기는 측면 DNA 내부의 상보적 가닥의 뉴클레오타이드를 공격하여 트랜스포존 말단에 TTAA 헤어핀을 형성하여 플라스미드에서 트랜스포존 구조체를 방출합니다.

Transposase는 헤어핀을 분해하여 transposon 구조체의 5' 말단에서 TTAA 돌출부를 형성합니다. 트랜스포사제(transposase)는 숙주 게놈의 TTAA 염기서열에서 이중 가닥 절단을 추가로 생성합니다. 방출된 3'-하이드록실 트랜스포손 말단은 엇갈린 말단에서 TTAA 서열을 공격하여 트랜스포존 구조체가 숙주 게놈에 공유 결합을 일으켜 트랜스포손 구조체 옆에 단일 가닥 갭을 남깁니다. 숙주 DNA의 이러한 갭은 결찰되어 트랜스포존 구조체의 안정적인 통합으로 이어집니다.

세포외 기질 단백질로 코팅된 플레이트에 파종된 hiPSC를 항생제 함유 배지로 처리합니다. upstream promoter에 의해 구동되는 항생제 내성 유전자는 유전자 편집 세포를 선택할 수 있게 합니다.