DNA 조각을 Electroeluting

Hi.Today 분해 및 PCR 산물과 같은 DNA 단편을 정제하기 위해 electro lution이 어떻게 수행되는지 보여드리겠습니다. 클로닝 및 염기서열분석과 같은 추가 목적을 위해 electro lution은 선택 방법 중 하나가 될 수 있습니다. DNA의 음전하를 기반으로 전기장 내에 높은 세포 장벽이 배치되어 단편을 떨어뜨리고 추가 이동을 방지합니다.

이 방법을 사용하면 최대 80%의 저렴한 비용으로 비교적 높은 효율로 다양한 출처의 광범위한 DNA 단편 크기를 정제할 수 있습니다. electro lution의 또 다른 장점은 컬럼, 수지 키트와 같은 다른 정제 방법과 비교할 때 나타냅니다. DNA 샘플은 먼저 브론마이드 염색 아리스 겔 전기 영동으로 시각화하고 정제 할 원하는 단편을 식별하기 위해 시각화하고 전기 영동이 진행되어야한다고

아래 단편이 잘 분리되어 있고 크기가 작은지 정확하게 결정할 수 있습니다. 전기영동 후. 원하는 조각은 새로운 면도날을 사용하여 젤에서 깔끔하게 절단하고 젤 슬라이스를 관심 밴드에 최대한 가깝게 돌리도록주의합니다.

이 절차는 자외선으로부터 적절한 보호를 받고 장갑을 착용하여 수행해야 합니다. 전기 루터에 적절한 연소 완충액을 채우고 중간 고원의 표면에 쏟도록 주의한 후 젤 슬라이스를 V 채널에 최대한 가깝게 휠 중 하나 내부에 놓습니다. vch 채널 내부에 기포가 없어야 합니다.

이는 버퍼로 채널을 플러시하여 갇힌 공기를 제거함으로써 피할 수 있습니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 높은 염 장벽을 우물에 근접 한 사이트에서 V 채널에 조심스럽게 첨가합니다. 챔버는 밀폐되어 있으며 전극은 전원에 연결되어 100-120 볼트에서 전기 lution을 시작합니다.

시간 경과는 최대 20kbs의 큰 조각의 조각 크기에 따라 달라집니다. 50분에서 1시간이면 충분하며 작은 조각은 소금 용액을 통해 최종 성인 버퍼 사슬로 더 이상 이온이 발생하지 않도록 자외선으로 10분마다 모니터링해야 합니다. 이 경우, 우리는 효소 ND 1과 함께 560 나노그램의 플라스미드를 분해하여 단편당 900 염기를 방출했으며, 이는 샘플 84 나노그램에 해당합니다.

따라서, 겔 슬라이스를 웰 내부에 넣은 후, 전기 루션은 100볼트에서 25분 동안 진행될 것이다. 일단 전기용액이 완성되고 DNA 단편이 V 채널 내의 남쪽 쿠션에 갇히면, 400 마이크로리터의 용액이 채널로부터 회수되고, 수용체의 원위측으로부터 회수되고, 마이크로 피트에 부착된 미세한 팁을 사용하여 1.5 마이크로리터 마이크로 튜브에 놓인 후, 2부피의 차가운 절대 에탄올을 첨가하고 와류에 의해 혼합하여 알코올 침전을 진행한다. 또한, 2-3 마이크로 리터의 글리코겐을 첨가하여 수율을 향상시킬 수 있습니다 DNA 회수 클래식 튜브 섭씨 영하 20도에서 1 시간 동안 또는 또는이 온도에서 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 최고 속도로 25 분 동안 원심 분리기를 보관하십시오.

이 유산소 상등액은 섭씨 4도에서 5-10분 동안 최고 속도로 1ml의 냉기, 70% 에탄올 원심분리기를 첨가하여 세척하고 상등액을 버리고 튜브를 거꾸로 한 상태로 실온에서 건조시키고 10-15마이크로리터의 핵 자유수에 그리스를 소비하고 샘플의 농도를 측정하기 위해 진행합니다. 이 경우, 정제 된 샘플을 10 마이크로 리터의 물에 재현 탁시키고 260 나노 미터 파장의 분광 광도계에서 정량화하여 마이크로 리터 당 6.3 나노 그램의 농도를 보여 주어 75 %의 효율을 나타냈다. 키트에 소중한 시간을 10분만 투자하는 것이 더 낫다고 생각할 수도 있습니다.

그러나 이 과정에서 소요되는 시간에도 불구하고 자연의 크기와 공급원을 포함하는 더 넓은 범위의 샘플을 정제할 수 있는 많은 변수를 제어할 수 있습니다. 본 사례에서 볼 수 있듯이 75%의 효율이 대부분의 DNA 정제 키트와 같거나 더 나은 것으로 관찰되었습니다. 오늘 함께해 주셔서 감사합니다.

이 프로토콜이 귀하의 연구 프로젝트에 유용하기를 바랍니다.