Name: DNA 조각을 Electroeluting (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 배우세요 전기영동을 이용한 DNA 조각 정제 방법을 통해 분자생물학 연구에서 높은 수율과 효율성을 달성하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 다양한 크기의 DNA를 저비용으로 정제할 수 있습니다.

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박사 Bermudez 실험실에서 작업이 Conacyt (부여 # 82622)에 의해 재정 지원되었다. 우리는 가브리엘라 구티에레즈 - 소사, Eliuth 레예스 - 마르티네스와 electroleution 절차를 녹화 비디오 Ximena로드 리게스 - 토레스. 감사합니다

<ol><li> 정화가에 관심이 DNA 조각을 선택하기 위해서는 이러한 아가로 오스에서 해결되어야 또는 아크릴 아미드의 젤은 1 시간 동안 120 볼트에서 0.5X TBE 버퍼 (트리스 borate, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))를 사용 전기 영동하여 ethidium의 브로마이드 물들일 젤. 이를 위해, 플라스미드 pProEx - GdMre11S의 ~ 700 NG (6000 - BP)은 이전에 NdeI와 HindIII와 소화는 900 - BP 조각 (조각의 플라스미드와 84 NG의 560 NG)를 출시하는 데 사용되었다. </li><li> electroeluter 탱크 (그림 1)은 중간 고원에 흘리면 안되 돌보는 마찬가지로 중간 고원의 양쪽에서 배포 0.5X TBE 가득해야합니다. </li><li> 선택한 밴드 (또는 밴드)은 젤 도려낸, 그리고 가까이 가능한 V 채널 (물론 당 슬라이스)로 같은 샘플 챔버에 배치됩니다. 실행 버퍼는 각 챔버에 추가되어야하며 겔 슬라이스를 충당하기 위해 충분. </li><li> 사용하는 각 V 채널은 함정에 기포를 제거하기 위해 파스퇴르 피펫로 플러시해야합니다. </li><li> 다음 10 M NH 4 아세테이트 100 UL은 (bromophenol 파란색의 작은 금액이 충분히 그것을 컬러로, 추가 시각화를 촉진하기) 가볍게 V 채널 내부에 추가됩니다. </li><li> 높은 소금 쿠션의 resuspension을 방지하기 위해 뚜껑이 부드럽게 폐쇄해야합니다. </li><li> Electroelution은 25 분 동안 100 볼트에서 시작됩니다. </li><li> electrolution가 완료되면, 400 UL은 V 채널에서 삭제, 1 시간 또는 숙박에 대해 4 추위 에탄올과 글리코겐 (DNA 복구를 개선하기 위해 권장) 2 권 ° C로 시켰던 수 microfuge 튜브에 배치됩니다. </li><li> 20 분 동안 원심 분리기, 뜨는 제거하고 70 % 에탄올로 씻는다. </li><li> 드라이 튜브와 OD 260 nm의에서 DNA를 계량. </li><li> 얻은 복구 75 % (84가 NG가 V 채널에 배치했을 때 63 NG가 회복)되었습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Electroeluter 다이어그램. 음극은 슬라이스 겔에 포함된 탱크, DNA의 각 측면에 표시됩니다 (검은색 사각형으로 그림)는 부정적인 요금으로 인해 음극으로 마이 그 레이션됩니다 Anod. 그렇다면 그것은 V 채널에있는 소금 쿠션 (거꾸로 검정색 삼각형로 표시됨)에 갇혀있는 것입니다.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

실행의 기간은 최대 조각 일반적으로, 조각의 크기에 매우 달려 작은 조각을 위해 10 분마다 모니터링 자외선이 통과하기 위해 조각을 방지하기 위해 필요한 동안 1 시간 20킬로바이트 50 분, 충분 소금 쿠션과 결과적으로 복구를 감소 anodal 버퍼 챔버 있습니다. 당신은 100 볼트에서 전원 공급 장치를 설정할 때, 현재 적어도 10 mAmp있다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. DNA 밴드는 UV - 손 램프를 사용하여 모니터링이가 젤 조각을 버리지 감지 수 있습니다. 쿠션 소금도 3 M 나 아세테이트로 만들 수 있습니다. 이 절차는 좋은 회복 (~ 80 %)과 다양한 크기의 DNA 또는 RNA 조각의 정화가 수정 효소 등 처리 제한 효소에 의해 소화, radiolabeled 수 있습니다

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 아세테이트</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>바이오포토미터</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>전기(Electr)&amp;#8211;루터</td><td>심실 간격 (Inter-beat Interval)</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

dna 조각을 electroeluting

Electroeluting DNA Fragments

정화 DNA 조각은 분자 생물학에서 다양한 용도로 사용되며 그들은 몇 가지 절차로 준비하실 수 있습니다. 그들의 대부분은 관심의 밴드를 분리하기 위해 DNA 조각의 이전 전기를 필요로합니다. 그런 다음,이 밴드는 아가로 오스 또는 아크릴 아미드 겔에서 밖으로 excised 및 사용하여 정화 중입니다 유리 또는 실리카 입자, DEAE - 셀룰로오스의 점막에서 바인딩과 용출은 &quot;방법을 호감과 흡수&quot;electroelution 또는 매우 자주 비싼 상업 정화 키트. 따라서, 방법을 선택하면 실험실에서 사용할 수있는 무엇을 주로 따라 달라집니다. electroelution 절차는 한 응용 프로그램의 많은 (시퀀싱, radiolabeling, 효소 제한, 효소 수정, 복제 등)에 사용되는 매우 깨끗한 DNA를 정화 수 있습니다. 이 절차는 배치에 구성되어 DNA 밴드가 포함된 다음 적용 전류 electroeluter의 샘플 우물로 아가로 오스 또는 아크릴 아미드 조각하면 DNA 조각은 아가로 오스을 떠날 수 있도록하고 있으므로 에탄올 침전에 의해 나중에 복구하는 쿠션 소금에 갇혀 수 있습니다.

이 절차는 높은 수율로의 DNA 조각의 정화 수 있습니다.

DNA 조각을 Electroeluting

정제된 DNA 단편은 분자생물학의 다양한 목적에 사용되며, 여러 절차를 통해 준비할 수 있습니다. 이들 대부분은 ...이(가) 필요합니다.

안녕하세요. 오늘은 제한효소 처리 및 PCR 산물과 같은 DNA 단편을 정제하기 위한 전기용출(electrolution) 방법을 보여드리겠습니다. 클로닝이나 시퀀싱과 같은 추가 목적을 위해 전기용출은 유용한 선택 방법 중 하나가 될 수 있습니다. DNA의 음전하 특성을 이용하여, 전기장 내에 높은 세포 장벽을 배치함으로써 단편들을 떨어뜨리고 더 이상의 이동을 방지합니다.이 방법은 다양한 소스로부터 광범위한 크기의 DNA 단편을 최대 80%의 비교적 높은 효율로 정제할 수 있게 해줍니다. 저렴한 비용은 컬럼이나 레진 키트와 같은 다른 정제 방법과 비교했을 때 전기 용출(electrolution)이 갖는 또 다른 장점입니다. 먼저, 정제하고자 하는 표적 단편을 시각화하고 식별하기 위해 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색된 아가로스 겔 전기영동으로 DNA 샘플을 확인해야 하며, 이후 전기영동을 진행해야 합니다.단편들이 잘 분리되어 있으면, 크기가 작은 단편들을 정밀하게 결정할 수 있습니다. 전기영동 후, 새 면도날을 사용하여 겔에서 원하는 단편을 깔끔하게 절제하며, 이때 겔 조각을 관심 밴드에 최대한 가깝게 맞추어 절단하도록 주의합니다.본 절차는 UV 광선으로부터 적절히 보호된 상태에서 장갑을 착용하고 수행해야 합니다. 전해 용출기(electroluter)에 적절한 용출 버퍼를 채우고 중앙 플랫폼 표면에 버퍼가 충분히 덮이도록 주의한 후, 겔 슬라이스를 V-채널에 최대한 가깝게 휠 내부의 한 곳에 배치합니다. V-채널 내부에 기포가 없어야 합니다.채널을 버퍼로 세척하여 갇혀 있는 공기를 제거함으로써 이를 방지할 수 있습니다. 그 다음, 웰에 가까운 쪽에서 V 채널로 100 µL의 고농도 염 배리어를 조심스럽게 첨가합니다. 챔버를 밀폐하고 전극을 전원에 연결하여 100 ~ 120 V에서 전기 용출을 시작합니다.타임랩스는 프래그먼트 크기에 따라 달라지며, 최대 20 kb의 큰 프래그먼트의 경우 50분에서 1시간이면 충분합니다. 작은 프래그먼트는 염 용액을 통해 말단 성인 버퍼 체인으로 추가 용출되는 것을 방지하기 위해 UV 광선으로 10분마다 모니터링해야 합니다. 본 실험에서는 ND one 및 entry 효소로 560 ng의 플라스미드를 소화시켜 900 bp 프래그먼트를 분리했으며, 이는 샘플 84 ng에 해당합니다.이에 따라, 겔 슬라이스를 웰 안에 넣은 후 100 volts에서 25분 동안 전기 용출(electro elution)을 진행합니다. 전기 용출이 완료되고 DNA 단편들이 V 채널 내의 하단 쿠션에 포집되면, 리셉터클의 원위단 쪽 채널에서 400 µL의 용액을 회수합니다. 마이크로 피펫에 장착된 파인 팁을 사용하여 이를 1.5 µL 마이크로 튜브에 옮긴 후, 2배 부피의 차가운 절대 에탄올을 첨가하고 볼텍스로 혼합하여 알코올 침전을 진행합니다. 또한, DNA 회수율을 높이기 위해 2~3 µL의 글리코겐을 추가할 수 있습니다. 튜브를 -20 °C에서 1시간 동안 또는 하룻밤 동안 보관한 후, 4 °C에서 최대 속도로 25분 동안 원심 분리합니다.이 상층액과 세척액에 차가운 70% ethanol 1 mL를 첨가합니다. 4 °C에서 최대 속도로 5~10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 튜브를 뒤집은 상태로 실온에서 건조합니다. 10~15 µL의 nuclease-free water에 다시 현탁하여 시료의 농도를 측정합니다. 본 실험에서는 정제된 시료를 10 µL의 물에 재현탁하고 분광광도계의 260 nm 파장에서 정량하였으며, 그 결과 6.3 ng/µL의 농도로 75%의 효율을 나타냈습니다. 소중한 시간을 단 10분만 투자하여 키트를 사용하는 것이 더 효율적이라고 생각하실 수도 있습니다.하지만 이 과정에 많은 시간이 소요됨에도 불구하고, 다양한 크기와 기원을 가진 더 넓은 범위의 시료를 정제할 수 있도록 여러 변수를 제어할 수 있게 됩니다. 이번 사례에서 보셨듯이, 대부분의 DNA 정제 키트와 비슷하거나 더 우수한 75%의 효율이 관찰되었습니다. 오늘 함께해 주셔서 감사합니다.이 프로토콜이 귀하의 연구 프로젝트에 유용하게 활용되기를 바랍니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

"E - DNA"센서는 reagentless, 혈액 및 기타 복잡한 매트릭스에서 직접 도전 경우에도 실적이 전기 biosensors은 핵산, 단백질과 작은 분자 analytes 다양한 범위의 감지 적응되었습니다. 여기에는 센서의 제조 및 사용에 대한 일반적인 절차를 제시한다.

핵산, 단백질과 작은 분자의 Reagentless 감지를위한 전기 -의 DNA Biosensors의 제작

아가로 오스 겔 전기 영동을 이용한 DNA 조각의 분리를위한 기본적인 프로토콜이 설명되어 있습니다.

의 DNA 조각의 분리를위한 아가로 오스 젤 전기 영동

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항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화 

배우세요 전기영동을 이용한 DNA 조각 정제 방법을 통해 분자생물학 연구에서 높은 수율과 효율성을 달성하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 다양한 크기의 DNA를 저비용으로 정제할 수 있습니다.

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