자료 쌍 해상도에서 DNA 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing은 시토신 중아황산염 변환과 결합된 제한 효소 분해를 기반으로 DNA 메틸화 분석을 위한 염기서열분석 라이브러리를 준비하는 방법입니다. 이 프로토콜은 50ng의 시작 물질이 필요하며 GC가 풍부한 게놈 영역에서 염기쌍 분해능 데이터를 생성합니다.

이 절차의 전반적인 목표는 염기쌍 분해능 D-N-A-C-P-G, 아황산염 전환에 의한 시토신과 결합된 제한 효소 분해를 기반으로 하는 메틸화 분석을 위한 염기서열분석 라이브러리를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 고품질 DNA의 MSP one 제한 효소 분해를 수행한 다음 말단 복구, 메틸화 어댑터의 테일링 및 결찰을 수행하여 수행됩니다. 다음 단계는 아황산염 변환 후 선택된 단편 크기에 대해 아황산염 변환을 수행하는 것입니다.

단편은 PCR을 사용하여 증폭됩니다. 마지막 단계는 품질 관리 및 염기서열분석을 수행한 후 데이터 시각화 및 분석을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 이중 아황산염 염기서열분석의 향상된 감소된 표현은 CG가 풍부한 게놈 유전자좌에서 시티딘 메틸화 패턴의 정량적 염기쌍 분해능을 검출합니다.

마이크로어레이와 같은 다른 DNA 메틸화 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 염기쌍 분해능 및 생물학적으로 관련된 부위에서 높은 커버리지 D-N-A-C-P-G 메틸화 데이터를 생성하기 위해 소량의 입력 물질 수량을 활용할 수 있다는 것입니다. 우리는 전통적인 분석법에서 다루는 영역을 넘어 후성유전학적 패턴을 탐구하는 데 관심이 있었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 우리는 마이크로어레이에서 다른 차세대 기술에서 생성된 데이터와 통합될 수 있는 염기쌍 해상도 DNA 메틸화 데이터 생성으로 전환하기 위해 이 기술을 개발하는 데 관심이 있었습니다.

이 방법은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 후성유전학적 패턴화(epigenetic patterning)와 생물학적 샘플의 이질성(heterogeneity in biological samples)이 정상 대조군 또는 다른 질병 상태와 비교됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 절차의 길이, 수많은 특정 요구 사항 및 Mamie fall을 생성한 라이브러리의 고유한 염기서열 분석 특성으로 인해 어려움을 겪을 것입니다.

우리 실험실의 연구 전문가가 이 프로토콜을 시작하는 절차를 시연하는 데 도움을 줄 것입니다. 먼저, MSP 1 제한 효소 분해, 평활화 말단 복구 반응 및 3 프라임 말단에서 단일 뉴클레오티드 추가를 거친 게놈 DNA 샘플의 정제된 분취액을 준비합니다. 이 시점에서 DNA 산물은 어댑터 결찰을 시작하여 10마이크로리터의 A-A-L-D-N-A 샘플을 0.2ml PCR 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓을 준비가 됩니다.

또한 어댑터 분자의 부분 표본을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 얼음 위에서 결찰 시약 혼합물을 준비합니다. 결찰 시약과 어댑터 분자를 DNA 샘플에 모두 추가하고 몇 차례 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

PCR 튜브를 열 순환기에 넣고 다음 날 섭씨 16도에서 밤새 결찰 반응이 진행되도록 합니다. 마그네틱 비드 또는 실리카 컬럼 기반 고체상 DNA 추출 키트를 사용하여 접합 산물을 정제합니다. 정화 과정의 마지막 단계에서.

30마이크로리터의 DNA 자유수를 첨가하여 DNA를 용리합니다. 정제된 DNA 산물은 25나노그램 이상의 총 DNA로 시작하는 샘플에 필요할 때까지 섭씨 음의 20도에서 보관할 수 있습니다. PI 및 prep과 같은 자동 겔 추출 장치를 사용하여 길이가 150 염기쌍에서 400 염기쌍 사이인 결찰 산물을 선택합니다.

Ethereum bromide 또는 cyber green과 같은 DNA 시각화 염료는 포크 어댑터 결합 단편의 DNA 이동 특성을 변경할 수 있으므로 agros cassette에서 제외해야 합니다. 표준 agros gel-based size selection protocol은 pippin 2%free-dye-apart cassette에서 DNA 전기영동을 설정하기 위한 프로토콜의 이 단계에도 사용할 수 있습니다. Pippin Prep 콘솔에서 새 프로토콜을 생성하고 2%DF marker L 옵션을 선택한 카세트로 선택합니다.

그런 다음 use internal standards(내부 표준물질 사용) 옵션을 활성화하고 150개의 염기쌍 및 400개의 염기쌍에 이르는 DNA 단편을 분리하기 위한 레인 번호가 레인 번호와 일치하는지 확인합니다. 범위 옵션을 수집 모드로 선택하고 기본 쌍 시작의 경우 135, 기본 쌍 끝의 경우 410, 기본 쌍 발의 경우 240 제한 매개변수를 입력합니다. 이것은 장치가 전기 영동 필드를 전기 용리 출력 포트에 정렬하도록 지시합니다.

해당 범위 내의 DNA 조각이 배출구 근처로 이동할 때. 프로토콜 파일을 저장한 후 기기 설정 시 Pippen Prep의 표준 작동 절차에 따라 기기의 겔 카세트와 샘플 로딩 웰을 준비합니다. 주어진 결찰 후 샘플의 30 마이크로리터 분취량에 10 마이크로리터의 DNA 마커를 추가하여 혼합물을 겔 카세트에 로드하여 전기영동을 위한 DNA 샘플을 준비합니다.

먼저 각 샘플에서 40마이크로리터의 전기영동 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 각 40마이크로리터 샘플 마커 혼합물을 개별 웰에 피펫팅하여 부피를 교체합니다. Console로 돌아가서 저장된 프로토콜을 로드하고 start를 눌러 전기영동을 시작합니다.

프로그램이 240 염기 쌍에 도달하면 일시 중지 단계에서 피펫을 사용하여 각 출력 포트에서 40마이크로리터의 출력을 수동으로 수집합니다. 이 fractions를 lower library fraction(하위 라이브러리 분수)으로 레이블을 지정합니다. 하부 라이브러리 분획을 수집한 후 즉시 40마이크로리터의 새 전기영동 버퍼를 추가하여 배출 포트를 세척합니다.

버퍼를 최소 세 번 위아래로 피펫팅한 다음 snet을 흡인합니다. 이 세척을 두 번 더 반복하여 배출구에서 짧은 길이의 DNA 종의 모든 흔적을 제거합니다. 이제 샘플에 40마이크로리터의 전기영동 버퍼를 추가합니다.

elucian 포트를 잘 밀봉하고 run 버튼을 눌러 elucian 프로세스를 다시 시작합니다. 410 염기쌍 설정에서 Ellucian 프로그램을 완료하면 모든 배출 포트에서 40마이크로리터의 이누이트를 수집하고 이 분획을 상위 라이브러리 분획으로 표시합니다. 이 시점에서 두 라이브러리 분획은 모두 겔 정제되었으며 이미 이중 아황산염 전환을 위해 사용됩니다.

시중에서 판매되는 키트를 사용하여 두 라이브러리 분획에 대해 bi-sulfite conversion assay를 수행합니다. 변환 과정의 마지막 단계에서 DNA 샘플을 40마이크로리터의 DNA 자유수로 용리시킵니다. 비스무아황산염 변환 후, 생성된 DNA 라이브러리 단편은 각 DNA 분자의 어댑터 말단에서 혼성화되는 프라이머를 사용하여 농축 PCR 증폭을 거칩니다.

농축 PCR을 먼저 준비하기 위해 황화물 변환 샘플의 40마이크로리터 분취액당 160마이크로리터의 PCR 마스터 믹스를 추가합니다. 그런 다음 생성된 200마이크로리터 혼합물을 4개의 50마이크로리터 분취액으로 나눕니다. 별도의 PCR 튜브에서.

튜브를 열 순환기에 넣고 변환된 DNA 템플릿을 증폭합니다. 농축 후 4개의 post PCR 산물을 단일 1.5ml 튜브로 끌어당기고 상용 PCR 클린업 키트로 DNA를 정제합니다. PCR 산물을 정제하기 위해 마그네틱 비드 고체상 추출 키트를 사용하는 경우, 먼저 결합된 하부 라이브러리 PCR 산물을 총 부피의 1.7배인 비드와 혼합하여 표준 운영 절차를 수정합니다.

그런 다음 결합된 상부 라이브러리 PCR 산물을 총 부피의 1.1배인 비드와 혼합합니다. 그런 다음 정제 공정의 마지막 단계에서 각 세척량을 800마이크로리터로 변경해야 하는 70% 에탄올 세척 단계까지 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 50마이크로리터의 DNA가 없는 용리 완충액으로 DNA를 용리합니다.

이중 가닥 DNA에 대해 선택적인 형광 기반 분석을 사용하여 필요할 때까지 정제된 라이브러리를 섭씨 영하 20도에서 보관하고 각 라이브러리 분획에 대한 농축 후 DNA 함량의 양을 정량화합니다. 또한 bioanalyzer로 농축 후 라이브러리 크기와 품질을 평가합니다. 염기쌍으로 표현된 평균 DNA 길이를 사용하여 특정 라이브러리 분획의 유효 DNA 몰 농도를 계산합니다.

몰 농도가 알려지면 DNA의 자유수를 사용하여 해당 상부 및 하부 라이브러리 분획을 각각 2개의 나노몰 최종 농도로 희석합니다. 하부 및 상부 라이브러리 쌍을 단일 튜브로 결합하여 각각 20마이크로리터에서 두 개의 나노몰 구멍 라이브러리 혼합물을 생성합니다. 이제 풀링된 샘플이 염기서열분석을 실행할 준비가 되었습니다.

E-R-R-B-S를 포함한 염기서열분석 관련 분석에서 상부 및 하부 라이브러리 분자의 품질 및 크기 분포는 최종 염기서열분석 데이터의 품질을 결정하는 핵심 요소입니다. 기존의 수동 겔 추출 프로토콜과 비교할 때, E-R-R-B-S 프로토콜에 사용되는 자동 겔 추출 장치는 일관된 크기 분포를 생성하고 교차 샘플 오염 가능성을 최소화합니다. 다음으로, 염기서열분석을 위해 BIS 아황산염으로 변환된 라이브러리 분자를 보낼 때 모든 DNA 가닥의 원시 데이터는 주어진 가닥에 대해 각 뉴클레오티드 위치에 대한 데이터 품질이 처음 3개의 뉴클레오티드 직후에 극적으로 증가한다는 것을 보여줍니다.

이 세 가지 뉴클레오티드에 대한 합의 서열이 대다수의 라이브러리 분자에 대해 CGG로 설정되었기 때문에 데이터는 E-R-R-B-S 프로토콜이 주로 측면에 있는 바람직한 게놈 단편 세트를 포함하는 라이브러리 컬렉션을 생성했음을 시사합니다. MSP를 사용하면 하나의 제한 다이제스트가 조감도에서 끝납니다. E-R-R-B-S 프로토콜은 전체 게놈에 걸쳐 시티딘 메틸화 부위의 염기쌍 분해능 데이터를 생성할 수 있습니다.

예를 들어, 염색체 12가 여기에 표시됩니다. 이 프로토콜은 게놈 전체 CPG의 감소된 표현을 다룹니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기본 해상도 D-N-A-C-P-G 메틸화 데이터 생성을 위해 E-R-R-B-S 라이브러리를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이 기술을 제대로 수행하면 4일 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 고품질 DNA로 시작하고, 설명된 모든 단계를 포함하고, 권장 매개변수를 사용하여 황산수소 변환 및 염기서열분석의 효율성을 검증하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 페닐과 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 화학 물질 후드에서 작업하고 적절한 폐기물 처리와 같은 일반적인 예방 조치를 항상 취해야 합니다.

이 절차를 따릅니다. spyro sequencing 또는 mass array epitype과 같은 다른 방법을 수행하여 결과를 검증할 수 있습니다. 또한 유전자 발현 프로파일링을 수행하여 검출된 DNA 메틸화 패턴의 생물학적 중요성을 결정할 수 있습니다.

제한된 양의 입력 물질로부터 염기쌍 해상도 DNA, 메틸화 패턴을 생성할 수 있는 능력은 이전에는 불가능했던 희귀 세포 집단의 프로파일링을 가능하게 했습니다. 또한 후성유전학적 매개 조절 및 질병의 이질성을 탐구하기 위해 대규모 임상 샘플 코호트의 프로파일링을 가능하게 했습니다.