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ERRBS 보고서 원본의 모든 저자에게 감사드립니다. 기술 지원을 해주신 Mame Fall님께 감사드립니다. 기술 서비스 및 지원을 제공한 Weill Cornell Medical College Epigenomics Core에 감사드립니다. 이 작업은 Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, FGB, NIH R01HG006798 및 R01NS076465에 대한 NCI K08CA169055 및 ASH-AMFDP12005, CEM에 대한 Irma T. Hirschl 및 Monique Weill-Caulier Charitable Trusts 및 STARR Consortium(I7-A765)의 자금 지원, AMM에 대한 LLS SCORE 보조금(7006-13)의 지원을 받았습니다.

실행 모든 절차는 의학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 인디애나 대학의 승인을 건강 지침의 국립 연구소 따릅니다. 1. 수술 기법 <ol><li> 멸균 장갑, 악기, 그리고 NIH 가이드 라인 (25)에 따라 멸균 수술 필드를 사용하여이 절차를 수행하는 동안 무균 기술을 유지한다. 를 오토 클레이브에 의해 수술을 시작하기 전에 도구를 소독 (전체 목록은 특정 시약 / 장비의 표 참조). 작업 중에 도구를 소독 유리 구슬 살균기를 사용합니다. </li></ol> 2. 마취 및 준비 <ol><li> 수의학 이소 플루 란 기화기 시스템을 이용하여 0.9 L / 분의 산소 및 2.5 %의 이소 플루 란 혼합물로 마취 상자에 마우스를 마취. 마우스가 상자에서 제거하기 전에 몸의 위치 변화에 응답하지 않습니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 양해 각서 (MOU)에 안과 연고를 적용그 자체의 눈이 마르지을 보호 할 수 있습니다. </li><li> 코 콘에있는 상자에서 가스 흐름을 전환합니다. 콘 내부의 코와 입으로 수술 패드와 흡수 벤치 종이로 덮여 가열 패드의 왼쪽에 정면으로 마우스를 놓습니다. 지속적으로 마우스의 호흡 리듬과 속도를 모니터링하고 필요에 따라 이소 플루 란 레벨을 조정 - 마취의 적절한 수준을 유지하기 위해 (2.5 사이의 3 % 이소 플루 란), 총 진정 작용을 확인하기 위해 발가락 핀치 반사를 사용합니다. </li></ol> 3. 수술 적 접근 <ol><li> 맞추고 수술 필드 입체경을 초점을 맞 춥니 다. 노즈콘을 조정하고이 시야의 가장자리에 위치하도록 아래로하는 테이프. </li><li> 마우스의 왼쪽에 누워, 절개 될 것이다 귀 뒤 영역을 노출 노즈콘을 우측 귀의 가장자리를 테이프. 후방 귀의 정맥 귀 가로로 이동하는 확인하십시오. 참고 t의 정확한 위치그 동물 귀의 테이핑 신속 안면 신경을 찾기 위해 매우 중요하다. </li><li> 에 70 % 에탄올 귀 뒤에 모피 적시고 면도기 또는 메스 블레이드를 사용하여 수술 부위를 면도. 사전 습윤 모피하는이 해부학 적 위치에 쉽게 면도 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올 다음과 같은 베타 딘 수술 스크럽 (7.5 % 포비돈 요오드)와 같은 요오드 용액,로 피부를 청소합니다. 철저하게 지역을 소독이 청소를 두 번 더 반복합니다. </li><li> , 절개를 귀 돌기에 지역의 후방에 꼬리 쪽 귀에서 후방 귀의 정맥을 추적해서 결정해야합니다. 돌기에 3mm 후방 - 봄 가위를 사용하여 4mm의 절개 (2)를 확인합니다. </li><li> 무딘 절개를 이용하여 피하 지방 및 근막을 절개하다. 혈관 또는 근육 조직이 쉽게 손상 될 수 있기 때문에 가위로 직접 절단하지 마십시오. </li><li> 출혈이 발생하는 경우, 멸균 면봉으로 수술 부위에 압력을 적용적어도 30 초. 유체 상당한 손실이 발생하면, 최대 25 또는 제 27 G 바늘을 사용하여 멸균 0.9 % 식염수 용액 0.5 ml를 복강 내 주사를 마우스. </li><li> 안면 신경의 위치를​​, 몇 가지 주요 랜드 마크, 척추 부신경, 외이도를 사용하여 (아래에 설명) digastric 근육을 전방. 안면 신경의 가지가 가시화 될 때까지 이러한 랜드 마크 주위를 해부하다. 이 공개 될 때 신경은 크게 백색 고체 구조로 표시됩니다 및 근막 층이 기본 구조를 준수합니다. <ol><li> 피하 지방과 근막이 해부 된 이후, 승모근의 근육에 분포하는 두개골의 꼬리 부분에서 이동 척추 액세서리 신경을 찾을 수 있습니다. 안면 신경은 척추 부신경에 깊은이다. </li><li> 진주 흰색 보이는 안면 신경에 주동이 볼 수있는 연골 귀 운하를 찾을 수 있습니다. </li><li> 의 상단과 C에 놓여 전방 digastric 근육의 근육 배꼽 찾기안면 신경에 audal. </li></ol></li><li> 안면 신경의 가지 주요 가시화되면 stylomastoid 난원에서 기원을 찾을 등쪽 그들을 추적. 개방형 수술 부위를 보유하고있는 신경의 경로를 따라 봄 가위 팁을 발전 연 다음, 새로 고급 영역을 유지하기 위해 등쪽 집게를 이동 뾰족한 뒤몽 포셉 # 45분의 5를 사용. </li><li> 이 시점에서 광대뼈, 구강과 안면 신경의 트렁크, 변연 하악 가지를 시각화. 주 : 시간 ​​분기 난원에 가까운 발견 될 것이다. 상부 및 하부에 한계 하악 신경 가지에 가까운 턱, 따라서 그 신경 지점이 수준에서 표시되지 않습니다. <ol><li> 신경 절개를 수행하는 경우, 미세 팁 포셉으로 부드럽게 신경을 안정시키고 스프링 가위로 신경을 잘라. 뇌간의 신경을 avulsing 방지하기 위해 집게와 신경에 너무 많은 견인을 적용하지 마십시오. 푸시멀리 서로, 또는 절단 및 말초 신경의 일부를 제거에서 젊고 아름다운 여자가 재 연결이 발생하지 않도록합니다. </li><li> 호감 부상을 수행하는 경우, 모든 축삭을 절단 첫 번째 호감 사이트에 수직 인 제 2 각도로이 호감을 반복 일정한 압력을 사용하여 30 초 동안 신경을 압축 뒤몽 #에게 45분의 5 집게를 사용합니다. 그렇지 않으면 부상 동물 사이에 일관성이 없습니다, 30 초 호감 동안 압력의 변수 금액을 적용하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 4. 결산 및 복구 <ol><li> 기본 구조를 통해 지방과 근육 위치를 조정합니다. </li><li> 절개의 가장자리를 대략적인 7.5 mm 상처 클립을 사용하여 상처를 닫는다. 봉합 또는 접착제는 또한 상처 폐쇄에 대한 허용됩니다. 수술후 진통제는이 시점에 제공 될 수있다. </li><li> 마우스의 귀에서 테이프를 제거합니다. 이소 플루 란 흐름을 끄고 마우스가 1 분 30 초 동안 순수한 산소를 흡입 할 수 있습니다. PL마취에서 회복 할 수없는 침구 빈 케이지에서 마우스 에이스. </li><li> 마우스가 복구 될 때, 안면 마비의 확증 흔적이 동작을 검사합니다. 수염이 마비 다시 뺨을 향해 각도됩니다, 코가 이탈되고, 눈은 공기의 퍼프에 대한 응답으로 깜박하지 않습니다. </li><li> 주택의 동물 공동 수술 후 그들은 여성의 경우. 그들은 더 공격적 강제 감염에 이르게 자신의 cagemate의 상처 클립을 제거하는 경향이 있기 때문에 공동으로 남성 쥐를 수용하지 마십시오. 필요한 경우,이 시점에서 수술후 진통제를 제공한다. </li><li> 어떤 감염 또는 기타 합병증은 수술 후 발생하지 않도록 수술 후 며칠 동안 하루에 한 번 마우스를 모니터링합니다. 그들은 자신에 타락하지 않은 경우 수술 10 일 - 상처 클립 (7)를 제거합니다. </li><li> 눈 깜빡임이 재 할 때까지, 매일 각막 합병증을 방지하기 위해 영향을받는 눈에 눈 연고를 윤활 적용적용 또는 안락사까지. </li></ol>

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

생물학적으로 관련 게놈 영역에서 시토신 메틸화의 프로토콜을 제시 수익률의 염기쌍 해상도 데이터. 출발 물질 50 NG 최적화되어 작성된 프로토콜은, 그러나, 입력 범위의 재료 (5 NG 이상) (26)을 처리하도록 적응 될 수있다. 표 6에서 볼 수 있듯이이 프로토콜의 일부 단계의 조정을 필요로 할 것이다. ERRBS 라이브러리는 시퀀싱에 의해 달성 될 수있는 한 쌍의 단부 및 상기 게놈 시퀀싱 따르면 의무가있는 더 긴 51 회 이상의 판독한다. 샘플 당 낮은 비용 프로토콜을 제안 할 것이다 다중화 순서는, 그러나, 이것은 데이터 (도 5 및 표 8)에 표현 된 CpG 사이트 당 감소 따르면 초래할 것이며, 당 높은 커버리지를 요구 분석을 수행하기에 따르면 충분한 깊이를 산출하지 않을 (랜댄 등. (33)에 의해 설명 된 바와 같이 예 :)의 CpG 사이트. 마지막으로,이 프로토콜 (또는 중아 기반 protoco난) 메틸 시토신과 하이드 록시 메틸 시토신 (46, 47) 사이에 구별 할 수 없습니다. 그러나, 다른 프로토콜로 통합 될 수있는 데이터를 생성 다른 변형을 묘사하는 48,49 결과, 시토신 및 다른 변형들이 최근 관심이어야 50을보고했다. 그림 3 세대 (빨간색 추적) 모두 라이브러리 분수에서 동일한 몰 기여를 나타내는과 같이 그림 3A-C에 표시하고, 한 번 시퀀싱 풀 추적을 산출로 높은 품질의 라이브러리가 표시됩니다. 도서관 준비 실패는 절차를 수행하는 동안 모든 단계에서 발생할 수 있습니다. DNA 분해 처리되어 있으면이 프로토콜에 기재된 순서 변수를 이용하여 낮은 커버리지의 CpG 따라서 MspI 단편 및 농축되지 않은 라이브러리 초래할 것이다. 효소가 비 기능적 또는 부주의 한 반응에서 제외되면, 프로토콜은 예상 라이브러리를 산출하지 않는다. 결찰 것이란 경우ction의 비효율적이며, 어댑터는 예상보다 더 높은 농도로, 그리고 / 또는 사용 된 프라이머 농도가, 최종 증폭 단계에 대한 제한적인 시약이고, 라이브러리 오류가 발생할 수있다. 때문에 라이브러리와 과잉 어댑터 모두의 무차별 적 클러스터링 또한 시퀀싱을 방해 라이브러리 (도 3D-F bioanalyzer 결과에 ~ 150 BP에서 피크로 본) 초과 어댑터. 이러한 라이브러리 명백하게 정상적으로 시퀀스 수 있지만, 상당 부분은 단지 어댑터 서열 것이다 읽는다. 과량 어댑터 라이브러리에서 관찰되는 경우, 재료는 수량 비율 어댑 최적 입력 재료를 이용 가능한 경우 라이브러리 제조를 반복하는 것이 최상이다. 마지막으로, 라이브러리의 PCR 증폭 효율을 보장하기 위해, 상기 하부 및 높은 라이브러리 분획물 변환 비설 파이트 및 PCR 농축 단계에 걸쳐 별도의 샘플로 유지된다. 그렇게하지 ​​않으면 P 동안 증폭 차동 효율을 산출CR의 (그림 3G 파란색 추적에서 볼 수 있듯이) 높고 낮은 분수의 반응 및 시퀀싱 동안 각 라이브러리 부분에 언급 한 각각의 게놈 유전자 좌의 불평등 한 표현의 가능성. 사용자는 라이브러리가 생성되는 증폭하기 위해 필요한 최적의 PCR 사이클의 추가적인 적정 중아 변환 후 즉시 정량적 PCR 공정을 포함하는 것을 선택할 수있다. ERRBS 도서관 준비 프로토콜은 특정 시약을 권장하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 최종 수리 공정에서, 네 개의 뉴클레오티드의 dNTP 혼합의 사용은 MspI 효소 등급 활성 및 원래 DNA 샘플에 존재하는 전단 된 DNA 단편으로부터 얻어진 것과 CG 오버행을 함유하지 않는 임의의 제품의 최종 수리를 허용한다. 이 결과에서 개선의 CpG 표현 초래한다. 결찰 단계에서 그것은 보장 고농도 리가 제 (200 단위 / ml) 및 메틸화 어댑터를 사용하는 것이 중요하다는 결찰를 Reacti에 효율적이고 중아 변환은 정확한 데이터의 위치 맞춤을위한 필수적인 어댑터 서열에 영향을주지 않는다는 것을. PCR 단계에서 바이 설 파이트 처리 GC가 풍부한 DNA 단편을 증폭 할 수있는 중합 효소를 사용하여 높은 특이성에 대한 필요가있다. 마지막으로, 과량의 어댑터 및 프라이머의 제거를 보장하기 위해, (예 : Agencourt AMPure XP) SPRI 비드 정제 결찰 및 PCR 생성물 아이솔레이션 용 칼럼 기재 분석법 아닌 권장된다. 고품질의 데이터를 생성하기 위해서는, 바이 설 파이트 변환 효율을 보장하는 것이 중요하다. 표시 제어부는 유저에게 시퀀싱 전에 변환 효율을 결정하는 능력을 제공한다. 대안으로, 람다 DNA와 같은 비 - 인간 DNA는 내부 제어 (스파이크)에서 사용될 수있다. 인해 종의 차이에 따라, 이런 종류의 제어가 직접 시퀀싱 하류에 포함될 수있다 (예를 들면 유 의해 사용되는 바와 같이, 등. 34). 그러나, 스파이크의 난 경우이용 S, 이는 고유 증폭 독립적 라이브러리 시퀀싱 전에 서열화 않는 라이브러리 시퀀싱 이전에 변환 효율을 결정하기 위해 사용될 수 없다. 결정 전환율은 비의 CpG 사이트에서 메틸화 상태를 기준으로합니다. 이것은 (예를 들어 배아 줄기 세포) 이외의 CpG 컨텍스트와 평행 샘플 또는 이러한 목적을 위해 이용 될 수 변환 효율을 평가하는 다른 수단이 높은 사이토 신 메틸화의 맥락에서 사용하기에 적합하지 않을 수있다. ERRBS 라이브러리의 순서에 고유 한 주소로 몇 가지주의해야 할 점이있다. 서열 라이브러리 분획 처음 세 염기 인해 MspI 인식 컷 사이트를 거의 균일하게 비 - 랜덤 (C ^ CGG도 4B, C 참조). 때문에 낮은 품질에 중요한 데이터 손실의 가능성이 결과는 순서 동안 명백한 높은 클러스터 밀도에도 불구하고 가난한 클러스터 현지화로 인한 읽습니다. 이 장벽을 극복하기 위해,전용 제어 차선으로 독립적 인 레인 (PhiX 제어 또는 다른 라이브러리 유형)에서 높은 복잡성 라이브러리를 포함한다. 높은 복잡성 라이브러리는 서열 처음 네 기지에서 A, C, T와 G의 균형 표현을 포함한 끝이있다. 적절한 제어 차선은 RNA-SEQ, 칩 서열, 전체 게놈 시퀀싱, 또는 시퀀싱 장비 제조업체 (예 : PhiX 제어 V3)에 의해 제공되는 제어와 같은 라이브러리를 포함한다. 각각의 시퀀싱 런 제어 차선으로 지정되면, 클러스터 위치를 검출하는 순서의 최초의 DNA 염기 중에 이용되는 행렬 생성을위한 기초로서 기능 할 수있다. 높은 품질로 된 CpG 사이트 당 평균 범위를 올릴 캡처 읽기 5.2 (N = 4). 대안 적으로, 기술적 인 어려움이 또한 앞서 설명한 바와 같이 23 어두운 시퀀싱 방법을 사용하여 극복 될 수있다. 다른 염기 서열 기준은 제조사의 프로토콜에 따라 표준 운영 절차를 따르십시오. CpG 디 C 당 마지막 따르면데이터 분석을위한 호센 관심 생물학적 질문하여 사용자에 의해 부분적으로 유도 될 것이다. 10 배의 커버리지는 높은 임계 범위 분석 방법 그러나이 임계 값은 그 관심이어야 낮아질 수를 제공한다. ERRBS 데이터 분석의 전체 논의는하지만, 차별적 메틸화 된 시토신와 지역은 오픈 소스 도구 31,51-53를 사용하여 결정할 수있다,이 문서의 범위를 벗어납니다. 추가 고려 사항 및 분석 방법은 54, 55을 잘 설명되어 있고, 리더는 계획된 분석에 가장 적합한 도구 문헌을 검색 할 것을 권장한다. 게시 된 다른 방법에 비해, ERRBS 재현성의 설명 수익률 높은 속도로 수행 나흘 간 프로토콜을 제공합니다. 그것은 MassARRAY EpiTYPER 26 일 표준 금에 비교 검증되었습니다, 비용 효율적인 커버력이 높은 데이터이며, 다양한 입력 자료에 대한 적응력시퀀싱 방법 (낮은 주파수의 임상 샘플 처리 및 다른 세포 유형에 유리한) 양. 그것은 게놈 전체의 전사 조절 인자 결합, 크로 마틴 리모델링, 후생 유전 학적 마크와 관심의 다른 시토신 수정을 프로파일 링 다른 기술과 분석 생물학적으로 관련 유전자좌에서 염기쌍 해상도를 제공하며, 통합 사용할 수 있습니다. 이러한 연구에서 ERRBS 데이터 사용은 포괄적 인 분자 접근에 기여 차원 생물학적 모델과 인간 질병의 연구에서 분석에 대한 높은 허용 할 수 있습니다.

시토신 (5- 메틸 시토신)에서 DNA 메틸화는 생물학적 과정의 다양한 포유 동물 세포에서 중요한 포함하지만 임프린트, X 염색체 불 활성화, 개발 및 유전자 발현 조절 1-8에 한정되지 후생 유전 학적 마크이다. 악성 질환 및 기타 질환에서의 DNA 메틸화 패턴의 연구는 질병 특정 패턴을 결정하고 질병의 발병 기전과 잠재적 인 바이오 마커 발견 9-17의 이해에 기여하고있다. DNA 메틸화 상태를 가지로 구분을 심문하는 프로토콜이있다. 이들은 선호도 기반으로 분할 될 수 있고, 제한 효소 기반 및 하류 마이크로 어레이 또는 시퀀싱 플랫폼을 활용 중아 변환 - 기반 분석법. 또한, 다음과 같은 일반적인 범주에 포함되지만, 결합 바이 설 파이트 제한 분석 (18)에 한정 표현 바이 설 파이트 시퀀싱 (RRBS 19) 감소하지 다리를 몇 가지 프로토콜이있다. </P&gt; RRBS는 원래 마이스너 등. (19, 20)에 의해 설명되었다. 이 프로토콜은 비용 (21, 22) 효과가 정량적 염기쌍 해상도 데이터 결과 바이 설 파이트 시퀀싱, 다음 GC 풍부한 게놈 영역을 풍부하게하는 단계를 소개했다. GC 풍부 영역들은 MspI (C ^ CGG) 제한 효소에 의해 대상으로하고 시토신 메틸화는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 이어 시토신의 중아 변환 (우라실 변성 시토신의 탈 아미 노화)에 의해 해결된다. RRBS 유전자 프로모터 및 전체 게놈에 필요한 순서의 일부에서의 CpG 섬의 대부분을 커버; 그러나 RRBS는 CpG 디 해안과 생물학적 관련성의 다른 유전자 간 지역의 제한 범위를했다. 몇몇 그룹은 이러한 게놈 지역 23 ~ 25의 방법론과 결과 범위를 개선 원래의 보고서 이후 RRBS 프로토콜을 업데이트 게시 한. 향상된 감소 표현 바이 설 파이트 Sequencing (ERRBS)는 RRBS에 비해 라이브러리 준비 수정 및 대체 데이터 정렬 방식 (26)를 포함한다. ERRBS는 생성 된 데이터로 표현 CpGs 더 많은 수의 결과와 모든 게놈 영역의 범위가 26 심문 증가했다. 이 방법은 인간 및 기타 동물 환자 검체 26-30에서 DNA 메틸화 패턴을 확인하는 데 사용되어왔다. ERRBS 프로토콜 완료 대표적인 인간 DNA를 이용하여 생성 된 데이터에 필요한 모든 단계에서 이벤트 정보를 기재 (샘플은 이전에보고 된, 디 식별 환자 샘플 (31)로부터 얻어지고, 정상적인 인간 공여자로부터의 CD34 + 골수 샘플 하였다). 프로토콜은 샘플 당 처리 시간을 감소시키고, 라이브러리 크기 선택의 정확도 향상을 가능하게하는 자동 사이즈 선택 프로세스를 포함한다. 프로토콜은 수립 분자 생물학 기법을 결합한 계열. 고 분자량의 DNA를 소화 w최종 수리, A-미행하고, 메틸화 된 어댑터의 결찰 다음에 메틸화를 구분하지 않는 제한 효소 (MspI) i 번째. GC 풍부한 단편의 사이즈 선택은 바이 설 파이트 변환 및 시퀀싱 전에 PCR 증폭 이어진다. 중아 변환 이전에 있었다 (32) 기술과 데이터 분석 및 응용 프로그램의 상세한 검토를 권고하고 참조가 독자를위한 부분 포함되어 있지만이 문서의 범위를 벗어했다. 이 프로토콜은 사일을 통해 수행과 작은 입력 (50 NG 이하) 재료 양의 의무가 될 수있다. 차동 메틸화 사이트 및 영역에 대한 결정뿐만 아니라 후생 유전 학적 다형성 검출뿐만 아니라 충분한 된 CpG 사이트 당에 따르면 높은 수율로 설명 데이터로서 프로토콜, 등. 33 랜댄 기재된 바와 같이.

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100,000 units/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>MspI 효소용 반응 버퍼; 프로토콜 단계 1.2</td></tr><tr><td>페놀 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>10&nbsp와 평형; mM 트리스 HCl, pH&nbsp; 8.0; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>의 안전 및 취급 지침 참조 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5.2</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>의 안전 및 취급 지침 참조시그마 - 알드리치</td><td>E7023</td><td>200 증거, 분자 생물학</td></tr><tr><td>버퍼 EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td></tr><tr><td>트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>T1503</td><td>1M, pH 8.5 용액</td></tr><tr><td>트리스 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (TE)</td> <td>시그마 -알드리치</td><td>T9285</td><td>제조 제조업체의 권장 사항에</td></tr> <tr><td>따라 1x 버퍼 용액으로 희석T4 DNA 리가아제 반응 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>10x 농도</td></tr><tr><td>데옥시뉴클레오티드 삼인산(dNTP) 용액 혼합물</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>각 뉴클레오티드 10mM</td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3,000 units/ml</td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I, 대형(Klenow) 단편</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5,000 units/ml</td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10,000 units/ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>프로토콜 단계 2.3에서 DNA 산물 정제에 사용</td></tr><tr><td>2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate (dATP)</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr; 5' 엑소-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5,000 units/ml</td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>프로토콜 단계에서 DNA 산물 정제에 사용 3.3</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2,000,000 units/ml</td></tr><tr><td>메틸화 어댑터 올리고 키트</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>마그네틱 비드 정제 단계(단계 4.3 및 8.2)를 구현하는 프로토콜 섹션에 사용됩니다. 사용하기 전에 실온과 동등하게 하십시오.</td></tr><tr><td>Pippin Prep 젤 카세트, 2% 아가로스, 염료 무함유</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>내부 표준</td></tr><tr><td>인증 저범위 울트라 아가로스</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA(TBE) 완충액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 bp DNA 래더</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA 사다리</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>젤 로딩 염료, 오렌지 (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>메스&nbsp; 블레이드&nbsp; 아니오&nbsp; 11</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA 메틸화 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td>프로토콜 단계 6.2</td></tr><tr><td>EZ DNA 메틸화-라이트닝 키트</td><td>에 사용됨 Zymo Research</td><td>D5030</td><td>6.2단계의 대안</td></tr><tr><td>Universal Methylated Human DNA Standard</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>중아황산염 변환 제어로 사용</td></tr><tr><td>FastStart High Fidelity PCR 시스템</td><td>Roche</td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 고감도 분석 키트</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>형광 기반 DNA 정량 분석, 프로토콜 단계 1.1, 9.1 및 10.1</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>고감도 DNA 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 바이오분석기</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 형광계</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR 클러스터 키트 v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA 시료 전처리</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>다중화 라이브러리에 사용되는 바코드 어댑터; 다중화 프로토콜에 대한 추가 파일을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>와류 믹서</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>드라이 블록 히터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 순환기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>젤 전기 영동 시스템</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>전기 영동 전원 공급 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>젤 독</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV 또는 블루라이트 투과광</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

자료 쌍 해상도에서 dna 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA 메틸화 패턴 매핑은 크게 정상 및 병에 걸린 조직에서 연구되고있다. 다양한 방법이 세포에서 시토신 메틸화 패턴을 심문하기 위해 설립되었다. 전체 게놈 서열의 중아 감소 표현 GC 풍부한 게놈 유전자좌 양적 염기쌍 해상도 시토신 메틸화 패턴을 검출하기 위해 개발되었다. 이 바이 설 파이트 변환이어서 제한 효소의 조합을 사용함으로써 달성된다. 향상된 감소 표현 바이 설 파이트 시퀀싱 (ERRBS)가 적용되는 생물학적으로 관련 게놈 궤적을 증가시키고 인간, 마우스 및 다른 생물의 DNA에서 시토신 메틸화을 프로파일 링하는 데 사용되었습니다. ERRBS 라이브러리 제조에 사용하기위한 저 분자량의 단편을 생성하는 DNA의 제한 효소 절단함으로써 시작된다. 이 조각은 차세대 시퀀싱을위한 표준 라이브러리 건설을 실시한다. 최종 amplificati 이전에 비 메틸화 된 시토신의 중아 변환단계에 덮여 게놈 유전자 좌에서 시토신 메틸화 수준의 양적 기본 해상도 수 있습니다. 이 프로토콜은 네 일 이내에 완료 할 수 있습니다. 지정된 시퀀싱 제어 레인 사용시 서열화 처음 세 염기 낮은 복잡성에도 불구 ERRBS 라이브러리는 고품질의 데이터를 얻었다. 매핑 및 생물 정보학 분석 수행된다 수율 데이터 용이 게놈 넓은 다양한 플랫폼과 통합 될 수있다. ERRBS는 가능한 연구 어플리케이션의 범위에서 인간 임상 샘플 및 해당 사항을 처리 할 수​​있게 작은 입력 재료 수량을 이용할 수있다. 생성 된 비디오는 ERRBS 프로토콜의 중요한 단계를 보여줍니다.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing은 시토신 중아황산염 변환과 결합된 제한 효소 분해를 기반으로 DNA 메틸화 분석을 위한 염기서열분석 라이브러리를 준비하는 방법입니다. 이 프로토콜은 50ng의 시작 물질이 필요하며 GC가 풍부한 게놈 영역에서 염기쌍 분해능 데이터를 생성합니다.

자료 쌍 해상도에서 DNA 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

이 절차의 전반적인 목표는 염기쌍 분해능 D-N-A-C-P-G, 아황산염 전환에 의한 시토신과 결합된 제한 효소 분해를 기반으로 하는 메틸화 분석을 위한 염기서열분석 라이브러리를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 고품질 DNA의 MSP one 제한 효소 분해를 수행한 다음 말단 복구, 메틸화 어댑터의 테일링 및 결찰을 수행하여 수행됩니다. 다음 단계는 아황산염 변환 후 선택된 단편 크기에 대해 아황산염 변환을 수행하는 것입니다.단편은 PCR을 사용하여 증폭됩니다. 마지막 단계는 품질 관리 및 염기서열분석을 수행한 후 데이터 시각화 및 분석을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 이중 아황산염 염기서열분석의 향상된 감소된 표현은 CG가 풍부한 게놈 유전자좌에서 시티딘 메틸화 패턴의 정량적 염기쌍 분해능을 검출합니다.마이크로어레이와 같은 다른 DNA 메틸화 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 염기쌍 분해능 및 생물학적으로 관련된 부위에서 높은 커버리지 D-N-A-C-P-G 메틸화 데이터를 생성하기 위해 소량의 입력 물질 수량을 활용할 수 있다는 것입니다. 우리는 전통적인 분석법에서 다루는 영역을 넘어 후성유전학적 패턴을 탐구하는 데 관심이 있었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 우리는 마이크로어레이에서 다른 차세대 기술에서 생성된 데이터와 통합될 수 있는 염기쌍 해상도 DNA 메틸화 데이터 생성으로 전환하기 위해 이 기술을 개발하는 데 관심이 있었습니다.이 방법은 후성유전학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 후성유전학적 패턴화(epigenetic patterning)와 생물학적 샘플의 이질성(heterogeneity in biological samples)이 정상 대조군 또는 다른 질병 상태와 비교됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 절차의 길이, 수많은 특정 요구 사항 및 Mamie fall을 생성한 라이브러리의 고유한 염기서열 분석 특성으로 인해 어려움을 겪을 것입니다.우리 실험실의 연구 전문가가 이 프로토콜을 시작하는 절차를 시연하는 데 도움을 줄 것입니다. 먼저, MSP 1 제한 효소 분해, 평활화 말단 복구 반응 및 3 프라임 말단에서 단일 뉴클레오티드 추가를 거친 게놈 DNA 샘플의 정제된 분취액을 준비합니다. 이 시점에서 DNA 산물은 어댑터 결찰을 시작하여 10마이크로리터의 A-A-L-D-N-A 샘플을 0.2ml PCR 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓을 준비가 됩니다.또한 어댑터 분자의 부분 표본을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 얼음 위에서 결찰 시약 혼합물을 준비합니다. 결찰 시약과 어댑터 분자를 DNA 샘플에 모두 추가하고 몇 차례 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.PCR 튜브를 열 순환기에 넣고 다음 날 섭씨 16도에서 밤새 결찰 반응이 진행되도록 합니다. 마그네틱 비드 또는 실리카 컬럼 기반 고체상 DNA 추출 키트를 사용하여 접합 산물을 정제합니다. 정화 과정의 마지막 단계에서.30마이크로리터의 DNA 자유수를 첨가하여 DNA를 용리합니다. 정제된 DNA 산물은 25나노그램 이상의 총 DNA로 시작하는 샘플에 필요할 때까지 섭씨 음의 20도에서 보관할 수 있습니다. PI 및 prep과 같은 자동 겔 추출 장치를 사용하여 길이가 150 염기쌍에서 400 염기쌍 사이인 결찰 산물을 선택합니다.Ethereum bromide 또는 cyber green과 같은 DNA 시각화 염료는 포크 어댑터 결합 단편의 DNA 이동 특성을 변경할 수 있으므로 agros cassette에서 제외해야 합니다. 표준 agros gel-based size selection protocol은 pippin 2%free-dye-apart cassette에서 DNA 전기영동을 설정하기 위한 프로토콜의 이 단계에도 사용할 수 있습니다. Pippin Prep 콘솔에서 새 프로토콜을 생성하고 2%DF marker L 옵션을 선택한 카세트로 선택합니다.그런 다음 use internal standards(내부 표준물질 사용) 옵션을 활성화하고 150개의 염기쌍 및 400개의 염기쌍에 이르는 DNA 단편을 분리하기 위한 레인 번호가 레인 번호와 일치하는지 확인합니다. 범위 옵션을 수집 모드로 선택하고 기본 쌍 시작의 경우 135, 기본 쌍 끝의 경우 410, 기본 쌍 발의 경우 240 제한 매개변수를 입력합니다. 이것은 장치가 전기 영동 필드를 전기 용리 출력 포트에 정렬하도록 지시합니다.해당 범위 내의 DNA 조각이 배출구 근처로 이동할 때. 프로토콜 파일을 저장한 후 기기 설정 시 Pippen Prep의 표준 작동 절차에 따라 기기의 겔 카세트와 샘플 로딩 웰을 준비합니다. 주어진 결찰 후 샘플의 30 마이크로리터 분취량에 10 마이크로리터의 DNA 마커를 추가하여 혼합물을 겔 카세트에 로드하여 전기영동을 위한 DNA 샘플을 준비합니다.먼저 각 샘플에서 40마이크로리터의 전기영동 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 각 40마이크로리터 샘플 마커 혼합물을 개별 웰에 피펫팅하여 부피를 교체합니다. Console로 돌아가서 저장된 프로토콜을 로드하고 start를 눌러 전기영동을 시작합니다.프로그램이 240 염기 쌍에 도달하면 일시 중지 단계에서 피펫을 사용하여 각 출력 포트에서 40마이크로리터의 출력을 수동으로 수집합니다. 이 fractions를 lower library fraction(하위 라이브러리 분수)으로 레이블을 지정합니다. 하부 라이브러리 분획을 수집한 후 즉시 40마이크로리터의 새 전기영동 버퍼를 추가하여 배출 포트를 세척합니다.버퍼를 최소 세 번 위아래로 피펫팅한 다음 snet을 흡인합니다. 이 세척을 두 번 더 반복하여 배출구에서 짧은 길이의 DNA 종의 모든 흔적을 제거합니다. 이제 샘플에 40마이크로리터의 전기영동 버퍼를 추가합니다.elucian 포트를 잘 밀봉하고 run 버튼을 눌러 elucian 프로세스를 다시 시작합니다. 410 염기쌍 설정에서 Ellucian 프로그램을 완료하면 모든 배출 포트에서 40마이크로리터의 이누이트를 수집하고 이 분획을 상위 라이브러리 분획으로 표시합니다. 이 시점에서 두 라이브러리 분획은 모두 겔 정제되었으며 이미 이중 아황산염 전환을 위해 사용됩니다.시중에서 판매되는 키트를 사용하여 두 라이브러리 분획에 대해 bi-sulfite conversion assay를 수행합니다. 변환 과정의 마지막 단계에서 DNA 샘플을 40마이크로리터의 DNA 자유수로 용리시킵니다. 비스무아황산염 변환 후, 생성된 DNA 라이브러리 단편은 각 DNA 분자의 어댑터 말단에서 혼성화되는 프라이머를 사용하여 농축 PCR 증폭을 거칩니다.농축 PCR을 먼저 준비하기 위해 황화물 변환 샘플의 40마이크로리터 분취액당 160마이크로리터의 PCR 마스터 믹스를 추가합니다. 그런 다음 생성된 200마이크로리터 혼합물을 4개의 50마이크로리터 분취액으로 나눕니다. 별도의 PCR 튜브에서.튜브를 열 순환기에 넣고 변환된 DNA 템플릿을 증폭합니다. 농축 후 4개의 post PCR 산물을 단일 1.5ml 튜브로 끌어당기고 상용 PCR 클린업 키트로 DNA를 정제합니다. PCR 산물을 정제하기 위해 마그네틱 비드 고체상 추출 키트를 사용하는 경우, 먼저 결합된 하부 라이브러리 PCR 산물을 총 부피의 1.7배인 비드와 혼합하여 표준 운영 절차를 수정합니다.그런 다음 결합된 상부 라이브러리 PCR 산물을 총 부피의 1.1배인 비드와 혼합합니다. 그런 다음 정제 공정의 마지막 단계에서 각 세척량을 800마이크로리터로 변경해야 하는 70% 에탄올 세척 단계까지 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 50마이크로리터의 DNA가 없는 용리 완충액으로 DNA를 용리합니다.이중 가닥 DNA에 대해 선택적인 형광 기반 분석을 사용하여 필요할 때까지 정제된 라이브러리를 섭씨 영하 20도에서 보관하고 각 라이브러리 분획에 대한 농축 후 DNA 함량의 양을 정량화합니다. 또한 bioanalyzer로 농축 후 라이브러리 크기와 품질을 평가합니다. 염기쌍으로 표현된 평균 DNA 길이를 사용하여 특정 라이브러리 분획의 유효 DNA 몰 농도를 계산합니다.몰 농도가 알려지면 DNA의 자유수를 사용하여 해당 상부 및 하부 라이브러리 분획을 각각 2개의 나노몰 최종 농도로 희석합니다. 하부 및 상부 라이브러리 쌍을 단일 튜브로 결합하여 각각 20마이크로리터에서 두 개의 나노몰 구멍 라이브러리 혼합물을 생성합니다. 이제 풀링된 샘플이 염기서열분석을 실행할 준비가 되었습니다.E-R-R-B-S를 포함한 염기서열분석 관련 분석에서 상부 및 하부 라이브러리 분자의 품질 및 크기 분포는 최종 염기서열분석 데이터의 품질을 결정하는 핵심 요소입니다. 기존의 수동 겔 추출 프로토콜과 비교할 때, E-R-R-B-S 프로토콜에 사용되는 자동 겔 추출 장치는 일관된 크기 분포를 생성하고 교차 샘플 오염 가능성을 최소화합니다. 다음으로, 염기서열분석을 위해 BIS 아황산염으로 변환된 라이브러리 분자를 보낼 때 모든 DNA 가닥의 원시 데이터는 주어진 가닥에 대해 각 뉴클레오티드 위치에 대한 데이터 품질이 처음 3개의 뉴클레오티드 직후에 극적으로 증가한다는 것을 보여줍니다.이 세 가지 뉴클레오티드에 대한 합의 서열이 대다수의 라이브러리 분자에 대해 CGG로 설정되었기 때문에 데이터는 E-R-R-B-S 프로토콜이 주로 측면에 있는 바람직한 게놈 단편 세트를 포함하는 라이브러리 컬렉션을 생성했음을 시사합니다. MSP를 사용하면 하나의 제한 다이제스트가 조감도에서 끝납니다. E-R-R-B-S 프로토콜은 전체 게놈에 걸쳐 시티딘 메틸화 부위의 염기쌍 분해능 데이터를 생성할 수 있습니다.예를 들어, 염색체 12가 여기에 표시됩니다. 이 프로토콜은 게놈 전체 CPG의 감소된 표현을 다룹니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기본 해상도 D-N-A-C-P-G 메틸화 데이터 생성을 위해 E-R-R-B-S 라이브러리를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이 기술을 제대로 수행하면 4일 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 고품질 DNA로 시작하고, 설명된 모든 단계를 포함하고, 권장 매개변수를 사용하여 황산수소 변환 및 염기서열분석의 효율성을 검증하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 페닐과 클로로포름으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 화학 물질 후드에서 작업하고 적절한 폐기물 처리와 같은 일반적인 예방 조치를 항상 취해야 합니다.이 절차를 따릅니다. spyro sequencing 또는 mass array epitype과 같은 다른 방법을 수행하여 결과를 검증할 수 있습니다. 또한 유전자 발현 프로파일링을 수행하여 검출된 DNA 메틸화 패턴의 생물학적 중요성을 결정할 수 있습니다.제한된 양의 입력 물질로부터 염기쌍 해상도 DNA, 메틸화 패턴을 생성할 수 있는 능력은 이전에는 불가능했던 희귀 세포 집단의 프로파일링을 가능하게 했습니다. 또한 후성유전학적 매개 조절 및 질병의 이질성을 탐구하기 위해 대규모 임상 샘플 코호트의 프로파일링을 가능하게 했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

DNA의 methylation 분석을위한 황금 표준 bisulphite 변환 DNA의 게놈 시퀀싱 수 있습니다. 이 방법은 산성 조건 하에서 deamination을 bisulphite 5 - methylcytosine (5 멕)과 비교 사이 토신의 증가 감도 활용합니다. Unmethylated cytosines는 대상 게놈의 DNA의 PCR 증폭 후 methylated cytosines 구별하실 수 있습니다.

의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

초기 생활 스트레스시의 DNA methylation 및 유전자 발현 변화를 공부하는 능률적인 작업 흐름이 나타납니다. 갓 태어난 생쥐와 이산 뇌 조직의 고립 모성 분리 월부터, 우리는 동시에 후속 bisulfite의 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을위한 두뇌 조직 펀치에서 DNA와 RNA를 분리하기위한 프로토콜을 나타냅니다.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

이 비디오는 위장암 샘플에서 게놈 DNA의 중아황산염 변형 절차를 보여줍니다. 이 기술은 유전자의 메틸화 패턴 사이의 관계를 조사하고 발암에 대한 유전자의 기여도를 확립하는 데 유용합니다.

게놈 DNA의 중아황산염 변환: 위장관 암 조직의 게놈 DNA 샘플에서 DNA 메틸화를 연구하는 방법

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

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여기, 우리 프로토콜 및 관련 만성 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인을 쥐 모델을 사용 하 여 메 틸 Seq, epigenomic 플랫폼의 구현을 설명 합니다. 결과 쥐 메 틸-Seq 플랫폼은 쥐에서 스트레스 노출에서 발생 하는 메 틸 화 차이 감지 수를 보여 줍니다.

쥐 메 틸-Seq 플랫폼 관련 스트레스에 노출 된 후 변경 내용을 확인 하

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서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

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