형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

다음 실험의 전반적인 목표는 새로운 독감 유전자, DNA, Zyme 프로브 먼저 완전한 유전자 DNA를 사용하여 대장균과 같은 특정 박테리아의 존재를 신속하게 검출하는 것입니다. Zyme 프로브는 접합에 의해 생성됩니다. 그런 다음 박테리아를 배양하여 표적 분자의 수를 풍부하게 하고 상층액에서 누적된 세포 외 혼합물을 준비합니다.

그런 다음 조잡한 세포 외 혼합물을 DNA 자임 프로브와 결합하고 DNA 자임 프로브와 표적 분자 간의 상호 작용으로 프로브를 절단한 다음 형광을 사용합니다. 프로브와 타겟 사이의 형광계 상호 작용은 상대 형광의 증가로 간주됩니다. 그런 다음 변성 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 사용하여 결과를 검증합니다.

PCR 또는 항체 기반 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 절차가 더 간단하고 수행하기 쉽다는 것입니다. 이 방법은 모델 박테리아 e coli와 함께 개발되었지만 다른 식품 매개 또는 원내 세균 병원체의 검출에 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 합성 DNA 프로브 및 박테리아의 취급에 익숙하지 않을 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 실험실의 연구 조교인 Sergio Aguire와 이 프로토콜의 박사후 연구원인 Monso Ali입니다.

R-F-D-E-C 하나는 주요 DNA Zyme입니다. 그것은 촉매 서열 EC로 구성되며, 하나는 검은 색으로 밑줄이 그어져 있고 기질 서열 FS는 녹색으로 밑줄이 그어진 기질 내에 포함되어 있으며, F로 표시된 DT와 대기열로 표시된 DT로 표시된 청색 r로 표시된 RNA 연결과 대기열 RF SS에 의해 표시된 QUENCHER 레이블 DT는 RFD EEC의 스크램블 버전이며, 여기서 촉매 서열 EEC 1은 부분적으로 SS 1로 섞여집니다. 그러나 FS 한 부분은 변경되지 않습니다. RF DEC one 및 RF SS one은 올리고뉴클레오티드 FS one과 올리고뉴클레오티드 EC one 또는 SS one의 주형 매개 효소 결찰에 의해 만들어지며, R-F-D-E-C의 표적으로 사용될 조잡한 세포외 혼합물 또는 cems를 준비하기 위한 결찰 주형으로 LT one의 존재 하에 피펫 건을 사용하여 2ml의 LB를 14ml 배양 튜브에 분배하는 것으로 시작합니다.

다음으로, 멸균 피펫 팁을 사용하여 오거 플레이트에서 대장균 단일 콜로니를 선택하고 lb가 들어 있는 배양 튜브에 떨어뜨립니다. 튜브를 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 넣고 배양 후 14시간 동안 250RPM으로 흔듭니다. 1% 접종 배양을 생성하려면 14ml 배양 튜브에 2ml의 신선한 LB를 분배하고 이전 단계에서 20마이크로리터의 박테리아 배양을 추가합니다.

각 박테리아 용액이 약 한 번의 전달로 OD 600에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 250RPM으로 흔들면서 튜브를 배양합니다. 각 배양액 1ml를 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 넣고 11, 000 G에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛화합니다. 스핀 후 투명 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

상등액은 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 형광 신호가 DNA 효소와 조세포 추출물의 상호 작용으로 생성되는지 여부를 결정하는 데 즉시 사용되지 않는 경우 샘플은 스펙트럼 측광법으로 분석됩니다. 형광 분광 광도계를 켜고 488나노미터에서 여기와 520나노미터에서 방출로 데이터 수집 매개변수를 설정합니다.

또한 1시간 동안 1분마다 판독값을 가져오도록 기기를 설정합니다. 3개의 석영 결정 큐벳을 먼저 증류수 탈이온수로 세척한 다음 100% 에탄올로 세척합니다. 질소 가스를 번쩍여 큐벳을 건조시킵니다.

큐벳을 C로 표시하고, 1 : 대조군, 2 : C, 2 : 대조군 2 및 T로 라벨을 붙이고, 다음으로 24 마이크로 리터의 증류수를 C 1 및 24 마이크로 리터의 준비된 대장균 원유 세포 외 혼합물을 C 2로 옮기고 T.2 X RB의 25 마이크로 리터를 각 Q 수의사에게 추가하고 형광 분광 광도계에 놓습니다. 5분 후에 형광 데이터 수집을 시작하고, 5마이크로몰 RFS S 1에서 C 2 및 5마이크로몰 1마이크로리터, RFD eec 1에서 T 및 C 1로 구성된 1마이크로리터를 추가하여 형광 판독이 중단되지 않도록 합니다. 피펫팅으로 각 용액을 혼합한 다음 나머지 획득 기간 동안 반응이 계속되도록 합니다.

데이터를 Excel 파일 형식으로 저장합니다. 그런 다음 데이터를 개인용 컴퓨터로 전송하고 Excel을 사용하여 그래픽 이미지를 만듭니다. Spectra의 분석에 사용된 것과 동일한 반응 혼합물.

측광법은 겔 전기영동에 의한 분석에 사용할 수 있습니다. 획득 1시간 후. 분광 광도계에서 큐벳을 제거하고 용액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

5마이크로리터의 3몰 아세트산나트륨과 125마이크로리터의 100% 에탄올을 첨가하여 반응을 담금질합니다. 볼텍싱으로 각 용액을 혼합하고 배양 원심분리기 후 1시간 동안 튜브를 섭씨 영하 20도의 냉동고에 넣습니다. 반응은 11, 000 G에 4 섭씨 온도에 20 분 동안 혼합하고 조심스럽게 피펫팅에 의해 상층액을 제거한다.

DNA 농축기를 사용하여 펠릿을 10분 동안 건조시킵니다. 20마이크로리터의 젤 로딩 버퍼를 추가하고 간단히 와류를 추가합니다. 탁상형 원심분리기로 잠시 스핀다운합니다.

다음으로 실행 후 10% Dage gel의 웰당 10마이크로리터의 반응 샘플을 로드합니다. 유리판을 제거하고 수돗물로 철저히 씻으십시오. 젤 조각을 제거하려면 Kim 물티슈로 플레이트를 닦습니다.

태풍 스캐너를 사용하여 젤 플레이트의 형광을 스캔합니다. 시스템의 민감도를 평가하기 위해 이미지 퀀트 소프트웨어를 사용하여 결과 이미지를 분석합니다. 연속적으로 희석된 배양물은 증가하는 기간 동안 성장합니다.

단일 박테리아를 검출하는 데 필요한 최소 배양 기간을 결정하기 위해 2ml의 lb를 포함하는 10개의 배양 튜브를 준비하고, 각 배양물에 대장균 글리세롤 스톡 1ml당 2CFU 100마이크로리터를 접종하고, 섭씨 37도에서 4, 8, 12, 16 및 24시간에 250RPM으로 진탕하면서 배양합니다. 한 번에 채취한 샘플에 대해 검출 가능한 박테리아가 없을 수 있으므로 접종된 각 배양 튜브에서 300마이크로리터를 수확합니다. 포인트 4 8 12.

박테리아가 포함된 배양물을 식별하기 위해 나머지 배양액이 24시간 동안 성장하도록 합니다. OD 600를 측정하고 11, 5 분 동안 000 G에서 원심 분리로 세포를 침전시킵니다. CEMS가 함유된 상등액을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 옮겨 담고 다음날 사용할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

성장을 위해 배양물을 검사합니다. 접종 후 10개의 배양액 중 하나 또는 두 개만 대장균을 포함할 수 있으며 나머지 튜브에는 세포가 포함되지 않습니다. 지정된 시점에서 양성 배양에서 회수된 CEMS를 사용하여 RFD EEC 1로 절단 반응을 준비하기 위해 앞서 설명한 바와 같이 DAGE 겔 전기영동을 사용하여 반응 혼합물을 분석하고, RFD EEC one 및 RF SS one 프로브는 모두 DNA 자임 부분을 기질에 대한 효소 접합에 의해 준비했습니다.

그런 다음 CEM EEC 및 RFD EEC 1 또는 RF SS 1의 FS one 상호 작용을 분광법으로 평가했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이. R-F-D-E-C 사람은 CEM 적능력의 추가에 형광성 신호의 고도를 일으켰다.

이와는 대조적으로, R FS S one은 강한 형광 신호를 생성하지 않았습니다. 따라서 RFD EEC 것의 기능을 일으키는 형광. CEM에 연락하면 EC의 염기서열 분석이 이루어집니다.

관찰된 형광 증가가 RNA 연결의 절단으로 인한 것임을 확인하기 위해 구체적으로 확인되었습니다. 반응 혼합물은 RFD eec의 dage 절단에 의해 분석되었으며, 하나는 0.25 몰 수산화 나트륨으로 2D NA 단편을 생성 할 것으로 예상되며, 5 프라임 단편은 Fluor를 유지하고, 3 프라임 단편은 담금질을 유지한다. 여기에서 볼 수 있듯이.

RFD EEC, CEM, EEC 반응 혼합물은 실제로 예상되는 절단 생성물을 생성했습니다. 더욱이, UNC만이 R-F-D-E-C 1을 절단하고 5-프라임 단편만이 형광 이미징으로 검출될 수 있었다. RFD EEC의 특이성을 조사하기 위해 다른 여러 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에서만 수집한 CEMS를 사용하여 하나의 형광 분석을 수행했습니다.

CEM EC를 함유한 샘플은 형광을 증가시켰습니다. 다른 박테리아의 CEMS와 교차 반응성이 없다는 것은 R-F-D-E-C one이 4, 8, 12, 16 및 24시간 동안 성장 배지로 배양된 100마이크로리터에서 밀리리터당 1CFU로 희석된 단일 대장균 세포 e coli를 검출하는 데 필요한 최소 배양 시간을 결정하기 위해 대장균에 대해 매우 선택적임을 나타냅니다. R-F-D-E-C 1 및 분열과 혼합된 결과 CEMS는 여기에 표시된 바와 같이 dage로 평가되었습니다.

Dage 분석의 이미지는 R-F-D-E-C one이 예상한 절단 생성물을 생성하지 않았음을 나타냅니다. CEM과 반응할 때. ECS는 4시간 및 8시간 성장에서 수집되어 12시간의 배양 시간이 필요함을 나타냅니다.

이 기술의 핵심 구성 요소는 DA 효소 기반 분석이 적절하게 수행되면 60분 이내에 완료할 수 있다는 것입니다. 이 절차는 바이오 분석 분야의 연구원들이 광범위한 박테리아 병원체를 검출하기 위해 동종 DNA 효소를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.