Name: 형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: 배우세요 형광 DNAzyme 프로브를 사용하여 Escherichia coli를 신속하게 탐지하는 방법입니다. 이 기술은 PCR이나 항체법보다 간단하며 식품 안전 및 임상 진단에 활용될 수 있습니다.

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이 작품에 대한 자금 지원은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)과 센티넬 Bioactive 종이 네트워크에 의해 제공되었다.

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<li>Kandadai, S. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+catalytically+efficient+acidic+RNA-cleaving+deoxyribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme.</a> Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).</li>
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<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revitalization+of+six+abandoned+catalytic+DNA+species+reveals+a+common+three-way+junction+framework+and+diverse+catalytic+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores.</a> J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+high-branching+deoxyribozymes+from+a+catalytic+DNA+with+a+three-way+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction.</a> Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+and+rational+engineering+of+trans-acting+pH6DZ1%2C+an+RNA-cleaving+and+fluorescence-signaling+deoxyribozyme+with+a+four-way+junction+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+BioChem%22%5BJournal%5D)">Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure.</a> Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).</li>
<li>Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pH3DZ1+-+An+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+3%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3.</a> Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+signaling+platforms+built+from+a+small+catalytic+DNA+and+doubly+labeled+fluorogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates.</a> Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+MgZ+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS ONE. 2, e1224(2007).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+fluorescence+signaling+DNA+enzymes+in+sol+gel-derived+materials+for+metal+ion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing.</a> Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).</li>
<li>Kandadai, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5.</a> Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).</li>
<li>Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+assembly+of+nanospecies+on+repetitive+DNA+sequences+generated+on+gold+nanoparticles+by+rolling+circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification.</a> Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).</li>
<li>Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+protein-binding+DNA+aptamers+as+ligands+for+biosensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.</a> Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).</li>
<li>Ali, M. M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+sensing+by+using+allosteric-DNAzyme-coupled+rolling+circle+amplification+and+a+peptide+nucleic+acid-organic+dye+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

일반 세균의 검출 방법의 대부분은 오늘도 느려 (클래식 미생물) 또는 기술적 요구 (항체, PCR)입니다. 따라서, 우리는 탐지 도구의 차세대 속도와 단순으로 수용해야한다고 믿습니다. 이를 위해, 우리는 RNA-cleaving 및 형광 신호의 생성을 통해 박테리아의 존재를보고 간단한 assays을 개발하는 데 사용할 수있는 형광 - 신호 DNAzyme을 만들었습니다. 기능 DNAzyme 프로브, RFD-EC1은 E.의 성장 기간 동안 생산 CEM에 의해 활성화됩니다 문화 미디어의 대장균. 우리의 방법은 감지의 대상으로 세균의 원유 세포외 혼합물을 사용하며, 힘드는 대상 추출 및 증폭 단계를 무시하기 때문에, 그것은 매우 간단한 설정하는 데 사용할 수 있습니다, 세균 검출을위한 assays의 유형을 &#39;믹스 앤 읽기 &quot;. 우리 DNAzyme의 사용은 형광 기반의 검출 방법에 제한되지 않습니다. 예를 들어, colorimetric 탐지 같은 DNAzyme 시스템 분석 C를 사용은 유기 염료와 함께 압연 원형 증폭을 이용 이전에 보고된 방법을 사용하여 설계한다. 32 우리는 더 큰 운영 단순 새로운 세균 biosensors를 생성하는 매력적인 가로수와 같은 세균 검출을위한 DNAzymes의 사용을 예견한다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 또는 모델 </td></tr><tr><td> 한천 </td><td> BioShop 캐나다 </td><td> AGR003 </td></tr><tr><td> 암모늄 persulfate (APS) </td><td> BioShop 캐나다 </td><td> AMP001 </td></tr><tr><td> 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 (40 %, 29:1) </td><td> BioShop 캐나다 </td><td> ACR004 </td></tr><tr><td> 붕산 </td><td> BioShop 캐나다 </td><td> BOR001 </td></tr><tr><td> Bromophenol 블루 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> B8026 </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> EM 과학 </td><td> EXO539-1 </td></tr><tr><td> HCL </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 38,281 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop 캐나다 </td><td> HEP001 </td></tr><tr><td> LB의 국물 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> EMD화학 제품 </td><td> B10149-34 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop 캐나다 </td><td> SOD002 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> EMD 화학 </td><td> SXO255-1 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> EMD 화학 </td><td> SXO590-1 </td></tr><tr><td> SDS </td><td> BioShop 캐나다 </td><td> SDS001 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BioShop 캐나다 </td><td> TEM001 </td></tr><tr><td> 트리스베이스 </td><td> BioShop 캐나다 </td><td> BST666 </td></tr><tr><td> 십대 초반 20 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P9416 </td></tr><tr><td> 요소 </td><td> BioShop 캐나다 </td><td> URE001 </td></tr><tr><td> Xylenecyanol FF </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> X4126 </td></tr><tr><td> DNA 농축기 </td><td> 써모 과학 </td><td> 학자의 DNA Speed​​Vac 120 </td></tr><tr><td> Millex 필터 유닛 </td><td> Millipore </td><td> SLGP033RS </td></tr><tr><td> 젤로드 도움말 </tD&gt; <td> Diamed </td><td> TEC200EX-K </td></tr><tr><td> ImageQuant 소프트웨어 </td><td> 분자 역학 </td><td> 버전 5.0 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> 킴벌리 - 클락 전문 </td><td> 34,705 </td></tr><tr><td> 미니 Vortexer </td><td> VWR </td><td> 58816-121 </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Pechiney 플라스틱 포장 </td><td> PM996 </td></tr><tr><td> 배양 접시 </td><td> 피셔 과학 </td><td> Fisherbrand 08-757-12 </td></tr><tr><td> Stripettor 플러스 (피펫 총) </td><td> 코닝 </td><td> 07764714 </td></tr><tr><td> 석영 cuvettes </td><td> Varian INC </td><td> 66-100216-00 </td></tr><tr><td> 흔드는 / 보육 </td><td> 뉴 브 런 즈윅 과학 </td><td> 클래식 시리즈 C24 </td></tr><tr><td> 태풍 스캐너 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 9200 가변 모드 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> Allegra X22-R </td></tr><tr><td> 자외선 분광 </td><td> 써모 과학 </td><td> GenesysUV 10 </td></tr><tr><td> 형광 분광 </td><td> Varian INC </td><td> 캐리 이클립스 </td></tr></tbody></table>

형광 dnazymes을 사용하여 박테리아의 탐지

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

발병은 사망과 입원의 수백만뿐만 아니라 어마어마한 경제적 손실을 각각 매년 식인과 병원 - 인수 병원균 계정에 연결되어. 지속적인 유행병 장소 정확하게 초기 단계에서 범인의 병원균을 식별할 수있는 분석 방법에 대한 늘어나는 수요의 영향 등의 발생과 최소화의 예방. 높은 특이성 (이익만을 세균 검출), 고감도 (낮은 검출 능력 : 병원균 검출을위한 효과적인 방법의 큰 배열이있다지만, 그들 모두가 이상적인 검출 방법에 대한 구현 모두 다음과 같은 다섯 최고의 요건을 충족 없습니다 하나의 살아있는 세균 세포 등), 짧은 시간 - 결과 (시간 분), 훌륭한 운영 단순 (긴 샘플링 절차 및 전문 장비의 사용에 대한 필요도), 그리고 비용 효율성. 예를 들어, 고전적인 미생물 방법은 매우 구체적인 것이지만 오랜 시간 (다를 필요로주 YS는) 1 PCR과 항체 기반 기술을 짧은 대기 시간 (일 시간) 제공합니다. 최종 결과를 얻기 위해,하지만 그들은 값비싼 시약 및 / 또는 정교한 장비의 사용. 따라서 2-4 요구, 아직 거기있다 상기 요건 중 하나 이상의 향상된 특징을 제공하는 혁신적인 세균의 검출 방법을 개발하는 방향으로 과학 연구에 대한 큰 수요. 우리 연구실은 세균 검출 포함한 biosensing 어플 리케이션을위한 분자 프로브의 소설 클래스로 DNAzymes의 가능성을 검사에 관심있다 5. DNAzymes는 (또한 deoxyribozymes 또는 DNA의 효소라고도 함)가 사람이 만든 화학 반응을 catalyzing의 기능이 단일 좌초된 DNA의 분자를. 6-8 이들 분자가 많은 10대로 들어있는 광대한 임의 시퀀스의 DNA 풀 (격리 수 과정에 의한 16 개별 시퀀스)가 O &quot;체외 선택에서&quot;로 알려진R &quot;SELEX&quot;(지수 농축에 의한 리간드의 체계적 진화). 9-16 이러한 특수한 DNA 분자 널리 biosensing 응용 프로그램을위한 분자 도구로 최근 몇 년 동안 검사되었습니다. 6-8 우리 연구실은 RNA-cleaving 형광 DNAzymes (. RFDs; 그림 1)을 분리을위한 체외 선택 절차에 ​​설립되었으며 분석 도구로 RFDs의 사용을 조사 17-29 RFDs가 단일 ribonucleotide에서 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 형광단 (F)과 끄는 (Q)의 어귀되어 접합 (R). F와 Q의 가까운 거리는 uncleaved 기판 최소한의 형광을 렌더링. 그러나 절단 이벤트는 형광 강도의 상당한 증가와 함께되어 F와 Q의 분리로 안내합니다. 최근, 우리는 박테리아 감지를위한 RFDs를 분리하는 방법을 개발 5.이 특별한 RFDs은 &quot;으로 고립되었다자신의 환경이나 그들이 배양해되는 미디어 박테리아의 특정 유형 (그림 1)에 의해 남겨진 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 면전에서 &quot;점등. 원유 혼합물의 사용이 정화의 지루한 과정을 circumvents 및 바이오 센서 개발 (완료하는 데 몇 달 또는 몇 년이 걸릴 수도있는)에 대한 관심 미생물의 적합한 대상을 식별. 세포외 대상의 사용은 세포내 표적을 구하는 단계 필요가 없기 때문에 시금 절차는 간단하다 의미합니다. 오직 E. 제작한 CEM의 면전에서, 위의 접근 방식을 사용하여, 우리는 (그림 2A. FS1)은 기판 클리브 RFD를 파생 대장균 (CEM-EC) 5.이 E. RFD-EC1 (그림 2A)이라는 대장균 감지 RFD는, 엄격하게 CEM-EC에 대응하지만 다른 박테리아의 호스트 (그림 3)에서 CEMs에 대한 의식이된다는 것을 발견했다. 여기 preseE.을 설정하기위한 주요 실험 절차를 NT RFD-EC1 및 담당자 결과를 이용하여 대장균 검출 assays.

Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 &quot;을 믹스 앤 읽기&quot;를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 &quot;RFD-EC1&quot;표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를 설명합니다<em&gt; 대장균 (E. 대장균)</em&gt;.

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

식품 매개 및 병원 내 감염 병원균과 관련된 발병은 수백만 명의 사망과 입원을 초래할 뿐만 아니라 막대한 경제적 손실을 야기합니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 새로운 flu genic, DNA, Zyme 프로브를 사용하여 e coli와 같은 특정 박테리아의 존재를 신속하게 검출하는 것입니다. 먼저, ligation을 통해 genic DNA. Zyme 프로브를 생성합니다. 그 다음, 표적 분자의 수를 농축하기 위해 박테리아를 배양하고, 상층액으로부터 세포 외 혼합물을 준비합니다.그 다음, 조 추출된 세포 외 혼합물을 DNA zyme 프로브와 결합시킵니다. DNA zyme 프로브와 표적 분자 사이의 상호작용은 프로브의 절단을 유도하며, 이로 인해 형광이 발생합니다. 형광계를 사용하여 프로브와 표적 사이의 상호작용을 상대적 형광 강도의 증가로 확인합니다. 이후 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 분석을 통해 결과를 검증합니다.이 기술이 PCR이나 항체 기반 방법보다 갖는 주요 장점은 절차가 더 단순하고 수행하기 쉽다는 점입니다. 이 방법은 모델 박테리아인 e coli를 통해 개발되었으나, 다른 모든 식중독균이나 병원 내 감염 박테리아 병원균의 검출에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 생소한 연구자들은 합성 DNA 프로브와 박테리아 취급에 익숙하지 않아 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 프로토콜의 절차 시연은 저희 실험실의 연구 보조원인 Sergio Aguire와 박사후 연구원인 Monso Ali가 진행합니다.R-F-D-E-C 1은 특징적인 DNA Zyme입니다. 이는 검은색으로 밑줄 쳐진 촉매 서열 EC 1과 초록색으로 밑줄 쳐진 기질 서열 FS 1로 구성됩니다. 기질 내에는 파란색 r로 표시된 RNA 연결 부위가 있으며, 이는 F로 표시된 형광 표지 DT와 Q로 표시된 퀀처(quencher) 표지 DT 사이에 위치합니다. RF SS 1은 RFD EEC 1의 스크램블 버전으로, 촉매 서열 EEC 1은 SS 1 내에서 부분적으로 섞여 있으나 FS 1 부분은 변경되지 않은 상태입니다. RF DEC 1과 RF SS 1은 R-F-D-E-C 1의 표적으로 사용될 조섬유 세포외 혼합물(cem)을 준비하기 위해, 결합 템플릿인 LT 1의 존재 하에 올리고뉴클레오타이드 FS 1을 올리고뉴클레오타이드 EC 1 또는 SS 1과 템플릿 매개 효소 결합을 통해 제작합니다. 먼저 피펫 건을 사용하여 멸균된 14 mL 배양 튜브에 2 mL의 LB를 분주하는 것으로 시작하십시오.다음으로, 멸균된 피펫 팁을 사용하여 agar 플레이트에서 e coli 단일 콜로니를 채취하여 LB가 들어있는 배양 튜브에 넣습니다. 튜브를 37 °C로 설정된 배양기에 넣고 14시간 동안 배양한 후 250 RPM으로 흔들어 줍니다. 1% 재접종 배양액을 만들기 위해, 14 mL 배양 튜브에 신선한 LB 2 mL를 분주하고 이전 단계에서 준비한 박테리아 배양액 20 µL를 추가합니다.각 박테리아 용액의 OD 600 값이 약 1이 될 때까지 37 °C에서 250 RPM으로 진탕 배양합니다. 각 배양액 1 mL를 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 11,000 G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 원심분리 후 투명한 상층액을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.상층액을 -20°C에서 보관하십시오. DNA 효소와 조세포 추출물(crude cell extract)의 상호작용으로 형광 신호가 생성되는지 확인하기 위해 즉시 사용하지 않는 경우, 샘플을 분광 광도법으로 분석합니다. 형광 분광 광도계를 켜고 여기 파장 488 nm, 방출 파장 520 nm로 데이터 수집 파라미터를 설정하십시오.또한 기기가 1시간 동안 매분 측정값을 기록하도록 설정하십시오. 3개의 석영 크리스탈 큐벳을 먼저 증류 탈이온수로 세척한 다음 100% ethanol로 세척하십시오. 질소 가스를 분사하여 큐벳을 건조시키십시오.큐벳에 대조군 1은 C1, 대조군 2는 C2, 시험군은 T로 표시합니다. 다음으로 C1에 24 µL의 증류 탈이온수를 넣고, C2와 T에는 준비된 E. coli 조제 세포 외 혼합물 24 µL를 각각 옮깁니다. 각 큐벳에 2X RB 25 µL를 추가하고 형광 분광광도계에 넣습니다. 5분 후에 형광 데이터 수집을 시작하고, 형광 측정값이 중단되지 않도록 주의하며 C2에는 5 µM RFS S1 1 µL를, T와 C1에는 5 µM RFD eec1 1 µL를 각각 추가합니다. 피펫팅으로 각 용액을 혼합한 후, 데이터 수집 기간이 끝날 때까지 반응을 유지합니다.데이터를 Excel 파일 형식으로 저장하십시오. 그런 다음 데이터를 개인용 컴퓨터로 전송하고 Excel을 사용하여 그래픽 이미지를 생성하십시오. Spectra 분석에 사용된 것과 동일한 반응 혼합물을 사용합니다.광도 측정법은 겔 전기영동 분석에 활용될 수 있습니다. 1시간 동안의 획득 후, 큐벳을 분광광도계에서 제거하고 용액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.3 M 아세트산 나트륨 5 µL와 100% 에탄올 125 µL를 첨가하여 반응을 정지시킵니다. 각 용액을 볼텍싱하여 혼합한 후, 배양 및 원심분리 전 단계로서 튜브를 -20 °C 냉동고에 1시간 동안 보관합니다. 반응 혼합물을 4 °C에서 11,000 G로 20분 동안 원심분리하고, 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.DNA 농축기를 사용하여 10분 동안 펠렛을 건조합니다. 20 µL의 겔 로딩 버퍼를 추가하고 짧게 볼텍싱합니다. 벤치탑 원심분리기로 짧게 원심분리하여 가라앉힙니다.그 후 10% Dage 겔의 각 웰에 반응 시료 10 µL씩을 로딩합니다. 전기영동이 끝나면 유리판을 제거하고 수돗물로 깨끗이 세척합니다. 겔 조각을 제거하기 위해 Kim wipe로 유리판을 닦아냅니다.Typhoon 스캐너를 사용하여 겔 플레이트의 형광을 스캔합니다. 시스템의 민감도를 평가하기 위해 이미지 정량 소프트웨어를 사용하여 결과 이미지를 분석합니다. 연속 희석된 배양액을 시간 간격을 두고 배양합니다.단일 박테리아를 검출하는 데 필요한 최소 배양 기간을 결정하기 위해, 2 mL의 LB 배지가 담긴 배양 튜브 10개를 준비하십시오. 각 배양 튜브에 2 CFU/mL 농도의 E. coli 글리세롤 스톡 100 µL를 접종하고, 37 °C에서 250 RPM으로 흔들어 주며 4, 8, 12, 16, 24시간 동안 배양하십시오. 접종된 각 배양 튜브에서 300 µL를 수확하십시오. 4, 8, 12시간 시점에서 수확한 시료에서는 검출 가능한 박테리아가 없을 수도 있습니다.박테리아가 포함된 배양물을 확인하기 위해 남은 배양액을 24시간 동안 배양합니다. OD 600을 측정하고 11,000 G에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 침전시킵니다. CEMS가 포함된 상층액을 새로운 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고, 다음 날 사용할 때까지 -20 °C에서 보관합니다.배양액의 성장을 확인합니다. 접종 후 10개의 배양액 중 한두 개에만 e coli가 포함되어 있을 수 있으며, 나머지 튜브에는 세포가 포함되어 있지 않을 것입니다. 지정된 시점에 양성 배양액에서 회수된 CEMS를 사용하십시오. RFD EEC one을 이용한 절단 반응을 준비하고, 앞서 설명한 대로 DAGE 젤 전기영동을 사용하여 반응 혼합물을 분석합니다. RFD EEC one 및 RF SS one 프로브는 모두 DNA zyme 부분을 기질에 효소 결합시켜 준비하였습니다.CEM EEC와 RFD EEC 1 또는 RF SS 1의 상호작용을 분광법으로 평가하였습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, CEM ec를 첨가했을 때 R-F-D-E-C 1에서 높은 수준의 형광 신호가 생성되었습니다.이와 극명하게 대조적으로, R FS S one은 강한 형광 신호를 생성하지 않았습니다. 따라서 RFD EEC one의 형광 생성 기능이 CEM EC와 접촉했을 때 서열화됩니다.관찰된 형광 증가가 RNA 연결부의 절단으로 인한 것임을 확인하기 위해 수행하였습니다. 반응 혼합물을 분석하였으며, 0.25 molar 수산화나트륨에 의한 RFD eec의 절단은 2D NA 단편, 즉 형광체가 포함된 5' 단편과 소광제가 포함된 3' 단편을 생성할 것으로 예상됩니다. 여기에서 확인할 수 있습니다.RFD EEC CEM EEC 반응 혼합물에서 예상했던 절단 산물이 실제로 생성되었습니다. 또한, UNC만이 R-F-D-E-C를 절단하였으며, 5' 말단 단편이 형광 이미징을 통해 검출되었습니다. RFD EEC의 특이성을 확인하기 위해, 다른 여러 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에서만 수집한 CEMS를 사용하여 형광 분석을 수행하였습니다.CEM EC가 포함된 샘플에서 형광 증가가 나타났습니다. 다른 박테리아 유래 CEMS와의 교차 반응성이 없다는 점은 R-F-D-E-C one이 E. coli에 대해 높은 선택성을 가짐을 나타냅니다. 단일 E. coli 세포를 검출하는 데 필요한 최소 배양 시간을 결정하기 위해, 1 mL당 1 CFU로 희석된 E. coli 100 µL를 성장 배지와 함께 4, 8, 12, 16, 24시간 동안 배양하였습니다. 생성된 CEMS를 R-F-D-E-C one과 혼합하였으며, 절단 여부를 여기와 같이 dage로 평가하였습니다.Dage 분석 이미지를 통해 R-F-D-E-C 1에서 예상되는 절단 산물이 생성되지 않았음을 확인했습니다. CEM과 반응시켰을 때, 성장 4시간 및 8시간 시점에 수집한 ECS 결과는 숙련된 후에는 12시간의 배양 시간이 필요함을 나타냅니다.이 기술의 핵심 요소는 적절하게 수행될 경우 DA 효소 기반 분석을 60분 이내에 완료할 수 있다는 점입니다. 이러한 개발 이후, 이 절차는 바이오 분석 분야의 연구자들이 광범위한 세균성 병원균 검출을 위한 알로제닉 DNA 효소를 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.

detection-of-bacteria-using-fluorogenic-dnazymes

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Kim, H. 외, 고처리량 유전효소 스크리닝 시스템을 이용한 다효소 스크리닝. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 메타게놈 포스미드 라이브러리와 염색 기질을 이용한 효소 발현을 검출하는 유전적 스크리닝 방법을 시연합니다. 유세포분석은 색소 생성물을 생성하는 단일 세포를 식별하고 분리하여 활성 효소 발현 세포의 고처리량 선택을 가능하게 합니다.

유전자 변형 박테리아 세포에서 표적 효소 발현 검출

이 비디오는 나노 센서를 사용하여 식품 및 물 샘플에서 박테리아 오염 물질을 감지하는 기술을 보여줍니다. 표적 병원성 박테리아는 자기 이완(magnetic relaxation)과 형광 방출 방식(fluorescence emission modalities)의 조합을 통해 검출됩니다.

자기 형광 나노센서를 사용한 박테리아 오염 검출

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여기에서는 DIG 표지된 16S rRNA 표적 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 포매 조직 내에서 박테리아를 국소화하는 방법이 설명되었습니다. 이 프로토콜은 치주염, 암, 염증성 면역 질환과 같은 다양한 질병에서 박테리아의 역할을 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출

RNA 절단 DNAzyme, urease 및 마그네틱 비드를 활용하는 변형 리트머스 테스트를 사용하여 E. coli의 비색 검출 프로토콜을 설명합니다.

리트머스 테스트를 사용하여 박테리아의 비색 검출

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라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

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멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

여기, 형광 펩 티 드 대신 네이티브 단백질 분해성 기판으로 사용 되는 수정 된 zymographic 기법에 대 한 자세한 프로토콜 선물이. 전기 이동 법 형광 펩 티 드 zymograms에 생물 학적 샘플의 이전 zymographic 기법 보다는 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다.

형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

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바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

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