바이러스 게놈을 정량화하기 위한 Dot Blot Assay
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도트 블롯 분석을 사용하여 바이러스 DNA를 정량화하려면 분리된 바이러스 DNA 현탁액으로 시작합니다. 후속 혼성화를 위해 이중 가닥 DNA를 단일 가닥으로 변성시키기 위해 알칼리성 용액으로 처리합니다.
도트 블롯 장치를 미리 습윤된 나일론 멤브레인으로 조립합니다. 변성된 바이러스 DNA와 선형화된 표준 플라스미드 DNA 용액을 웰에 로드합니다. 적절한 진공을 적용하여 효과적인 음전하 바이러스 단일 가닥 DNA 전달을 촉진하고 정전기 상호 작용을 통해 양전하를 띤 멤브레인 표면에 결합하여 점 패턴을 형성합니다.
실행 후에는 sodium citrate buffer로 멤브레인을 세척하여 분석 감도를 개선하는 데 도움이 됩니다. 건조 후 멤브레인을 자외선에 노출시켜 블로트된 DNA를 멤브레인에 가교시킵니다.
혼성화 완충액에 열 변성, 비이종 DNA 단편과 바이러스 게놈 특이적 방사성 인 표지 DNA 프로브 현탁액을 멤브레인에 추가합니다. 배양하여 교잡을 촉진합니다.
DNA 단편은 차단제 역할을 하여 나머지 막 영역에 결합하여 비특이적 프로브 결합을 최소화합니다. 방사성 프로브는 바이러스 단일 가닥 DNA의 상보적 서열과 혼성화합니다.
세척 버퍼로 세척하여 하이브리드화되지 않은 프로브를 제거합니다. 형광체 이미지 스캐닝 시스템을 사용하여 멤브레인의 바이러스 게놈에 혼성화된 방사성 프로브에서 방출되는 방사성 신호를 정량화하여 점 블롯 신호를 얻습니다.
표준 곡선에서 멤브레인에 있는 각 점의 신호 강도를 사용하여 샘플의 바이러스 DNA 양을 계산할 수 있습니다.
