연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay 체외에서

이 실험의 전반적인 목표는 연골세포 역분화 동안 5-메틸시토신 수치를 측정하는 것입니다. 이 방법은 자가 연골 세포 이식과 같은 세포 기반 연골 결함 치료의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있음을 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 연골 세포 표현형을 평가하기 위해 일반적인 DNA 메틸화 수준을 감지하는 신뢰할 수 있고 간단하며 빠른 방법이라는 것입니다.

연골 세포 역분화 중 DNA 메틸화는 연골 결함에 대한 자가 연골 세포 이식 치료의 주요 장애물이기 때문에 이 기술의 의미는 자가 연골 세포 이식의 표준입니다. 이 방법은 연골 세포 역분화에서 DNA 메틸화 수준에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 골관절염과 같은 질병의 다른 연구에도 적용할 수 있습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 점 블롯 방법의 참조에서 프로토콜을 읽었을 때 처음 떠올랐습니다.

이 방법의 시연은 점 얼룩 상태의 이름을 지정하기 어렵기 때문에 매우 중요하다는 것을 보여주십시오. 게놈 DNA는 변성된 다음 연속적으로 희석되어야 합니다. 그런 다음 양전하를 띤 나일론 멤브레인으로 지지됩니다.

절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 대학원생인 Zhaofeng Jia가 맡을 것입니다. 이 연구에 사용된 관절 연골 조직은 외상 후 기증자 환자의 무릎 관절에서 분리되었습니다. 멸균 메스를 사용하여 연골을 1-2입방밀리미터 조각으로 깍둑썰기한다.

그런 다음 다진 연골에 콜라겐분해효소 II와 DMEM을 밀리리터당 1mg씩 첨가합니다. 그리고 섭씨 37도에서 12-16시간 동안 배양하여 연골세포를 소화합니다. 다음 날, 생성된 세포 현탁액을 40마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 여과합니다.

셀을 스핀다운합니다. 상등액을 버리고 PBS를 추가한 다음 다시 스핀다운합니다. 혈구계로 세포를 세십시오.

그리고 20, 000에서 30, 10%FBS와 1%penicillin 스트렙토마이신으로 보충되는 DMEM 당 제곱 센티미터 당 000의 세포에 씨를 뿌린다. 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다. 0.25% 트립신 EDTA를 사용하여 subconfluent 세포를 수확합니다.

그리고 6, 제곱센티미터 당 600개의 세포의 조밀도에 replate. 연골 세포를 최대 6개의 계대에 대해 단층으로 배양하고 1, 2, 3, 4, 5구에서 평가합니다. 이 절차를 시작하려면 트립신화(trypsinization) 및 원심분리(centrifugation)를 통해 세포를 수집합니다.

그런 다음 피펫팅과 빠른 반전을 통해 세포 1,000만 개당 500마이크로리터의 용해 완충액에 세포를 재현탁시킵니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 용해물 밀리리터당 160마이크로그램의 농도로 proteina K를 첨가하고 혼합물을 격렬하게 반전시킵니다.

섭씨 55도에서 6시간 동안 배양합니다. 각 샘플에 Tris pH 7.9 포화 페놀을 클로로포름에서 이소 아밀 알코올 한 부피를 추가합니다. 약 20초 동안 샘플을 손으로 완전히 흔듭니다.

13, 000 시간 G에 실내 온도에 5 분 동안 표본을 원심분리기. 상부 수성상을 제거하고 새 튜브로 옮깁니다. 페놀을 제거하려면 각 튜브에 동일한 부피의 클로로포름을 첨가하십시오.

손으로 흔들고 스핀을 내립니다. 상단 수성상을 새 튜브로 옮깁니다. pH 8 몰 아세트산 나트륨 3 개 및 100 % 에탄올 2 개 부피의 0.1 샘플 부피를 추가합니다.

튜브를 섭씨 영하 20도에서 하룻밤 동안 보관하여 게놈 DNA를 침전시킵니다. 다음 날에, 게놈 DNA를 펠릿으로 만들기 위하여 16, 000배 G에서 10 분 동안 섭씨 4도에 표본을 원심 분리하십시오. 샘플을 70% 에탄올로 세척하십시오.

그리고 13, 000 시간에 2 분 동안 4 섭씨 온도에 분리기 G.Remove는 상등액을 주의깊게 그리고 공기 DNA 펠릿을 말리십시오. DNA를 10 밀리몰 트리스 pH 8 0.1 밀리몰 EDTA에 재현탁시킵니다. 0.1몰 수산화나트륨에서 분리된 DNA를 섭씨 95도에서 10분 동안 변성하여 이 절차를 시작합니다.

얼음 위에 1 몰 암모늄 아세테이트로 DNA를 중화하십시오. 그런 다음 이중 증류수로 두 배로 희석합니다. 도트 블롯 분석에서 가장 중요한 단계는 샘플을 발견하는 것이며, 천천히 그리고 조심스럽게 수행해야 합니다.

각 점박이 어레이를 직경이 3-4mm로 최소화하십시오. 좁은 입 피펫 팁을 사용하여 연속 희석된 게놈 DNA의 2마이크로리터를 그리드 중앙의 양전하를 띤 나일론 멤브레인에 조심스럽게 찾아냅니다. 멤브레인을 섭씨 80도에서 30분 동안 닦습니다.

다음으로, 10cm 페트리 접시에 TBST의 5% BSA에 멤브레인을 담가 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 비특이적 항체 결합 부위를 차단합니다. 1시간 후 TBST에서 5분 동안 멤브레인을 3회 세척합니다. TBST에서 마우스 항-5-메틸시토신 단클론 항체로 멤브레인을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날에는 TBST에서 매번 5분씩 멤브레인을 세 번 세척합니다. 그런 다음 2 차 항체 인 horseradish peroxidase conjugated sheep anti-mouse immunoglobulin G를 TBST로 실온에서 1 시간 동안 배양합니다. 이전과 같이 TBST에서 멤브레인을 세척한 후 멤브레인에 효소 기질을 첨가하고 5-10분 동안 배양합니다.

마지막으로, 제조업체의 지침에 따라 화학발광 키트를 사용하여 2차 항체 신호를 시각화합니다. 6계대까지 단층에서 배양된 연골세포는 점진적인 표현형 변화를 보였으며, 연속적인 계대에 따라 심하게 꼬집히고 평평해졌습니다. 이러한 형태학적 변화는 연골세포 역분화 과정의 전형입니다.

게놈 DNA는 다양한 수의 계대 후에 연골 세포에서 분리되었으며 DNA 메틸화 수준은 5-메틸시토신 특이적 점 블롯 분석으로 평가되었습니다. 그런 다음 점의 강도를 이미지 J로 분석했습니다.장기간의 하위 배양으로 점진적으로 상승한 5개의 메틸시토신 수치가 관찰되었으며, 이는 일반적으로 증가된 메틸화 수준과 연골 세포 역분화 사이의 연관성을 시사합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 24시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 게놈 DNA 농도와 순도를 최대화해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 게놈 DNA 기계화 프로파일링과 같은 다른 방법을 수행하여 단일 배양에서 역분화의 연골 세포와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 자가 연골 세포 이식 분야의 연구자들이 연골 세포의 DNA 가공을 평가하고 연골 결손 치료에서 연골 세포 표현형을 결정할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 5-Methylcytosine 점 블롯을 사용하여 연골 세포 표현형을 평가하기 위한 퇴행성 기계 가공 레버를 감지하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 페놀로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑을 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.