Name: 연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay 체외에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 5-mC 도트 블롯 기법을 이용하여 연골세포 역분화 과정에서 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 방법을 배우세요. 이 신뢰할 수 있는 기술은 자가 연골세포 이식 치료의 효율성을 향상시키는 데 도움을 줍니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 다음과 같은 교부금에 의해 지원되었다 : 중국 자연 과학 재단 (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); 광동성 자연 과학 재단, 중국 (No. 2015A030313772); 중국 박사후 연구 재단 기금 프로젝트 (No. 2013M530385); 중국 광동성의 의학 연구 재단 (No. A2016314); 심천 과학 기술 프로젝트 (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No.JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

이 연구는 심천 제 2 인민 병원 인간 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 1. 인간 관절 연골 조직 수집 및 연골 세포 배양 <ol><li> 재료 준비 <ol><li> 10 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM) 배지를 준비한다. 1 MG / ML collagenase II, 0.25 % 트립신 - EDTA, 인산 버퍼 식염수 (PBS), 셀 스트레이너 (40 μm 나일론)를 준비합니다. </li></ol></li><li> 인간 관절 연골 조직 수집 <ol><li> 외상 후 기증자 환자의 무릎 관절에서 관절 연골을 분리합니다. 모든 참가자로부터 정보에 입각 한 동의를 얻습니다. </li><li> 멸균 메스를 사용하여 1 ~ 2mm 3 조각에 연골 주사위를 주사하고 37에서 DMEM에 1 MG / ML collagenase II와 다진 연골에서 연골 세포를 소화 12 ~ 16 시간. </li><li> 결과 cel 필터링세포 현탁액 (40 ㎛)을 통해 현탁시키고 PBS로 두 번 세척 하였다. </li><li> 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (penicillin-streptomycin)이 보충 된 DMEM에서 20,000-30,000 세포 / cm2의 밀도로 혈구 계수계 및 종자로 세포를 계수한다. </li><li> 37 ° C 배양기에서 배양. </li></ol></li><li> 단일 층 연골 세포 확장 <ol><li> 0.25 % 트립신 - EDTA를 사용하여 하위 합류 세포를 수확하고 6,600 세포 / cm 2 의 밀도로 다시 플레이트. 일주일에 두 번 매체를 변경하십시오. </li><li> 최대 6 개의 구절에 대해 단일 층에서 연골 세포를 배양하고 1, 2, 3, 4 및 5 번 구절에서 평가합니다. </li></ol></li></ol> 2. 게놈 DNA (gDNA) 추출 <ol><li> 100 만 세포 당 세포를 수집하고 500 μL 용해 버퍼 (15 MM 트리스 산도 8.0, 10 MM EDTA 산도 8.0, 0.5 % SDS, 200 μg / ML RNase A)에 resuspend. pipetting 및 빠른 반전으로 Resuspend 세포, 그리고 37 ° C에서 1 시간 품어. </li><li> 에이dd 단백질 분해 효소 K를 세포 용 해물 160 μg / mL의 농도로 첨가하고 혼합물을 격렬히 뒤집는다. 55 ° C에서 6 시간 동안 배양하십시오. </li><li> 샘플에 Tris pH 7.9 포화 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) 1 부피를 첨가한다. 약 20 초 동안 시료를 완전히 휘저거나 흔들어주세요. </li><li> 13,000 × g에서 5 분간 실온에서 시료를 원심 분리하십시오. 상부 수성 상을 제거하고 층을 새로운 튜브로 옮긴다. </li><li> 동일한 양의 클로로포름으로 추출하여 페놀을 제거하고 상부 수 성상을 새로운 튜브로 옮긴다. </li><li> 0.1M 샘플의 3M 아세트산 나트륨 pH 8.0과 2 부피의 100 % 에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다. </li><li> 튜브를 -20 ° C에 밤새 보관하여 gDNA를 침전시킵니다. </li><li> 샘플을 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 xg에서 원심 분리하여 gDNA를 펠렛으로 만든다. </li><li> 샘플을 70 % 에탄올로 3 번 씻고 4 ℃에서 2 분간 13,000 x g으로 원심 분리한다. </li><li> supernatan을 제거하십시오조심스럽게 공기 건조시켜야합니다. 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA에 DNA를 Resuspend. </li></ol> 3. DNA 메틸화 프로파일 링 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 총 500 NG의 게놈 DNA를 사용하여 bisulfite 전환 반응을 수행하는 DNA methylation 키트를 사용하십시오. 용리 완충액 (50 ng / μL) 10 μL로 용출시킨다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 DNA 메틸화 프로파일 링을 수행하십시오. </li></ol> 4. 점 얼룩 분석 <ol><li> 95 ° C에서 10 분 동안 0.1 M NaOH에서 단리 된 DNA (시료 당 1 mg)를 변성시킨다. 얼음에서 1M NH 4 OAc로 DNA를 중화 한 다음 두 배 희석한다. N + 막에 연속 희석 된 게놈 DNA 2 μL를 띄웁니다. </li><li> 멤브레인을 80 ℃에서 30 분 동안 블 럿팅하십시오. </li><li> 1 시간 동안 TBS-T 중 5 % BSA에 N + 막을 담그어 비특이적 항체 결합 부위를 차단하십시오. 반응으로 10cm 페트리 접시를 사용하십시오이온 챔버를 실온에서 수행한다. </li><li> TBST에서 5 분 3 회 세척 한 후 TBS-T 중 마우스 항 5- 메틸 시토신 (5-mC) 단클론 항체 (1 : 1,000)로 4 ℃에서 밤새 배양한다. </li><li> TBS - T에서 3 분 동안 멤브레인을 3 번 씻은 다음 TBS-T 중 2 차 항체 인 HRP- 복합 형 마우스 면역 글로불린 -G (IgG) (1 : 5,000)을 실온에서 1 시간 동안 항온 배양합니다. </li><li> 멤브레인을 TBS-T로 5 분간 세 번 씻으십시오. </li><li> 멤브레인에 효소 기판을 추가하고 5-10 분 동안 품어. 제조 업체의 지침에 따라 chemiluminescence 키트를 사용하여 보조 항체 신호를 시각. </li></ol>

<ol><li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).</li>
<li>Pareek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Outcomes+After+Autologous+Chondrocyte+Implantation%3A+A+Systematic+Review+at+Mean+Follow-Up+of+11.4+Years%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years.</a> Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+networking+of+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro+and+its+implications+for+cell-based+cartilage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy.</a> Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).</li>
<li>Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+chondrocyte+phenotype+maintenance+for+cell-based+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair.</a> Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling+in+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro.</a> J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).</li>
<li>Bhat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+detection+at+single+base+resolution+using+targeted+next+generation+bisulfite+sequencing+and+cross+validation+using+capillary+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing.</a> Gene. , (2016).</li>
<li>Shi, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Genome-wide+DNA+Methylation+Profiles+Altered+in+Kashin-Beck+Disease+Using+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips.</a> Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).</li>
<li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+HPLC+Method+for+Determining+the+Genomic+Methylation+Levels+of+Taxus+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells.</a> J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).</li>
<li>Maghbooli, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+DNA+methylation+as+a+possible+biomarker+fordiabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy.</a> Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).</li>
<li>Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gene+expression+in+human+articular+chondrocytes+assigned+for+autologous+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation.</a> J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).</li>
<li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+hyaline+cartilage+matrix+synthesis+in+collagen+sponge+scaffolds+by+using+siRNA+to+stabilizechondrocytes+phenotype+cultured+with+bone+morphogenetic+protein-2+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).</li>
<li>Niethammer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+autologous+chondrocyte+quality+of+matrix-based+autologous+chondrocyte+implantation+in+the+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Orthop%22%5BJournal%5D)">Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint.</a> Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).</li>
<li>Hayatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bisulfite+genomic+sequencing+used+in+the+analysis+of+epigenetic+states%2C+a+technique+in+the+emerging+environmental+genotoxicology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research.</a> Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).</li>
<li>Haque, N., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+sequencing+for+cytosine-methylation+analysis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants.</a> Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).</li>
<li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68(2008).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

체외에서 연골 세포 의 탈분화는 연골 결손의 치료에서 ACI의 결과를 심각하게 손상시킵니다 11,12. ACI 결과를 최적화하기 위해서는 탈분극 된 연골 세포 13 의 사용을 피하는 것이 중요합니다. 연구에 따르면 일반적인 DNA 메틸화 수준은 연골 세포 탈분화의 정도와 관련이 있다고합니다. 따라서, 임상 적용 전에 연골 세포의 일반적인 DNA 메틸화 상태를 검출하는 신뢰성 있고 신속한 방법을 확립하는 것이 필수적이다. 탈분화 된 인간 연골 세포에서 일반적인 DNA 메틸화 수준을 검출하기 위해 우리는 연속적으로 계대 된 연골 세포에서 5-mC 수준을 측정 할 수 있었다. 5-mC는 bisulfite 처리에 의한 탈 아민에 내성이 있습니다. 이 특성은 t를 이용하여 DNA 시토신 메틸화 패턴을 분석하는데 이용되었다그는 bisulfite 시퀀싱 접근법 14 . Bisulfite ...

Autologous chondrocyte implantation (ACI)은 관절 연골 결손을 치료하는 비교적 새로운 최첨단 절차입니다 1 , 2 . ACI의 중요한 단계 중 하나는 체외에서 단일 층 배양 을 통한 연골 세포의 증폭이다. 증폭 과정에서 유리 연골 세포는 쉽게 표현형을 잃어서 탈분화되어 ACI 치료에 바람직하지 못하다. ACI 치료의 결과를 최적화하기 위해, 연골 세포의 탈분화 정도를 재 접종 전에 결정해야합니다. 연골 세포의 상태를 결정하는 경제적이며 신속한 방법을 확립하는 것이 필수적입니다. 최근에 DNA 메틸화와 연골 세포 탈분극의 연관성이 주목을 받고있다 4 , 5 , 6 . DNA methylation은 wh의 과정이다.1 차 메틸기가 DNA에 추가되어 시토신 잔기가 5- 메틸 시토신 (5-mC)으로 전환됩니다. 연골 세포 탈분화의 DNA 메틸화 생물학을 밝히기 위해, 첫 번째 단계는 지금까지 도전적인 것으로 입증 된 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 평가하는 것입니다. Bisulfite 게놈 시퀀싱은 DNA 메틸화 분석에 가장 널리 사용되는 기술입니다 ( 7 , 8) . 이 분석에서 bisulfite 전환은 DNA 분해를 일으키므로 상당한 양의 시료를 분석에 제공해야합니다. 또한, 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)가 전 지구 DNA 메틸화 수준 9 , 10 을 정량화하기 위해 사용되었습니다. 그러나 HPLC 분석에는 게놈 DNA 분해가 필요합니다. 또한, 고급 고비용 실험기구가 필요합니다. 따라서, 고비용 이외에, 이러한 실험 절차는 시간 단점음. 항 -m-5C 항체는 상업적으로 이용 가능하며, 복잡한 게놈으로부터의 5-mC- 함유 게놈 DNA의 면역 블 럿팅 가능성을 창출했다. 이 보고서에서 우리는 일련의 단층 배양에서 성장한 연골 세포로부터 게놈 DNA를 추출했다. 우리는 구절의 다른 번호와 인간의 연골 세포의 5-mC 콘텐츠를 평가하는 도트 블랏 분석을 사용합니다. 우리는 5-mC 함량이 낮은 등급의 탈분화를 가진 연골 세포에 비해 고도로 탈분화 된 연골 세포에서 증가한다는 것을 발견했다. 또한, 우리는 탈 분화 상태와 5-mC 수준 사이의 관계를 확인했습니다. 마지막으로 우리는 5-mC 함량의 변화가 연골 세포의 표현형과 관련이 있다고보고했다. 따라서 5-mC 도트 얼럿 분석은 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 검출하기위한 신뢰할 수있는 간단하고 신속한 방법입니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Inc.</td><td>11965&ndash; 092</td><td>37에서 따뜻함 > C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>D-PBS, Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco Inc.</td> 없음<td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1% 페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>말린크로트</td><td>4440</td><td></td></tr><tr><td>이소아밀 알코올</td><td>시그마</td><td>I-3643</td><td></td></tr><tr><td>페놀</td><td>Gibco BRL</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>Gibco BRL</td><td>24568-2</td><td></td></tr><tr><td>TAE 완충액&nbsp;</td><td>바이오 휘태커</td><td>16-011V</td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td>Gibco BRL</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>1 M 트리스 HCl</td><td>Biosharp Inc.</td><td>BL514A</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>바이오톱 Inc.</td><td></td><td></td>C58H114O26</tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant Inc.</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소, 유형 II</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr> < td colspan = "4 "> [헤더]</td></tr> <tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>감마선 멸균</td></tr><tr><td>고속 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>MIULAB</td><td>MTH-100</td><td></td></tr><tr><td>이산화탄소 세포 인큐베이터</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>화학 이미징 분석 시스템</td><td>UVITEC Cambridge</td><td>ALLIANCE</td><td></td></tr></tbody></table>

연골 세포 분열 분열의 dna 메틸화 수준을 정량화하는 5-mc dot blot assay<em&gt; 체외에서</em

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

섬유 연골 성 연골 세포로의 유리질 연골 세포의 탈 분화는 종종 체외에서 연골 세포의 단층 확장을 수반한다. 연골 세포의 전체 DNA 메틸화 수준은 연골 세포 표현형의 손실에 적합한 바이오 마커로 간주됩니다. 그러나 다른 실험 방법을 기반으로 한 결과가 일치하지 않을 수 있습니다. 그러므로 연골 세포의 탈분화 동안 전 세계적 DNA 메틸화 수준을 정량화하기위한 정확하고 간단하며 신속한 방법을 확립하는 것이 중요합니다. 현재의 게놈 전반의 메틸화 분석 기술은 주로 바이 설 파이트 게놈 시퀀싱에 의존합니다. 바이 설 파이트 전환 동안 DNA 분해로 인해, 이들 방법은 전형적으로 큰 샘플 체적을 필요로한다. 전반적인 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 데 사용되는 다른 방법으로는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)가 있습니다. 그러나, HPLC는 게놈 DNA의 완전한 소화가 필요합니다. 또한, HPLC의 비용이 엄청나게 높습니다.기구는 HPLC의 광범위한 적용을 제한합니다. 이 연구에서는 genomic DNA (gDNA)가 다양한 계대 배양으로 배양 된 인간 연골 세포로부터 추출되었다. gDNA 메틸화 수준은 메틸화 - 특이 적 도트 블롯 분석을 사용하여 검출되었다. 이 도트 블랏 접근법에서, 검출 될 메틸화 된 DNA를 함유하는 gDNA 혼합물을 이전에 그려진 원형 템플릿 패턴 내부의 도트로서 N + 막 상에 직접 점착시켰다. 다른 젤 전기 영동에 근거한 blotting 접근법과 다른 복잡한 blotting 절차와 비교하여, dot blot 방법은 상당한 시간을 절약합니다. 또한 도트 블랏은 상업적으로 이용 가능한 5-mC 항체를 사용하여 전체 DNA 메틸화 수준을 검출 할 수 있습니다. 우리는 DNA 메틸화 수준이 monolayer의 하위 문화 사이에 차이가 있음을 발견했으며, 따라서 연골 세포의 탈분화에 핵심적인 역할을 할 수있었습니다. 5-mC 도트 블랏은 일반 DNA 메틸화 수준을 평가하기위한 신뢰할 수 있고 간단하고 신속한 방법입니다e 연골 세포 표현형.

연골 세포는 6 층까지 단일 층으로 배양되었다 (P6). 연골 세포는 단층 세포 배양을 연속적으로 진행하면서 점진적인 표현형 변화를 보였다. P0 연골 세포 형태는 둥글었지만 반면에 세포는 P6까지의 연속적인 통로로 매우 꼬집어지고 평평 해졌다 ( 그림 1 ). 이 형태 변화는 연골 세포 탈분화 과정의 전형적인 현상입니다. 한편, 히트 맵의 결과는 장기 계대 배양으로 CpG 부위의 일반적인 메틸화 수준이 증가 함을 나타냈다. 5-mC 도트 블럿 분석은 연골 세포 증식을 동반하는 높은 CpG 메틸화 수준을 보여 주었다 ( 그림 2 ). 이러한 결과는 일반적으로 증가 된 메틸화 수준과 연골 세포 탈분화 사이의 연관성을 제시한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/5556...

우리는 5- 메틸 시토신 (5-mC) 도트 블롯을 기반으로 DNA 메틸화를 정량화하는 방법을 제시합니다. 우리는 연골 세포 탈분화 동안 5-mC 수준을 결정했다. 이 간단한 기술은 ACI 치료에서 연골 세포 표현형을 신속하게 결정하는데 사용될 수 있습니다.

연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay<em&gt; 체외에서</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

본 실험의 전체적인 목표는 연골세포 탈분화 과정 중의 5-Methylcytosine 수준을 결정하는 것입니다. 이 방법은 자가 연골세포 이식과 같은 세포 기반 연골 결손 치료의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연골세포의 표현형을 평가하기 위해 일반적인 DNA 메틸화 수준을 검출할 수 있는 신뢰할 수 있고 간단하며 신속한 방법이라는 점입니다.이 기술의 시사점은 자가 연골세포 이식 분야의 연구 방향과 일치합니다. 연골세포 탈분화 과정 중 발생하는 DNA 메틸화는 연골 결손에 대한 자가 연골세포 이식 치료의 주요 장애물이기 때문입니다. 본 방법은 연골세포 탈분화 시의 DNA 메틸화 수준에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 골관절염과 같은 다른 질환 연구에도 적용 가능합니다. 저희는 닷 블롯(dot blot)법의 참고 문헌에 기술된 프로토콜을 읽으면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다.닷 블롯(dot blot)의 상태를 명명하기 어렵기 때문에 이 방법의 시연을 보여주는 것이 중요합니다. Genomic DNA를 변성시킨 후 연속 희석해야 합니다. 그 다음 양전하 나일론 막에 고정시킵니다.실험 절차의 시연은 본 연구실의 대학원생인 Zhaofeng Jia가 맡았습니다. 본 연구에 사용된 관절 연골 조직은 외상을 입은 기증 환자의 무릎 관절에서 분리하였습니다. 멸균 메스를 사용하여 연골을 1~2mm³ 크기의 조각으로 절단합니다.그 다음, 잘게 다진 연골에 1 mg/mL의 collagenase II와 DMEM을 첨가합니다. 그리고 chondrocyte를 분리하기 위해 37 °C에서 12~16시간 동안 배양합니다. 다음 날, 생성된 세포 현탁액을 40 µm 세포 스트레이너로 여과합니다.세포를 원심분리하여 가라앉힙니다. 상층액을 제거하고 PBS를 추가한 후 다시 원심분리합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.cm²당 20,000에서 30,000 cells의 밀도로 10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 DMEM에 seeding합니다. 37 °C 인큐베이터에서 48시간 동안 배양합니다. 0.25% trypsin EDTA를 사용하여 subconfluent 상태의 세포를 수확합니다.그리고 cm²당 6,600 cells의 밀도로 다시 분주합니다. 연골세포를 최대 6대까지 단층 배양하고, 1, 2, 3, 4, 5대에서 평가합니다. 이 절차를 시작하려면, 트립신 처리와 원심 분리를 통해 세포를 수집하십시오.그런 다음 피펫팅과 빠른 반전 혼합을 통해 세포 10 million개당 500 µL의 lysis buffer에 세포를 재부유합니다. 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 세포 용해물 1 mL당 160 µg 농도로 proteinase K를 첨가하고 혼합물을 격렬하게 반전 혼합합니다.55 °C에서 6시간 동안 배양합니다. 각 시료에 Tris pH 7.9 포화 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 혼합액을 시료와 동일한 부피만큼 첨가합니다. 시료를 손으로 약 20초 동안 충분히 흔들어 섞어줍니다.실온에서 13,000 ×g로 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상층의 수층을 제거하여 새 튜브로 옮깁니다. 페놀을 제거하기 위해 각 튜브에 동일한 부피의 클로로포름을 첨가합니다.손으로 흔들어 섞은 후, 원심 분리하여 침전시킵니다. 상층의 수용액 층을 새 튜브로 옮깁니다. 여기에 3 M sodium acetate (pH 8)를 시료 부피의 0.1배, 100% ethanol을 2배 부피로 첨가합니다.게놈 DNA를 침전시키기 위해 튜브를 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음 날, 4 °C에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심 분리하여 게놈 DNA 펠렛을 형성합니다. 70% ethanol로 샘플을 세척하십시오.그리고 4 °C에서 13,000 ×g로 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 DNA 펠렛을 공기 건조시킵니다. DNA를 10 mM tris pH 8, 0.1 mM EDTA에 재현탁합니다. 분리된 DNA를 0.1 M 수산화나트륨에서 95 °C로 10분 동안 변성시켜 이 절차를 시작합니다.얼음 위에서 1M ammonium acetate로 DNA를 중화합니다. 그런 다음 2차 증류수로 2배 희석합니다. dot blot 분석에서 가장 중요한 단계는 샘플을 점적(spotting)하는 것이며, 천천히 주의해서 수행해야 함을 기억하십시오.각 점적 어레이의 직경이 3~4 mm가 되도록 최소화하십시오. 입구가 좁은 피펫 팁을 사용하여, 연속 희석된 genomic DNA 2 µL를 양전하 나일론 막의 그리드 중앙에 조심스럽게 점적합니다. 막을 80 °C에서 30분 동안 블로팅합니다.다음으로, 10cm 페트리 접시에서 5% BSA가 포함된 TBST에 멤브레인을 담그고 실온에서 부드럽게 흔들어주며 1시간 동안 반응시켜 비특이적 항체 결합 부위를 블로킹합니다. 1시간 후, TBST로 멤브레인을 5분씩 세 번 세척합니다. 그 후, TBST에 희석한 mouse anti-5-methylcytosine 단클론 항체와 함께 멤브레인을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 막을 TBST로 5분씩 세 번 세척합니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 TBST에 희석된 2차 항체인 horseradish peroxidase 접합 sheep anti-mouse immunoglobulin G와 함께 반응시킵니다. 이전과 동일하게 막을 TBST로 세척한 후, 효소 기질을 막에 첨가하고 5~10분 동안 반응시킵니다.마지막으로, 제조사의 지침에 따라 화학발광 키트를 사용하여 2차 항체 신호를 시각화합니다. 계대 배양 6대까지 단층으로 배양된 연골세포는 계대가 진행됨에 따라 매우 좁아지고 납작해지는 점진적인 표현형 변화를 보였습니다. 이러한 형태학적 변화는 연골세포의 탈분화 과정에서 나타나는 전형적인 특징입니다.다양한 계대 배양 횟수 이후의 연골세포로부터 게놈 DNA를 분리하였으며, 5-Methylcytosine 특이적 닷 블롯 분석을 통해 DNA 메틸화 수준을 평가하였습니다. 이후 Image J를 사용하여 닷의 강도를 분석하였습니다. 하위 배양이 지속됨에 따라 5-methylcytosine 수준이 점진적으로 상승하는 것이 관찰되었으며, 이는 전반적인 메틸화 수준의 증가와 연골세포의 탈분화 사이에 연관성이 있음을 시사합니다. 숙련된 경우, 이 기술을 적절하게 수행한다면 24시간 이내에 완료할 수 있습니다.본 실험 절차를 수행할 때는 genomic DNA의 농도와 순도를 극대화하는 것이 중요하다. 이 절차 이후에는 단일 배양 시 연골세포의 탈분화와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 genomic DNA methylation profiling과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있다. 본 기술의 개발 이후, 자가 연골세포 이식 분야의 연구자들은 연골세포의 DNA methylation을 평가하고 연골 결손 치료 시 연골세포의 표현형을 결정할 수 있는 토대를 마련하게 되었다.이 영상을 시청한 후, 연골세포 표현형을 평가하기 위해 5-Methylcytosine dot blot을 사용하여 degenerate machination lever를 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 페놀을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑을 착용해야 함을 잊지 마십시오.

a-5-mc-dot-blot-assay-quantifying-dna-methylation-level-chondrocyte

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

이 비디오는 나일론 멤브레인에 DNA 샘플을 블롯팅하고 단클론 항체를 사용한 후속 시각화를 통해 체외에서 인간 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 결정하는 도트 블롯 기술을 설명합니다. 이는 배양의 다양한 단계에서 연골세포의 표현형을 결정하는 데 도움이 됩니다.

DNA 메틸화 정도를 결정하기 위한 5-메틸시토신 점 블롯

우리는 배아 체 형성 (EB) 형성, 섬유 아세포 세포 확장 및 연골 형성 유도를 포함하는 통합없는 방법을 사용하여 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 인간 말초 혈액 (PB)으로부터 연골 세포 계통을 생성하는 프로토콜을 제시한다.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.

신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출

이 프로토콜은 인간 관절 연골에서 연골 세포, 피브로넥틴 접착 분석 유래 연골 형성 동물(FAA-CP) 및 이동 연골 형성 동물(MCP)을 분리하는 방법을 자세히 설명합니다. 여기에는 효소 분해, 피브로넥틴 부착 및 이러한 세포를 분리하고 특성화하기 위한 마이그레이션 기반 분석이 포함됩니다.

Fibronectin Adhesion and Migratory Assay를 사용한 연골세포와 연골형성세포의 분리

성숙한 지방세포는 역분화를 통해 줄기세포의 풍부한 공급원을 나타낼 수 있으며, 이는 섬유아세포와 같은 세포의 균질한 집단으로 이어집니다. 콜라겐분해효소 소화는 인간 지방에서 성숙한 지방세포를 분리하는 데 사용됩니다. 우리 프로토콜의 목표는 인간의 성숙한 지방 세포에서 다분화능, 역분화된 지방 세포를 얻는 것입니다.

천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

특정 DNA 표지 methyl green을 가진 고정된 생물학적 물질의 형광 염색 방법이 설명되어 있습니다. 메틸 그린은 희석 된 수용액에 사용되며 광 표백에 매우 강합니다. 원적외선 방출로 표본 심층 이미징이 가능하여 전체 배아에 특히 적합합니다.

배아의 형광 라벨의 DNA 특정 얼룩 메틸 녹색의 응용 프로그램

학습하세요 5-mC 도트 블롯 기법을 이용하여 연골세포 역분화 과정에서 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 방법을 배우세요. 이 신뢰할 수 있는 기술은 자가 연골세포 이식 치료의 효율성을 향상시키는 데 도움을 줍니다.

연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay

더 많은 동영상 탐색