단백질 가공을 위한 화학발광 웨스턴 블롯 분석

죽음 수용체(death receptor)인 CD95는 작용성 항체(agonistic antibody)에 결합하여 프로카스파제 8을 모집하는 다단백질 복합체인 죽음 유도 신호 복합체(DISC)의 조립을 촉발합니다. DISC에서 procaspase 8은 다양한 중간 절단 산물을 형성하기 위해 이합체화 및 처리하고, 최종적으로 세포사멸을 시작하는 활성 형태를 형성합니다.

화학발광 웨스턴 블로팅을 사용하여 카스파제-8 처리를 분석하려면 튜브에 카스파제 8의 DISC 관련 중간 절단 산물을 함유한 용해물을 채취합니다. 여기에 단백질 A-아가로스 비드 포획 항-CD95 항체를 보충하십시오. 항-CD95 항체는 DISC 성분인 CD95에 결합하여 단백질 복합체를 형성합니다.

SDS-폴리아크릴아미드 겔에 샘플을 로드하여 서로 다른 크기의 면역침전된 카스파제 8 중간체를 별개의 띠로 분리합니다. 블로팅 멤브레인에 젤을 놓고 전류를 가합니다. caspase 8 중간체는 겔에서 블로팅 멤브레인으로 이동합니다.

단백질 결합 부위를 포화시키기 위해 차단형 단백질 함유 용액으로 멤브레인을 처리하여 비특이적 결합을 방지합니다.

특정 부위에서 caspase-eight 산물에 결합하는 1차 항체 용액을 추가합니다.

1차 항체의 상보적 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 효소 표지된 2차 항체를 추가하여 카스파제-8 분할 산물-1차 항체-2차 항체 복합체를 형성합니다.

2차 항체 접합 효소와 반응하여 빛을 방출하는 화학발광 기질을 추가합니다. 방출된 빛의 강도는 caspase-eight cleavage 산물과 상관관계가 있습니다.