진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화
January 26th, 2017
여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.
이 탠덤 친화성 정제 방법의 전반적인 목표는 생화학적 특성화 및 분자 조립을 위해 진핵 세포에서 발현된 단백질 복합체를 분리하고 그 기능을 조절하는 새로운 상호 작용체 및 번역 후 변형을 식별하는 것입니다. 이 방법은 진핵 세포에서 온전한 단백질 복합체의 정제를 가능하게 하여 새로운 상호 작용 인자를 식별하고 그 기능을 미세 조정하는 조절 번역 후 변형을 식별할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다운스트림 체외 응용 분야에서 단백질 복합체의 기능과 활성을 연구하기 위해 단백질 복합체의 순도와 수율을 높일 수 있다는 것입니다.
세포는 transfection 후 48시간 후에 STREP 친화성 정제에서 수집됩니다. 매체를 제거하고 8ml의 차가운 PBS를 추가합니다. 플레이트에서 세포를 분리하기 위해 위아래로 피펫팅합니다.
세포 현탁액을 모아 15ml 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 4분 동안 800배 g의 속도로 세포를 회전시킵니다. PBS 상층액을 제거합니다. 섭씨 4도에서 1분 동안 800회 g으로 스핀다운하여 잔류 PBS를 제거합니다.
이 절차를 시작하려면 수동 용해 완충액(PLB)의 세포 펠릿 부피의 5배로 각 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 잠시 소용돌이치고 섭씨 4도에서 30분 동안 발효시킵니다.
10, 000 시간 g에 세포 현탁액을 4 섭씨 온도에 10 분 동안 회전시킨다. 용해성 용해물을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 세포 펠릿을 폐기합니다. 용해성 용해물의 최종 부피의 10%를 STREP-AP 입력으로 저장하고 섭씨 4도에서 보관합니다.
STREP 비드로 끌어내린 복합체는 FLAG 비드로 끌어내린 복합체보다 훨씬 더 많은 단백질을 회수하기 때문에 첫 번째 친화성 정제 단계에서 STREP 비드를 사용하는 것이 중요합니다. 입이 넓은 피펫 팁을 사용하여 친화성 정제를 위해 적절한 양의 50% STREP 비드 슬러리를 제거합니다. 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 500회 g으로 스핀다운합니다.
상등액을 제거하고 비드에 500마이크로리터의 PLB를 추가합니다. 비드 혼합물을 섭씨 4도에서 5분 동안 너트화합니다. 다시 스핀을 다운합니다.
세 번째 세척 후 상등액을 제거하고 PLB의 비드를 n 곱하기 40 마이크로 리터의 최종 부피로 재현탁 (여기서 n은 샘플 수)입니다. 각 세포 용해물 샘플에 40마이크로리터의 50% STREP 비드 슬러리를 첨가하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 영양을 주입합니다. 이 단백질 생산 및 회수 과정에서 여러 세포의 플레이트를 사용할 수 있으며, 다른 플레이트에서 용해된 동일한 단백질 샘플을 STREP 친화성 정제 중에 비드의 한 부분과 결합할 수 있습니다.
세포 용해물과 STREP 비드 슬러리 혼합물을 2시간 동안 배양한 후 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 500회 g으로 스핀다운합니다. 상층액을 STREP AP가 흐르면 저장하고 섭씨 4도에서 보관합니다. 500마이크로리터의 STREP AP 세척 완충액 1을 비드에 추가합니다.
완충기 혼합물에 있는 구슬을 4 섭씨 온도에 5 분 동안 nutate, 1, 4 섭씨 온도에 2 분 동안 500 시간 g 원심 분리기. 상층액을 버리고 500마이크로리터의 STREP AP 세척 완충액 1로 다시 세척합니다. 세 번째 세척 후 비드 용액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 단백질 배경을 줄입니다.
STREP AP 세척 버퍼 1로 네 번째 세척하십시오. 탈수 후 상등액을 제거하고 500마이크로리터의 워시 버터 2를 추가합니다. 튜브를 뒤집어 구슬을 평형을 이룬 다음 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 500회 g으로 회전합니다.
상등액을 버리십시오. 50마이크로리터의 STREP 용리 완충액으로 관심 단백질을 용리합니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 800rpm에서 소용돌이.
구슬을 1, 500 회 g에서 섭씨 4도에서 1 분 동안 탈수합니다. 상층액을 수집합니다. 이 분획은 STREP AP 용리 샘플에 해당합니다.
두 번째 용리를 위해 비드 분획을 섭씨 4도에서 저장합니다. 은 염색 및/또는 웨스턴 블로팅을 위한 STREP AP 용리액의 10%를 분취량으로 추출합니다. 후속 FLAG 면역침전을 위한 시작 물질의 양을 늘리기 위해 첫 번째 및 두 번째 STREP 용리를 함께 풀링하여 FLAG 용리를 보다 효율적으로 회수할 수 있습니다.
입구가 넓은 피펫 팁을 사용하여 적절한 양의 FLAG 비드 용액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기는 방식으로 이 절차를 시작합니다. 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 500회 g으로 스핀다운합니다. 상층액을 제거하고 비드에 500마이크로리터의 FLAG 세척 버퍼를 추가합니다.
섭씨 4도에서 2분 동안 1, 500회 g으로 스핀다운합니다. 상등액을 버리고 FLAG 세척 버퍼로 다시 세척하십시오. 세 번째 세척 후 상등액을 제거하고 FLAG 세척 버퍼의 비드를 n 곱하기 16 마이크로리터의 최종 부피로 다시 현탁시키며, 여기서 n은 샘플 수입니다.
16마이크로리터의 FLAG 비드 슬러리를 남은 STREP AP 용리액에 첨가하고 섭씨 4도에서 밤새 영양분을 공급합니다. FLAG 비드 슬러리 및 STREP AP 용리를 하룻밤 동안 배양한 후 FLAG 면역침전을 진행합니다. FLAG 비드 서스펜션을 섭씨 4도에서 2분 동안 1, 500회 g으로 스핀다운합니다.
상등액을 FLAG IP가 흐르도록 저장하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 비드에 500마이크로리터의 FLAG 세척 버퍼를 추가합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 너트레이트하고 1, 섭씨 4도에서 2분 동안 500배 g으로 원심분리합니다.
상층액을 버리고 500마이크로리터의 FLAG 세척 버퍼로 다시 세척합니다. 세 번째 세척 후 단백질 비드 용액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 백그라운드를 줄입니다. FLAG 세척 버퍼로 네 번째 세탁하십시오.
최종 스핀에서 상등액을 제거하고 마이크로리터당 200나노그램의 FLAG 펩타이드가 포함된 30마이크로리터의 FLAG 세척 버퍼를 비드에 추가합니다. 섭씨 4도에서 2시간 동안 800rpm의 소용돌이. 2 시간 후, 1, 섭씨 4 도에서 2 분 동안 500 회 g에서 서스펜션을 회전시킵니다.
상층액을 수확하여 섭씨 4도에서 FLAG IP 용출액으로 보관합니다. 이 비디오에서는 Tandem 친화성 정제 또는 TAP 방법을 Cyclin-T1 CDK9 복합체에 적용했습니다. STREP 태그가 지정된 Cyclin-T1 및 FLAG 태그가 지정된 CKD9는 HEK293 T 세포에서 과발현되었습니다.
또한CDK9 태그가 지정된 STREP 및 Cyclin-T1이 태그된 FLAG를 사용하여 상호 실험을 수행했습니다. 웨스턴 블롯 분석은 STREP 비드에서 STREP가 태그된 Cyclin-T1과 공용리된 FLAG 태그가 지정된 CKD9를 보여주지만, 음성 대조군에서는 그렇지 않았으며, AP는 STREP가 Cyclin-T1을 태그하지 않았습니다. 두 단백질 모두 FLAG 용리액에서 검출되어 복합체 형성을 추가로 확인했습니다.
상호 TAP 결과는 FLAG 태그가 지정된 Cyclin-T1이 STREP 태그 CDK9와 공용리되었음을 보여주며, 이는 Cyclin-T1 CDK9 상호 작용이 사용된 항원결정기와 독립적임을 추가로 검증합니다. TAP과 상호 TAP의 결과도 은 염색으로 분석했습니다. 별표는 공용리된 불순물을 나타냅니다.
STREP 비드에서 STREP 태그가 지정된 Cyclin-T1과 공용리된 FLAG 태그 CKD9, 후속 FLAG 용출 AP.In 대조군에서는 그렇지 않음, STREP 태그 Cyclin-T1은 FLAG 비드에서 FLAG 태그가 지정된 CDK9와 공용리되었습니다. 유사하게, STREP 비드에서 STREP로 태그된 CDK9와 공용리된 FLAG 태그 Cyclin-T1을 사용하지만, 대조군 AP에서는 그렇지 않습니다. 그리고 단백질-단백질 복합체는 두 번째 FLAG IP 단계 후에 효율적으로 회수되었습니다. 이 기술을 완전히 익히면 이틀 만에 완료할 수 있으며, 적절하게 수행되면 세포를 채취할 준비가 되었을 때부터 시작할
수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 충분한 단백질을 회수하고 검출할 수 있도록 실험당 세포판의 수를 늘리는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 새로운 조절 소단위를 식별하거나 복잡한 소단위에 대한 번역 후 수정을 연구합니다. 개발 후 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 연구자들이 진핵 세포에서 새로운 상호 작용자와 번역 후 변형을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
이 동영상을 시청한 후에는 STREP 및 FLAG 태그를 사용하여 단백질을 분리하고 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 효율적인 분리 및 특성화를 위해 설계된 새로운 탠덤 친화성 정제(TAP) 방법을 소개합니다. 이 방법은 단백질 기능에 영향을 미치는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형을 식별할 수 있게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 생화학
- 세포 생물학
- 단백질 상호작용
배경
- 탠덤 친화성 정제는 단백질 복합체를 분리하는 데 사용되는 기술입니다.
- 단백질 상호작용을 이해하는 것은 세포 기능을 규명하는 데 중요합니다.
- 번역 후 변형은 단백질 활성을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다.
- 이 방법은 추가 분석을 위한 단백질 복합체의 순도와 수율을 향상시킵니다.
연구 목적
- 단백질 복합체 분리를 위한 견고한 TAP 방법을 개발합니다.
- 단백질 복합체의 생화학적 특성화를 촉진합니다.
- 새로운 상호작용자 및 조절 변형을 식별합니다.
사용된 방법
- 진핵 세포에서 단백질 복합체의 분리.
- 형질주입 후 48시간에 STREP 친화성 정제의 사용.
- 세포 분리를 위한 냉각된 PBS의 적용.
- 단백질 기능 연구를 위한 하위 스트림 인 비트로 응용.
주요 결과
- 고순도 및 수율의 분리된 단백질 복합체를 달성했습니다.
- 새로운 상호작용자의 식별이 촉진되었습니다.
- 단백질 기능을 조절하는 번역 후 변형이 특성화되었습니다.
- 이 방법은 생화학적 특성화에 효과적임이 입증되었습니다.
결론
- TAP 방법은 단백질 복합체를 연구하는 데 귀중한 도구입니다.
- 주요 조절 상호작용의 식별을 가능하게 합니다.
- 이 접근법은 단백질 기능 및 활성에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Collecting the Cells
1:39
Lysing the Cells
6:01
Equilibrating the FLAG Beads
2:32
Equilibrating the STREP Beads
3:56
STREP Affinity Purification (AP)
7:04
FLAG Immunoprecipitation (IP)
8:39
Results: A Cyclin-CDK Complex is Successfully Purified by Tandem Affinity Purification (TAP)
10:26
Conclusion
