Name: 진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 배우세요 진핵 세포에서 단백질 복합체를 고순도로 분리하는 탠덤 선호도 정화 방법을. STREP 및 FLAG 태그를 활용하여 새로운 상호작용 단백질과 번역 후 수정을 효과적으로 식별할 수 있습니다.

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이 간행물에 보고된 연구는 NIH의 NIAID(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)의 지원을 받았으며 수상 번호 R01AI114362와 Welch Foundation이 Iván D'Orso에게 I-1782를 수여했습니다.

1. 도금 세포 <ol><li> 전날 형질에 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 10 mL에 3.5 × 106 HEK293T 세포 플레이트 100mm 접시 당 (10,000 U / ㎖의 주). 플레이트 (3) - 실험 / 상태 당 5 100mm 요리는 충분한 단백질 복구를 보장합니다. 주 : 판의 개수는 관심있는 단백질 복합체의 발현 수준과 용해도에 의존하는 각 실험 / 조건에 대해 결정되어야한다. 대규모의 정제가 필요한 경우에는 세포주 스피너 플라스크이 현탁액에서 성장하도록 적응 될 수 있지만,이 방법은 일시적 형질 감염을 위해 작동하지 않을 것이다. </li></ol> 2. 안정 세포주를 세포 형질 감염 또는 유도 <ol><li> 다음 날, 현미경으로 세포를 확인합니다. proce을하기 전에 80 % 합류 - 세포는 70해야합니다대한 수정 사항. </li><li> 100mm의 접시 당 형질 감염 시약 7 플라스미드 DNA의 μg의 21 μl의 총 혼합물로 세포를 형질 감염. 형질 감염 효율에 대한 제어는 벡터 표현 GFP (표 1)과 함께 형질 감염 세포. 주 : 독시사이클린 14, 15에 대응하여 두 개 이상의 복잡한 소단위의 발현을 유도 HEK293-T-REX 또는 유사한 안정한 세포주를 사용하는 경우, 유도제는 세포에 첨가하고 48 시간 동안 배양되어야 할 것이다. 마찬가지로, 유도제의 첨가에 따라 GFP의 발현을 유도하는 안정한 세포 라인은 또한 검증을 위해 요구된다. 2.7 단계로 진행합니다. </li><li> 100mm 접시 당 형질 전환 혼합물을 준비합니다. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 (둘 이상의 플라스미드에 상당)의 총 플라스미드 DNA 7 μg의로 비추 DMEM 500 μL를 혼합한다. 별도의 microcentrifuge 관에서 비추 DMEM 위스콘신의 500 μl를 혼합트랜 시약의 제 21 μL. 각 형질 전환 반응에 대해 반복합니다. </li><li> 플라스미드 DNA 용액으로 형질 감염 시약 용액을 피펫 (역순으로 용액을 혼합하지 않음). 적어도 4 회 피펫 팅하여 혼합한다. </li><li> 10 시간 동안 실온에서 혼합물을 부화하지 - 15 분, 그러나 더 이상 15 분 이상. </li><li> 미디어 저장소를 생성하고 조심스럽게 세포를 방해하지 않고 판의 내부면에 드롭 현명 형질 전환 혼합물을 피펫 할 수있는 판을 기울입니다. 원래 평평한 위치에 접시를 반환하고, 혼합물을 배포하는 부드럽게 소용돌이 친다. </li><li> (이 조건은 이하 &quot;조직 배양 인큐베이터&quot;라 함), 5 % CO 2 습윤 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 미디어 5 시간 후 형질 전환 (옵션) 장착합니다. </li></ol> 3. 검사의 형질 또는 유도 효율 <ol><li> 24 시간 후 형질에서, 독감에서 세포를 시각화orescent 현미경은 형질 전환 효율 (또는 GFP를 발현 제어 HEK293T 렉스 안정적인 세포주의 유도)를 확인합니다. 또 다른 24 시간 동안 품어. </li></ol> 4. STREP 선호도 정화 (STREP AP) <ol><li> 세포를 수집 <ol><li> 48 시간 포스트 형질에서 미디어를 제거하고 차가운 1X 인산 완충 식염수 (PBS)의 8 ml를 추가합니다. 접시에서 세포를 분리 아래로 피펫합니다. </li><li> 수집하고, 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 4 ℃에서 4 분 동안 800 XG에서 세포를 스핀 다운. </li><li> PBS를 상층 액을 제거합니다. 잔여 PBS를 제거하기 (4 ℃에서 1 분 동안 800 XG)를 스핀을 반복합니다. 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 세포 펠렛을 저장 또는 단백질 정제를 계속하려면 다음 절차를 따르십시오. </li></ol></li><li> 세포를 용균 <ol><li> 패시브 용해 완충액을 세포 펠렛 부피 × 5를 사용하여 세포 펠릿 (~ 플레이트 당 250 μL)에 재현 탁(PLB : 20 mM의 pH 7.5 인 Tris-HCl, 150 mM의 염화나트륨, 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 DTT, 프로테아제 억제제 칵테일 정제, 5 % V / V 글리세롤, 1.0 % NP-40) 및에 세포 현탁액을 전송 1.5 ml의 microcentrifuge 관. </li><li> 간단히 4 ° C에서 30 분 동안 정지 및 nutate을 소용돌이. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 10,000 XG에서 세포 현탁액을 스핀. </li><li> 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 용해 용 해물을 전송하고 세포 펠렛을 폐기합니다. 같은 수용성 해물의 최종 부피의 10 % 할인 &quot;연쇄상 구균 AP 입력.&quot; 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 연쇄상 구균 구슬을 평형화 참고 : 첫 번째 AP 단계에 대한 사용 STREP 구슬! 연쇄상 구균 구슬 FLAG 구슬 아래로 끌어 것보다 훨씬 더 많은 단백질을 복구와 단지 아래로 당겼다. <ol><li> 꺼내 (n은 40 μl를 ×) + n은 50 % 연쇄상 구균 비드 슬러리의 μL (N = 샘플 수), 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운. 참고 : 넓은 m를 사용하여피펫 구슬에 outhed 팁. </li><li> 상층 액을 제거하고 구슬에 PLB의 500 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 구슬 혼합물을 Nutate. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운. <ol><li> 3 세척 총 반복합니다. 40 μL × N의 최종 부피로 PLB의 비드를 재현 탁. </li></ol></li><li> 4 ° C에서 2 시간 동안 각각의 세포 용 해물 샘플 및 nutate 50 % 연쇄상 구균 비드 슬러리의 40 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에서 솔루션을 스핀 다운. </li><li> 4 ° C에서 &quot;STREP AP 플로우를 통해 (FT)&quot;로 뜨는 및 저장소를 제거합니다. </li><li> I (20 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 250 mM의 염화나트륨, 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 DTT, 5 % 글리세롤 및 0.2 % NP-40) STREP AP 세척 버퍼 구슬에 500 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에서 5 4 ° C에서 분 원심 분리기의 구슬 혼합물을 Nutate. 상층 액을 버린다. <ol><li> 네 세척의 총 반복합니다. <br/&gt; 주 : 네번째 세척 전에 단백질 배경을 감소시키는 새로운 1.5 ML의 마이크로 원심 튜브에 비드 용액 옮긴다. 이 단계는 필수적이다. </li></ol></li><li> 500 μL 세척 버퍼 II (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA)를 추가하고 튜브를 반전 구슬을 평형. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 버린다. </li><li> STREP 용출 버퍼 (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 2.5 mM의 Desthiobiotin)의 50 μL과 관심의 단백질을 용출. 4 ℃에서 15 분 동안 800 rpm에서 소용돌이. </li><li> 4 ° C에서 1 분 동안 1,500 XG에서 구슬을 스핀 다운. 상층 액을 수집합니다. 이 부분은 &quot;STREP AP 용출&quot;샘플에 해당합니다. </li><li> 제 1 용출 얻어진 단백질의 양의 절반까지 얻을 수있는 초 용출, 4 ° C에서의 비드 부분을 저장한다. 실버 염색 및 / 또는 웨스턴 블로 팅에 대한 STREP AP 용출의 나누어지는 10 %16. </li></ol></li><li> 국기 구슬을 평형화 <ol><li> (NX 16 μL) + n은 FLAG 비즈 솔루션의 μL (샘플 N = 번호)를 꺼내 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운. 참고 : 피펫 구슬에 입이 큰 팁을 사용합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 FLAG 세척 버퍼 500 μL를 추가 (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.1 % NP-40) 구슬에. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운. 3 세척 총 반복합니다. </li><li> NX 16 μL의 최종 부피 FLAG 세척 완충액으로 비드를 재현 탁. </li><li> 4 ° C에서 나머지 STREP AP 용출 및 nutate 하룻밤에 FLAG 비드 슬러리의 16 μl를 추가합니다. </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol><li> 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에서 플래그 구슬 서스펜션을 스핀. 4 ° C에서 &quot;FLAG IP 플로우를 통해&quot;(FT)으로 뜨는 및 저장소를 저장합니다. </li><li> 500 추가(81); 솔루션에 FLAG 세척 버퍼의 리터. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 5 4 ° C에서 분 원심 분리기에 대한 Nutate. 네 세척의 총 반복하고 각 세척 한 후 상층 액을 제거합니다. 주 : 네번째 세척 전에 배경을 감소시키는 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 단백질로 비드 용액 옮긴다. 이 단계는 필수적이다. </li><li> 마지막 스핀에서 뜨는을 제거하고 구슬로 FLAG 펩타이드의 200 NG / μl를 포함 FLAG 세척 버퍼의 30 μL를 추가합니다. 4 ℃에서 2 시간 동안 800 rpm에서 소용돌이. </li><li> 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에서 정지를 스핀 다운. 으로 4 ° C에서 뜨는 및 저장소를 수확 &quot;FLAG IP 용출.&quot; 참고 : 용출 샘플 표준 프로토콜 16을 사용하여 실버 얼룩 및 / 또는 웨스턴 블롯으로 확인하고, 또한 단백질 분석을위한 준비가 될 수있다. (1) STREP AP 입력, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Eluti : 웨스턴 블롯을 설정할 때, 다음의 모든 샘플을 실행(4) FLAG IP FT, (5) FLAG IP 용출에. 로드 볼륨은 각 실험에 대해 결정되어야 할 것이다. 수집 된 모든 샘플과 비드 단기 기억과 장기 보존 -80 ° C에서 39 ° C에서 저장 될 수있다. TAP 샘플들은, 그 구성 요소의 신원을 확인하는 신규 번역 후 변형 (PTMS)를 식별 및 / 또는 정제 착체 2 (17)와 임의의 신규 단백질 상호 작용을 발견 질량 분석법에 의해 분석 될 수있다. 이러한 목적하는 쿠마 겔 또는은 염색을 실행 한 후, 밴드 깨끗한 메스를 사용하여 겔로부터 절제 될 수있다. 질량 분석 방법을 논의 몇 가지 우수한 리뷰 이전에, 19 (18)을 발표했다. </li></ol>

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발현 및 진핵 세포에서 단백질 복합체의 분리를 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 분자 어셈블리의 생화학 적 특성에 한정되지 않고, 그 기능을 조절할 수있는 신규 인터랙 번역 후 변형의 식별에 이용 될 수있다. 친 화성 태그의 활용은이 프로토콜에서 언급 한 내용에 제한되지 않는다; 그러나 우리의 경험은 제 AP 단계로 STREP을 사용하여 상당히 최종 단백질 - 단백질 복합체의 수율을 향상하는 것이 제안한다. 모두와 연쇄상 구균 구슬에서 바인딩 및 용출 단계 (예를 들면, FLAG) 다른 에피토프 태그에 비해 매우 효율적입니다. 또한, 이론적으로, TAP는 버퍼 조건 (모두 과도 안정적인 발현 시스템) 실험 당 접시 수 등뿐만 아니라 약간의 최적화와 다른 단백질 또는 도메인에 적용될 수는 TAP 방법도있을 수있다 응용 t다른 세포주 O를 특정 단백질 복합체는 그 기능 또는 고유 요인과의 상호 작용을위한 특별한 시스템이 필요합니다. 문제 해결을 용이하게하기 위해, 매우 입력 및 FT 샘플 모두 <st...

<html> 단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 그 기능이에 대해 알릴 수 생물학적 과정 (1),이 프로톤 펌프 억제제에 대한 추가 연구의 정확한 조절을 위해 중요하다. 몇몇 접근법은 프로톤 펌프 억제제의 연구 및 특성뿐만 아니라 신규 조절 단백질 성분의 드 노보 식별을 위해 고안되었다. 1989 년 스탠리 필드와 동료들은 효모 두 하이브리드 (Y2H) 분석 (3) 보도했다. 이 방법은 사카로 마이 세스 세레 비지에 인터랙 관심 (미끼)의 정의 단백질 (할까요)의 공평하고 포괄적 인 식별 할 수 있습니다. 프로톤 펌프 억제제를 발견하기위한 현저한 유틸리티 또한 Y2H 분석은, 효모 세포에서 단백질을 특성화 쌍 최소 상호 작용 도메인을 정의하고, 이러한 상호 작용을 폐지 변이를 식별하는데 사용될 수있다. Y2H 분석을 수정하여, 프로톤 펌프 억제제는 포유 동물 세포에서 공부하실 수 있습니다클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 4. Y2H 분석 (예, 효모 세 하이브리드 시스템)의 변형, 단백질 및 RNA 세포 단백질 작은 유기 리간드 상호 작용을 연구에 적용 할 수있다. 상동 시스템에서 프로톤 펌프 억제제를 연구하는 또 다른 일반적으로 사용되는 도구는 공동 면역 (공동 IP) 분석 5입니다. 관심의 단백질을 면역 침전에 대한 항체를 사용하여, 공동 IP 분석 연구자들은 다양한 환경 조건 및 실험 상황에서 셀의 프로톤 펌프 억제제를 모니터링 할 수있다. 에피토프 - 태그 단백질 (예를 들면, FLAG는, Myc와, STREP 및 HA는, 다른 사람의 사이에서) 친 화성 정화 (AP) 방법이 서양 얼룩 등 여러 다운 스트림 분석 복잡한 단백질 혼합물에서 단백질의 분리를 촉진했다,은 얼룩의 사용 및 효소 분석. 그러나 이러한 이전 방법 중 어느 것도 체외을 포함하여 더 특성화 단백질 복합체의 대량의 분리를 사용하지ssays, 질량 분석 및 번역 후 변형의 식별에 의한 규제 서브 유닛의 발견. AP 통신 방식의 향상된 버전은 두 개의 연속적인 AP들 (6, 7)를 통해 정제하여 두 에피토프와 융합 단백질을 생성하여 프로톤 펌프 억제제의 연구를위한 정제 기술이다 텐덤 AP (TAP)를 호출한다. 이 문서에서 우리는 두 개의 서브 유닛이 다른 에피토프 태그 다음 두 순차 액세스 포인트 (AP STREP FLAG IP 다음)를 통해 정제하는 정제 단백질 복합체의 TAP 방법의 변화를 제시한다. 연구자들이 관심을 자신의 단백질 복합체에 적용 할 수 있도록 우리가 먼저, TAP의 최소한의 개요 (그림 1)과 모든 실험 단계에 대한 자세한 설명 (그림 2)을 제공한다. 탭 방식의 적용 성을 입증하기 위해, 우리는 (복소 잘 특징 사이클린 CDK는 PT라고 선택한규제 소단위 사이클린 T1 (CycT1) 및 키나제 (경우, Cdk9)로 구성되며, RNA 중합 효소 II (POL II) 8, 9, 10에 의해 전사 조절에 관여 EFB 키나아제). P-TEFb는 폴 II 상기 프로모터에서 전사를 일시 완화 연관된 부정적인 신장 요소의 C 말단 도메인을 인산화시켜 전사 신도 11, 12, 13을 용이하게한다. 이를 염두에 알려진 상호 작용, CycT1을 STREP - 태그 및 FLAG-태그 경우, Cdk9는 HEK293T 세포에서 발현 이상이었다. 상호 TAP 실험은 더 단백질 상호 작용이 사용 된 에피토프에 독립적 인 것을 확인하는 STREP-태그 경우, Cdk9과 FLAG-태그 CycT1로 하였다. 세포를 수거하고, 48 시간 후 형질 감염을 용해시켰다. 가용성 해물이 TAP 그래피 (STREP AP는 FLAG 다음IP). 입력 및 정제 된 단백질은 서양 얼룩과 실버 얼룩 (그림 3)에 의해 분석 하였다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일&nbsp;</td><td>로슈&nbsp;</td><td></td><td></td>11836153001</tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>STREP-tag 용출 버퍼</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm &times; 20 mm 스타일 디쉬 세포 배양 처리된 비피로생성 폴리스티렌 20/슬리브</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>48홀 마이크로 튜브 폼 랙</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Labquake 쉐이커 로티세리&nbsp;</td><td>써모&nbsp;</td><td>제415110</td><td></td></tr></tbody></table>호

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

활성 단백질 - 단백질, 단백질 - 핵산 복합체의 정제 효소 활성 및 신규 서브 유닛 및 번역 후 변형의 드 노보 식별의 특성에 매우 중요하다. 박테리아 시스템들은 단일 폴리펩티드 및 단백질 복합체의 다양한 발현 및 정제를 허용한다. 그러나,이 시스템은 번역 후 변형 (예를 들어, 아세틸 화 및 포스 포 릴화)을 포함 소단위 단백질의 정제 및 진핵 시스템에서의 발현 만 존재하는 신규 규제 소단위 /의 식별을 가능하게하지 않는다. 여기서 우리는 진핵 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 표현 에피토프 - 태그 단백질과 단백질 복합체의 정제를 용이하게하는 소설, 강력한, 그리고 STREP-를 사용하여 효율적인 탠덤 선호도 정화 (TAP) 방식과 FLAG-태그 단백질에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 PROT의 특성을 적용 할 수있다EIN 복잡한 기능 복잡한 서브 유닛의 번역 후 변형을 발견, 및 질량 분광법에 의해 신규 규제 복잡한 구성 요소를 식별하기. 특히,이 방법은 TAP 따라서 하류 실험 기회 광범위한 항복 진핵 또는 병원성 (바이러스 성 및 세균성) 구성 요소에 의해 형성되는 단백질 복합체를 연구에 적용될 수있다. 우리는 단백질 복합체와 협력 연구자들이 다양한 방법으로이 방법을 활용할 수 있다고 제안한다.

이 글에서, 우리는 (또한 P-TEFb 키나제라고도 함) 복잡한 잘 특징 CycT1-경우, Cdk9에 TAP 방법의 적용 가능성을 보여줍니다. 그리고 경우, Cdk9-FLAG (경우, Cdk9 : F), 또는 경우, Cdk9-STREP (경우, Cdk9 : S) 및 시클 T1-FLAG (CycT1 : F) : 시클 T1-STREP (S CycT1) 인코딩하는 플라스미드 (표 1), HEK293T 세포로 형질 감염시켰다 . F 또는 CycT1 : (각각도 3a 및 B) F 플라스미드 음성 대조군은 빈 벡터와 경우, Cdk9와 형질을 포함했다. 세포를 수거하기 전에 단백질은 48 시간 동안 발현되었다. 세포의 여러 접시는 단백질 생산 및 복구를 증가 (샘플에 5 판 <str...

여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

이 탠덤 친화성 정제법(tandem affinity purification method)의 전반적인 목표는 생화학적 특성 분석, 분자 조립, 그리고 단백질 기능을 조절하는 새로운 상호작용 인자와 번역 후 변형의 식별을 위해 진핵 세포에서 발현된 단백질 복합체를 분리하는 것입니다. 이 방법은 진핵 세포로부터 온전한 단백질 복합체를 정제함으로써, 해당 복합체의 기능을 미세 조정하는 새로운 상호작용 인자와 조절 번역 후 변형을 식별할 수 있게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 복합체의 기능과 활성을 연구하기 위한 하류 단계의 시험관 내(in vitro) 응용 분야에 필요한 고순도 및 고수율의 단백질 복합체를 얻을 수 있다는 점입니다.트랜스펙션 48시간 후에 STREP 친화성 정제를 통해 세포를 수집합니다. 배지를 제거하고 차가운 PBS 8 mL를 첨가합니다. 피펫팅을 통해 플레이트에서 세포를 떼어냅니다.세포 현탁액을 수집하여 15 mL 튜브로 옮기고 4°C에서 800 ×g로 4분 동안 원심분리합니다. PBS 상층액을 제거합니다. 잔류 PBS를 완전히 제거하기 위해 4°C에서 800 ×g로 1분 동안 다시 원심분리합니다.이 절차를 시작하려면, 각 세포 펠렛을 세포 펠렛 부피의 5배에 해당하는 수동 용해 완충액(passive lysis buffer, PLB)에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 현탁액을 짧게 볼텍싱한 후, 4 °C에서 30분 동안 누테이터(nutator)로 교반합니다.세포 현탁액을 4°C에서 10,000 ×g로 10분 동안 원심 분리하십시오. 가용성 용해물을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 세포 펠릿은 제거하십시오. 가용성 용해물 최종 부피의 10%를 STREP-AP 입력물로 보관하고 4°C에서 저장하십시오.STREP 비드로 침전시킨 복합체가 FLAG 비드로 침전시킨 것보다 훨씬 더 많은 단백질을 회수하므로, 첫 번째 친화성 정제 단계에서 STREP 비드를 사용하는 것이 중요합니다. 입구가 넓은 피펫 팁을 사용하여 친화성 정제에 필요한 적량의 50% STREP 비드 슬러리를 제거합니다. 4°C에서 1,500 ×g로 2분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 비드에 500 µL의 PLB를 첨가합니다. 비드 혼합물을 4 °C에서 5분 동안 뉴테이션(nutate)합니다. 다시 원심 분리하여 가라앉힙니다.세 번째 세척 후, 상층액을 제거하고 비드를 PLB에 재현탁하여 최종 부피를 n × 40 µL로 맞춥니다(여기서 n은 샘플 수입니다). 각 세포 용해물 샘플에 50% STREP 비드 슬러리 40 µL를 추가하고 4 °C에서 2시간 동안 너테이터(nutator)로 혼합합니다. 이 단백질 생산 및 회수 과정에서 여러 플레이트의 세포를 사용할 수 있으며, 서로 다른 플레이트에서 용해된 동일한 단백질 샘플들을 STREP 친화성 정제 과정 중 하나의 비드 분량으로 결합하여 처리할 수 있습니다.세포 용해물과 STREP 비드 슬러리 혼합물을 2시간 동안 배양한 후, 4°C에서 1,500 ×g로 2분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 STREP AP flow through로 저장하고 4°C에서 보관합니다. 비드에 500 µL의 STREP AP wash buffer one을 첨가합니다.4°C에서 5분 동안 버퍼 혼합액과 함께 비드를 너테이트(nutate)하고, 4°C에서 1,500 ×g로 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 500 µL의 STREP AP wash buffer one으로 다시 세척합니다. 세 번째 세척 후, 단백질 배경값을 줄이기 위해 비드 용액을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.STREP AP 세척 버퍼 1로 네 번째 세척을 수행합니다. 원심 분리 후, 상청액을 제거하고 세척 버퍼 2 500 µL를 첨가합니다. 튜브를 반전시켜 비드를 평형화한 다음, 4 °C에서 1,500 ×g로 2분 동안 원심 분리합니다.상층액을 제거합니다. 50 µL의 STREP 용출 버퍼를 사용하여 목적 단백질을 용출합니다. 4 °C에서 800 rpm으로 15분 동안 볼텍싱합니다.4°C에서 1,500 ×g로 1분 동안 비즈를 원심 분리합니다. 상층액을 수집합니다. 이 분획이 STREP AP 용출 시료에 해당합니다.두 번째 용출을 위해 비드 분획을 4 °C에서 보관하십시오. 은 염색 및/또는 웨스턴 블로팅을 위해 STREP AP 용출액의 10%를 소분하십시오. 후속 FLAG 면역침전법을 위한 시작 물질의 양을 늘리기 위해, 첫 번째와 두 번째 STREP 용출액을 하나로 합쳐 FLAG 용출액을 더 효율적으로 회수할 수 있습니다.와이드 마우스 피펫 팁을 사용하여 적당량의 FLAG 비드 용액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 이 절차를 시작합니다. 4°C에서 1,500 ×g로 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 비드에 500 µL의 FLAG 세척 완충액을 첨가합니다.4°C에서 1,500 ×g로 2분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 FLAG 세척 완충액으로 다시 세척합니다. 세 번째 세척 후, 상층액을 제거하고 샘플 수(n)에 16 µL를 곱한 최종 부피의 FLAG 세척 완충액으로 비드를 재현탁합니다.나머지 STREP AP 용출액에 FLAG 비드 슬러리 16 µL를 추가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 너테이트(nutate)합니다. FLAG 비드 슬러리와 STREP AP 용출액을 하룻밤 동안 배양한 후, FLAG 면역침강을 진행합니다. FLAG 비드 현탁액을 4 °C에서 1,500 ×g로 2분 동안 원심 분리합니다.상층액을 FLAG IP 통과액으로 저장하고 4°C에서 보관하십시오. 비드에 500 $\mu\text{L}$의 FLAG 세척 버퍼를 추가하십시오. 4°C에서 5분 동안 너테이션(nutate)하고, 4°C에서 1,500 $\times g$로 2분 동안 원심 분리하십시오.상층액을 제거하고 500 µL의 FLAG 세척 완충액으로 다시 세척합니다. 세 번째 세척 후, 배경 신호를 줄이기 위해 단백질 비드 용액을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. FLAG 세척 완충액으로 네 번째 세척을 수행합니다.마지막 원심분리 후 상층액을 제거하고, 200 ng/µL의 FLAG 펩타이드가 포함된 FLAG 세척 버퍼 30 µL를 비드에 추가합니다. 4°C에서 800 rpm으로 2시간 동안 볼텍싱합니다. 2시간 후, 4°C에서 1,500 ×g로 2분 동안 현탁액을 원심분리합니다.상층액을 수확하여 FLAG IP 용출액으로서 4°C에 보관하십시오. 본 영상에서는 Cyclin-T1 CDK9 복합체에 탠덤 친화성 정제(Tandem affinity purification) 또는 TAP 방법이 적용되었습니다. STREP 태그가 붙은 Cyclin-T1과 FLAG 태그가 붙은 CKD9를 HEK293 T 세포에서 과발현시켰습니다.STREP 태그가 붙은 CDK9과 FLAG 태그가 붙은 Cyclin-T1을 사용하여 상호 실험도 수행하였습니다. Western blot 분석 결과, STREP 태그가 붙은 Cyclin-T1이 없는 음성 대조군 AP에서는 나타나지 않았으나, FLAG 태그가 붙은 CKD9이 STREP 비드로부터 STREP 태그가 붙은 Cyclin-T1과 함께 공용출(coelute)됨을 확인하였습니다. 두 단백질 모두 FLAG 용출액에서 검출되었으며, 이는 복합체 형성을 추가로 입증하였습니다.상호 TAP 결과에서 FLAG 태그가 붙은 Cyclin-T1이 STREP 태그가 붙은 CDK9와 함께 용출되었으며, 이는 Cyclin-T1과 CDK9의 상호작용이 사용된 에피토프와 무관함을 추가로 입증합니다. TAP 및 상호 TAP 결과는 은 염색법으로도 분석되었습니다. 별표는 함께 용출된 불순물을 나타냅니다.FLAG 태그가 붙은 CDK9은 STREP 비드에서 STREP 태그가 붙은 Cyclin-T1과 함께 공동 용출되었으나, 대조군 AP에서는 용출되지 않았습니다. 이어지는 FLAG 용출 과정에서 STREP 태그가 붙은 Cyclin-T1은 FLAG 비드에서 FLAG 태그가 붙은 CDK9과 함께 공동 용출되었습니다. 마찬가지로, FLAG 태그가 붙은 Cyclin-T1은 STREP 비드에서 STREP 태그가 붙은 CDK9과 함께 공동 용출되었으며, 대조군 AP에서는 용출되지 않았습니다. 그리고 단백질-단백질 복합체는 두 번째 FLAG IP 단계 이후 효율적으로 회수되었습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절히 수행될 경우 세포 수집 준비가 된 시점부터 이틀 만에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 충분한 단백질을 회복하고 검출할 수 있도록 실험당 세포 플레이트 수를 적절히 늘려야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 새로운 조절 서브유닛을 식별하거나 복합체 서브유닛의 번역 후 수정을 연구하는 경우가 이에 해당합니다. 이 기술은 개발 이후, 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 연구자들이 진핵 세포에서 새로운 상호작용 인자와 번역 후 수정을 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청하고 나면 STREP 및 FLAG 태그를 사용하여 단백질을 분리하고 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 진핵 세포에서 단백질 복합체를 정제하는 기술인 탠덤 친화성 정제를 보여줍니다. 이 복합체에는 서로 다른 항원결정기 태그로 표지된 두 개의 단백질이 포함되어 있습니다. 두 개의 서로 다른 태그에 대한 친화력을 가진 두 개의 수지를 순차적으로 사용하여 복합체를 정제할 때, 용리액에 두 단백질이 모두 존재하면 둘 사이의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

단백질 단지 키 세포 기능을 촉진. 많은 필수 단지의 자세한 기능 및 구조 특성은 재조합 생산을 필요로합니다. MultiBac 특히 진핵 세포 단백질과 복합체를 표현하기위한 맞춤형 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템입니다. MultiBac는 오픈 액세스 플랫폼, 자사의 유틸리티를 극대화하기 위해 개발 된 표준 운영 절차로 구현되었다.

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

초파리는하지만 깊이있는 생화학 적 분석의 적합성에 대한, 강력한 유전자 조작으로 유명합니다. 여기에서 우리는 파리의 뇌에서 관심의 단백질의 상호 작용 파트너를 식별 할 수있는 TAP 기반의 절차를 제시한다. 이 절차는 잠재적으로 연구의 새로운 길을 초래할 수 있습니다.

단백질 - 단백질 상호 작용을 확인<em&gt; 초파리</em탠덤 선호도 정화로&gt; 성인 머리 (TAP)

TAP(Tandem Affinity Purification) 방법은 단백질체학을 위해 주로 진핵생물인 세포 추출물에서 천연 복합체를 분리하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 여기에서는 구조 연구를 위한 천연 복합체의 정제에 최적화된 TAP 방법 프로토콜을 제시합니다.

탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

여기 선물이 엽록체의 정화에 대 한 검증 및 테스트 프로토콜 가져오기 단백질 복합물 (복잡 한 TIC TOC) 탭-태그를 사용 하 여. 1 단계 선호도 격리 프로토콜 잠재적으로 어떤 단백질에 적용 될 수 있습니다 그리고 질량 분석에 의해 새로운 상호 파트너를 식별 하는 데.

탭 태그를 사용 하 여 엽록체 Translocon 단백질 복합물의 친 화력 정화

이 기사에서는 6X-histidine 태그로 라벨링된 인간 재조합 단백질인 flap endonuclease 1(FEN1)의 친화성 정제 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 태그된 단백질의 정제를 위해 두 개의 뚜렷한 고정화된 금속 이온 컬럼을 사용하는 것을 포함합니다.

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

배우세요 진핵 세포에서 단백질 복합체를 고순도로 분리하는 탠덤 선호도 정화 방법을. STREP 및 FLAG 태그를 활용하여 새로운 상호작용 단백질과 번역 후 수정을 효과적으로 식별할 수 있습니다.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

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