휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내 현미경 검사를 통해 마우스 뇌의 미세 순환을 연구하는 것이며, 이를 통해 장기간에 걸쳐 말뚝 미세 순환의 혈역학적 및 염증성 마커의 동적 변화를 추적할 수 있습니다. 이 기술은 La Jolla Bioengineering Institute에서 개발되어 다양한 유형의 연구에 사용되었습니다. 예를 들어, plasmodium burgi onca 감염 과정 중 및 뇌 말라리아 발현 시점의 혈역학적 변화에 대한 추적 조사가 있습니다.

이는 생체 내 현미경 검사 연구 2주 전에 만성 두개골 창을 먼저 이식함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 저배율에서 고해상도 디지털 이미지를 사용하여 두개창의 전체 형태를 기록하는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 기존 조명과 형광 조명을 사용하여 생체 내 현미경 이미지를 획득하고 혈관 직경 및 적혈구 속도의 온라인 측정을 위한 특정 연구 사이트를 선택하는 것입니다.

절차의 마지막 단계는 형광 표지된 특이 항체를 통해 말뚝 혈관의 백혈구 및 혈소판 부착에 대한 생체 내 분석을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 이러한 상태와 관련된 혈역학적 변화를 확립하기 위해 뇌 생체 내 현미경 검사를 통해 생리학적 병태생리학적 또는 질병적 상태의 대뇌 미러링 모델에서 생체 내 미시 순환 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 외부 작용제나 인공 매체 생체 내 현미경에 노출시키지 않고 생리학적 환경에서 뇌를 관찰한다는 것입니다: 이미지 자기 공명 및 혈관 조영술에 비해 공간적 및 시간적 해상도를 가지며 미시적 수준에서 미시적 수준까지 볼 수 있습니다.

이 방법은 생체 내 현미경 검사 2-3주 전에 급성 및 만성 질환 중 혈역학 및 염증 변화와 같은 뇌 미세순환의 생리학 및 병태 생리학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 개두술은 8주에서 10주 된 생쥐에서 수행되며, 티타늄 막대가 동물의 머리에 배치되지 않은 것을 제외하고는 이전에 시연되었습니다. 만성 두개골 창은 안정적인 제제로, 실험 당일 이식된 후 몇 달 후에도 말뚝 미세 순환을 검사할 수 있습니다.

먼저, 마우스의 꼬리 정맥을 통해 이전에 준비된 형광 표지된 적혈구가 주입된 입체 프레임에 동물을 배치하기 전에 동물의 체온을 확인합니다. 이를 통해 적혈구 추적이 가능하며, 이는 나중에 시연될 것입니다. 그런 다음 불소로 마우스를 가볍게 마취합니다.

4%는 감응작용을, 1개는 2%를 위한 정비를 위해. 다음으로, 동물을 엎드린 자세로 가열 패드의 입체 프레임에 놓습니다. 이어바를 사용하여 머리를 조심스럽게 고정하고 좌우 레버를 사용하여 레벨을 조정합니다.

미네랄 오일을 적신 면봉으로 두개골 창의 덮개 슬립을 부드럽게 청소합니다. 그런 다음 디지털 카메라에 연결된 실체 현미경을 사용하여 창 아래에 있는 혈관의 파노라마 사진을 몇 장 찍습니다. 파노라마 사진을 컴퓨터로 전송한 후 인쇄, 식별 및 날짜를 기입하는 데 가장 적합한 사진을 선택하십시오.

이 사진은 혈관 직경과 적혈구 속도를 측정하기 위한 지도로 사용되며, 다음에 생체 내 현미경 검사를 시작하기 위해 시연될 것입니다. 마우스를 맞춤형 생체 내 현미경 스테이지로 옮깁니다. 치과용 아크릴에 의해 형성된 우물을 이용하여 두개골 창에 물 한 방울을 놓습니다.

개구수가 0.5인 20 x Water Immersion Objective가 사용됩니다. 측정용 혈관을 선택하기 전에 컴퓨터 및 모니터에 연결된 디지털 저조도, 고속 카메라, VCR 테이프에 연결된 저조도 아날로그 카메라, 타임스탬프 및 컬러 모니터 등 두 대의 카메라를 사용하여 이미지를 기록하고, 조제의 품질을 평가하기 위해 혈관을 점검하고, 모든 혈관에 혈액이 흐르고 있는지, 그런 다음 측정할 용기를 선택합니다. 여기에는 서로 다른 직경의 장소와 간선도로가 포함되어야 하며 창에 의해 노출된 영역 내의 다른 위치를 포함해야 합니다.

이 실험에서는 두개골 창 내의 다양한 필드를 볼 때 측정할 12개의 혈관을 선택합니다. 혈관을 선택하려면, 각 반점에 대해 이전에 촬영한 PY 혈관 구조 사진에서 측정할 각 지점의 정확한 위치에 주석을 달고, 혈관 직경은 이미지 전단 장치를 사용하여 측정됩니다. 스폿이 선택되면 용기의 이미지가 수직 위치에 정렬되고 이미지는 반대까지 전단됩니다.

극단이 정렬되고 판독 값이 문서화됩니다. 적혈구 추적을 위해 각 지점은 디지털 카메라에 의해 최소 30초 동안 기록되고 비디오 이미지는 초당 150프레임으로 기록됩니다. 이 속도는 초당 최대 6mm의 속도를 결정하기 위해 하나의 비디오 프레임에서 1-6개의 셀 이미지를 얻도록 설정됩니다.

데이터 수집이 완료되면 입체 프레임에서 마우스를 제거하고 케이지로 되돌려 적절한 소프트웨어를 사용하여 마취에서 회복합니다. 획득된 비디오 이미지는 디지털화되고 XY됩니다. 각 셀 이미지에 대한 좌표 데이터를 얻습니다. 세포 위치는 이미지 분석이 아닌 수동으로 결정됩니다.

훈련된 관찰자의 눈이 세포 중심의 위치를 잘 추정한다는 점을 감안할 때, 이는 일반적으로 관찰된 최대 형광의 위치에 해당합니다. 대부분의 세포 방향에서 위치와 속도는 각 혈관에 있는 15개의 세포에 대해 결정됩니다. 혈관 직경 및 RBC 속도 측정을 사용할 수 있게 되면 평균 RBC 속도를 얻기 위한 평균입니다.

각 혈관의 혈류를 계산하려면 말뚝 혈관의 백혈구 부착 및 분석을 위해 Q는 혈류의 2제곱 곱하기 V, 여기서 Q는 혈류, V는 적혈구 속도, D는 혈관 직경과 같은 공식 Q를 사용하여 수행할 수 있습니다. 생체 내 현미경 검사는 FSE 표지 알부민과 Texas Red로 표지된 팬 백혈구 마커 CD 45에 대한 항체의 혼합물이 주입된 동물에서 수행됩니다. 형광 표지된 알부민은 투과 혈관을 포함한 혈관 네트워크의 시각화를 개선할 수 있으며, 뇌성 말라리아와 같은 질병 상태에서 비관류 혈관 또는 과소 관류 혈관을 확인하는 데 특히 유용합니다.

형광 표지된 anti CD 45 항체를 사용하면 백혈구 굴림 및 말뚝 혈관에 대한 접착력을 쉽게 식별하고 정량화할 수 있습니다. 백혈구 부착의 정량화는 100미크론 용기 길이에 있는 백혈구의 수를 계수하여 이루어집니다. 롤링은 30초 동안 동일한 100미크론 길이에서 혈액 속도보다 훨씬 느린 속도로 이동하는 백혈구의 수를 계산하여 정량화합니다. 표시.

다음은 고속 형광에서 세포 추적을 통한 미세혈관 적혈구 속도 측정의 예입니다. 비디오 녹화 사진 A에서 F는 미세 순환의 시퀀스 이미지입니다. 각 사진은 흐르는 단일 적혈구의 위치를 나타내며, 이 위치는 고속 카메라에 의해 프레임별로 캡처됩니다.

대표적인 실험의 이 그래프는 시간 경과에 따른 말뚝 혈류의 변화를 보여줍니다. plasmodium, burgi, onca에 감염된 마우스와 감염되지 않은 대조군 마우스에서는 시간이 지남에 따라 말뚝 혈류가 비교적 안정적입니다. PBA에 감염된 마우스는 뇌성 말라리아 발병 시기에 혈류가 감소하는 것으로 나타났습니다.

6일째에 항 CD 45로 염색한 텍사스 적색 형광 항체는 plasmodium burgi onca에 감염된 쥐의 말뚝 혈관에 많은 수의 백혈구가 부착되어 있음을 나타냅니다. 이 절차는 오늘날 여기에 있는 한 가지 작업 외에도 광범위한 응용 프로그램이 있습니다. in vivo에서 사용할 수 있는 모든 광학 기술을 이 모델에 적용할 수 있으며 조직, 산소 수준 조직, pH 활성 산소 종 및 백혈구와의 내피 상호 작용과 같은 매개변수를 이 모델에서 연구할 수 있습니다.