Name: 휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 학습하세요 마우스 뇌 미세순환을 연구하는 생체현미경 기법으로, 만성 두개골 윈도우를 이용하여 혈역학적 변화와 염증 반응을 실시간으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 뇌 질환 연구에 필수적인 도구입니다.

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1. Craniotomy 8 대 10 주 된 생쥐의 craniotomy은 티타늄 바에는 동물의 머리에 배치 아니라는 것을 제외하고, 이전에 설명한 1로 사전에 수행되어야합니다. 만성 두개골 창문조차 개월 이식 후에 pial 엑기스의 안정적인 준비 있도록 시험입니다. 보통, 우리는 2-3 주 두개골 창 주입 후 우리의 연구를 수행합니다. 2. Intravital 현미경 <ol><li> 두 - 3 주 craniotomy 후 체온을 선택한 다음 마우스로 가볍게 anesthetized입니다 isoflurane (유도 4 %, 유지 보수 1-2 %). 라이트 마취는 실험 절차를 수행하는 동안 동물의 스트레스와 불편을 방지하는 데 사용됩니다. </li><li> 동물은 다음 stereotaxic 프레임과주의 깊게 귀 막대를 사용하여 보안 머리에 발생하기 쉬운 위치에 배치됩니다. 수준은 오른쪽과 왼쪽 레버를 사용하여 조정됩니다. 핵심 체온은 가열 패드를 사용하여 유지됩니다. 대뇌 말라리아와 쥐가 저체온증을 개발하기 때문에, 온도 설정은 각각의 동물에 따라 조정해야합니다. </li><li> 두개골 창문에 커버 슬립이 부드럽게 면봉은 광유와 창 아래에있는 혈관의 파노라마 사진이 stereomicroscope과 디지털 카메라 (니콘 Coolpix 995, 일본)의 도움으로 가져옵니다과 moistened 목화와 함께 청소합니다. 사진은 인쇄를 식별하고 날짜와 혈관 직경과 적혈구 세포 (RBC) 판매율의 측정을위한지도로 사용하게됩니다. </li><li> 마우스는 다음 intravital 현미경 스테이지 (Leica - 맥베인, 샌디에고, CA 맞춤)로 전송됩니다. 물방울이 잘 치과 아크릴로 만들어 활용 두개골 창에 위치, 초점이 조정됩니다. 측정은 20X (LUMPFL - WIR, 수치 조리개 0.6, 올림푸스) 물 침지 목표를 사용하여 수행됩니다. 같은 혈관들은 기본 레벨로 직접 비교가 작은 샘플 집단에 대한 더 강력한 통계있게 수행될 수 있도록 다음 있습니다. 이미지는 디지털 낮은 광 고속 카메라 (하마 마츠 C9300 - 221, 일본) 또는 VCR 테이프에 연결된 낮은 광 아날로그 카메라 (COHU 4815, 샌디에고, CA) (JVC, 일본), 스탬프 시간 (MicroImage 비디오를 사용하여 캡처되어 시스템, 보여 타운, PA) 및 컬러 모니터 (PELCO, 클로 비스, CA). 테이프가 제대로 기록 시작하기 전에 식별하고 타임 스탬프는 이벤트 recoded되었던 동안 기간을 문서화하여 이벤트의 식별을 허용합니다. </li><li> 혈관의 첫 번째 검사 혈액은 모든 혈관에 흐르는 경우 준비의 품질을 평가하기 위해 만든 것입니다. 그런 다음, 측정하는 혈관의 선택 사항이 있으며, 그것은 서로 다른 직경의 venules과 arterioles을 (우리가 마우스를 pial 준비에서, 대부분의 선박은 20 80μm 사이의 범위) 포함하고 창을에 의해 노출되는 영역 내에서 서로 다른 위치를 커버한다. Arterioles과 venules 쉽게 선박의 파급 효과에 혈액 흐름 (이것은 배포 또는 혈액을 수집 여부)의 방향을 선택하여 구분하실 수 있습니다. 우리의 연구에서 측정 12 혈관에서 만들어집니다. 측정 각 지점의 정확한 위치는 pial vasculature의 그림에 주석이있다. </li><li> 각 지점은 혈관의 직경은 이미지 전단 장치 (이미지 쉬어, 비스타 전자, 샌디에고, CA) 2를 사용하여 측정됩니다. 장소가 선택되면, 선박의 이미지가 수직 위치에 정렬되고 반대 극단이 정렬되고 읽기가 문서화 때까지 이미지가 가지각색입니다. 이 값은 십자선 보정 스테이지 마이크로 미터 (에드먼드 광학 주식 회사, 배링턴, NJ)를 사용하여 각 특정 배율의 이전 교정하여 micrometers로 번역하실 수 있습니다. </li><li> 각 지점은 적혈구 추적 적어도 30 초 동안 기록됩니다. 추적, 혈액 샘플을 수집하고, 적혈구는 찬란로 표시하는 염료 Dil (분자 프로브, 칼스 배드, CA)와 ~ 0.4-0.5 % 3의 생체내 농도를 얻기 위해 꼬리 정맥을 통해 주입을 carbocyanine. , 레이블없이 주입, Plasmodium berghei 앙카 (PBA)는 녹색 형광 단백질 (CJ Janse와 AP 워터스에 의해 입금 PBA - GFP, 말라리아 연구 및 참조 시약 리소스 센터 MR4, 머내서스, VA에서 기부금을) 표현에 감염된 동물 세포가 필요합니다. 영상은 초당 150 프레임에 기록됩니다. 이 요금은 8mm / s의 최대 판매율의 결정에 대해 하나의 비디오 프레임에 셀 1-6 이미지를 얻을로 설정되어 있습니다 비디오 이미지는 어도비 프리미어 4.0 소프트웨어를 사용하여 개인용 컴퓨터와 디지털 있으며, 각 셀에 이미지를위한 XY 좌표 데이터는 SigmaScan 프로 4.0 소프트웨어 (SPSS 시카고, IL) 4를 사용하여 얻을 수 있습니다. 셀 위치는 훈련 관찰자의 눈이되는 세포의 중심의 위치의 좋은 평가를 제공 표시된 것을 감안할 때, 이미지를 분석하여 수동보다는 결정됩니다일반적으로 H는 대부분의 세포 오리 엔테이션에 대한 관찰 최대한의 형광의 위치에 해당합니다. 위치와 속도의 다중 결정은 각 셀에 대해 만든 의미 RBC 속도를 얻기 위해 평균입니다. </li><li> RBC 속도 측정이 오프라인 수행하는 경우, 각각의 마우스에 대한 총 관측 시간은 마취의 cardiodepressive 효과를 최소화 10-15분를 초과하지 않습니다. </li><li> 혈관 직경과 RBC 속도 측정을 사용할 수 있습니다되면, 각 선박의 혈액 흐름의 계산 공식을 사용하여 만들 수 있습니다 : Q = V X π (D / 2) 2, 어디서 Q = 혈액의 흐름, V = RBC 속도와 D = 혈관 직경. </li><li> 이러한 절차는 시간이 지남에 따라 반복 수 있습니다. 예를 들어, 뇌성 말라리아의 마우스 모델에서, 우리는 감염 4 일 시작하는 매일 측정을 수행합니다. 각각의 마우스에 대한 매일 얻은 값은 100 %로 간주됩니다 일 0 관계 (예정 감염)에 정규화합니다. </li><li> 혈관 직경과 혈류 측정 이외에 추가적인 평가는 인스턴스 개선 재관류의 평가 및 pial 혈관에 백혈구 및 / 또는 혈소판 압연 및 준수의 분석을 위해, 수행할 수 있습니다. 이러한 측정은 형광 라벨이 표시된 마커의 도움으로 수행됩니다. 말라리아의 경우, 우리는 또한 GFP를 표현 PBA의 변형을 사용하는 방법으로 순환하거나 자기편 기생충를 검색할 수 있습니다. </li><li> 재관류 평가에 대한 우리의 솔루션을 사용 FITC - 표시된 (시그마, 세인트 루이스, MO 50μg/mouse) 알부민, 그리고 우리가 텍사스 레드 (TxR)로 표시된 팬 백혈구 마커 CD45에 대한 항체를 사용 pial 선박 백혈구 준수를 수치 ( Invitrogen, 칼스 배드, CA 4μg/mouse). 이 경우, 알부민 - FITC (2mg/mL) 및 안티 CD45 - PE 항체의 20μL가 (200μg/mL) 혼합 및 사전 예열 꼬리 정맥에 주사의 25μL. 누설 측정 알부민 - FITC가 15 분 동안 순환을 허용 소요됩니다 경우 마우스 그러면하지만, 바로 몇 군데 있습니다. XF100 - 2 (오메가 광학, 브레 틀 보로, VT), 및 안티 CD45 - TxR 형광이 (615nm) 종료하고 있습니다 : 알부민 - FITC와 GFP (PBA - GFP pRBC)에 의해 방출 그린 형광 (518nm)를 사용 비비드 ALPHA 캡처입니다 XF42 : 비비드 표준 캡처. </li><li> 형광 - 라벨 알부민은 관통 선박을 포함하여 혈관 네트워크의 향상된 시각화를 허용하고, 이러한 비 perfused 이하 - perfused 선박에 대한 확인 뇌성 말라리아와 같은 질병 상태에 특히 유용합니다. 또한 혈관 누출 5 측정하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 형광 라벨이 표시된 안티 CD45 항체는 pial 선박 백혈구 압연과 접착력을 식별하고 계량 쉽게합니다. 부량의 편견을 피하기 위해, 우리는 동일한 반점 혈액 흐름을 측정하기 위해 사전에 정의된 압연과 접착력을 계량. 백혈구 유착의 부량는 100μm - 선박 길이 leukocytes의 수를 계산하여 이루어집니다. 롤링은 30 초 동안 같은 100μm 길이가 혈액 속도보다 훨씬 느린 속도로 움직이고 leukocytes의 수를 계산하여 계량입니다. </li></ol> 3. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. 두개골 창을 통해 액세스할 마우스 pial 혈관 네트워크 (단계 2.6) 사진. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2. 마우스 pial 엑기스의 intravital 현미경을위한 세트 (단계 3.1-3.5) 도식 디스플레이까지. 1 : intravital 현미경, 2 : 20X 물 침지 목표, 3 : 광원, 4A : 디지털 낮은 광 고속 카메라, 4B : 아날로그 카메라, 5 stereotaxic 프레임에 마우스, 6 : 컴퓨터 모니터, 7 : 아날로그 시어러 이미지 전단 (화살표)가 혈관 직경을 측정하기위한 것입니다 방법을 보여주는 모니터. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="그림 3"> 그림 3. 고속 형광 영상 레코딩에서 세포 추적하여 (단계 3.6-3.8) Microvascular 적혈구 세포 속도 측정. F에 사진은 카메라에 의해 미세한 구분된 필드를 건너 하나의 움직이는 RBC를 보여주는 한 pial 선박의 시퀀스 이미지입니다. 의 사전 조정 거리와 필드를 건너 15 인 이상 세포의 프레임 위치로 프레임의 수동 결정은 Excel 스프레드 시트의 도움으로 각 선박에 의미 RBC 속도의 계산을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="그림 4"> 그림 4. Plasmodium berghei 앙카 (PBA) 감염된 생쥐 (n은 = 5) 시간이 지남에와 감염되지 않은 컨트롤 마우스의 pial 혈액 흐름의 변화를 보여주는 대표적인 실험 (단계 3.9) 데이터 (n은 = 5). 컨트롤 마우스의 pial 혈액 흐름이 시간이 지남에 따라 상대적으로 안정 반면, PBA에 감염된 마우스는 혈액의 흐름에 표시된 감소를 보여대뇌 말라리아 개발 (6 일)의 시간에. 데이터는 평균 ± SEM 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="그림 5"> 그림 5. Plasmodium berghei 앙카에 감염된 마우스의 pial 선박 자기편 leukocytes의 (단계 4.3) 다수의 같은 반 CD45 - 텍사스 레드 형광 항체와 얼룩으로 나타났다.

<ol><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li>
<li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li>
<li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li>
<li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li>
<li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li>
<li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction%2C+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에서 설명한 intravital 현미경 메서드는 마우스의 pial 엑기스에 대한 자세한 관찰을위한 독특하고 강력한 도구를 제공합니다. 그것은 다른 개인 arterioles 및 venules 뽑아 내서와 같은 혈관 직경, RBC의 판매율, 혈액의 흐름, 준수 및 leukocytes, 혈소판 및 기타 혈액 요소, 혈관 누출, 조직 산도와 pO2의 압연과 같은 매개 변수의 개수의 변화를 측정 수 있으며 잠재적으로 여러 응용 프로그램입니다. 생체내 혈관 반응은 신속 같은 약물 관리 등 중재에 따라 평가, 또는 병적인 과정 동안 수 있습니다. 또한, microcirculatory 동작은 동적으로 시간이 지남에 따라 최대 수 있습니다. 우리는 P.으로 인한 뇌성 말라리아 동안 pial microcirculatory 변화를 연구하기 위해이 기술을 사용한 berghei 마우스에 앙카, 그리고이 모델의 신경 증후군이 감소 대뇌 혈류, vasoconstriction, 장애인 재...

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Carbocyanine 염료 Dil </td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D306</td><td></td></tr><tr><td>Albumin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-TxR 항체</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4517</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. berghei&lt;/em&gt; ANKA-GFP</td><td>MR4</td><td>MRA-865</td><td></td></tr></tbody></table>

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 intravital 현미경

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

이 실험 모델은 생체내 형광 현미경을 사용하여, 급성과 만성, 생리학 및 pathophysiological hemodynamic, 염증 및 대사 조건 중에 마우스 pial 엑기스를 평가하도록 설계되었습니다. 폐쇄 두개골 창이 생쥐의 왼쪽 parieto - 후두 피질을 통해 배치됩니다. 지역 엑기스는 에피와 형광 조명하고, 혈관의 직경 및 적혈구 세포 (RBC) 판매율이 수행되는 측정을 사용하여 창문을 통해 실시간으로 기록됩니다. RBC 속도는 실시간 상호 상관 및 / 또는 형광 라벨이 표시된 적혈구를 사용하여 측정됩니다. 재관류과 혈관 누출의 pial 선박 및 평가 백혈구와 혈소판 준수는 그러한 알부민 - FITC 및 안티 CD45 - TxR 항체로 형광 라벨이 표시된 마커의 도움으로 만들어집니다. 엑기스 반복 며칠 동안 비디오 녹화하실 수 있습니다. 우리는 처음으로 생쥐에서 Plasmodium berghei 앙카 감염의 과정 동안 역동적인 변화를 따라 CM의 표현이 혈액에 깊은 감소, vasoconstriction의 특징 microcirculatory 기능 장애와 관련된 것을 보여주기 위해 pial 엑기스를 연구하기 위해 창 닫기 두뇌 intravital 현미경에 사용 흐름과 혈관 결국 붕괴.

pial 엑기스의 시간적 및 공간적 hemodynamic 및 염증성 이벤트를 따라 Intravital 현미경.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

본 실험 모델은 급성 및 만성, 그리고 생리적 및 병리적 혈역학적 상태에서 마우스의 연질막 미세혈관 순환을 평가하기 위해 설계되었습니다...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 생체 내 현미경 검사(intravital microscopy)를 통해 마우스 뇌의 미세혈관 순환을 연구하는 것으로, 이를 통해 장기간에 걸쳐 모세혈관 미세순환의 혈역학적 및 염증성 마커의 동적인 변화를 추적할 수 있습니다. 이 기술은 La Jolla Bioengineering Institute에서 개발되었으며, 다양한 유형의 연구에 활용되었습니다. 예를 들어, plasmodium burgi onca 감염 과정 중의 혈역학적 변화 추적 및 뇌성 말라리아 발현 시점의 연구 등에 사용되었습니다.이는 먼저 생체 내 현미경 연구 2주 전에 만성 두개창을 이식함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 저배율의 고해상도 디지털 이미지를 사용하여 두개창의 전체적인 형태를 기록하는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 일반 조명 및 형광 조명을 사용하여 생체 내 현미경 이미지를 획득하고, 혈관 직경과 RBC 속도의 실시간 측정을 위한 특정 연구 부위를 선택하는 것입니다.절차의 마지막 단계는 형광 표지된 특이 항체를 통해 뇌혈관 내 백혈구 및 혈소판 부착의 생체 내 분석을 수행하는 것입니다. 최종적으로 뇌 생체 내 현미경 검사를 통해 생리적, 병리적 또는 질환 상태의 모델을 반영하는 뇌 미세 순환의 in vivo 변화를 관찰함으로써, 이러한 상태와 관련된 혈역학적 변화를 확인할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 외부 인자나 인공 배지에 노출시키지 않고 생리적 환경 내의 뇌를 관찰할 수 있다는 점이며, 자기공명영상(MRI) 및 혈관 조영술과 비교하여 공간 및 시간 해상도가 높아 미세 수준까지 관찰이 가능합니다.이 방법은 급성 및 만성 질환 동안의 혈역학적 및 염증성 변화와 같은 뇌 미세순환의 생리학 및 병태생리학에 관한 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 생체 내 현미경 관찰 2~3주 전, 8~10주령 마우스를 대상으로 두개골 절제술을 수행하는데, 이는 기존에 입증된 방식과 동일하나 동물의 머리에 티타늄 바를 배치하지 않는다는 점이 다릅니다. 만성 두개창은 안정적인 준비 과정으로, 실험 당일뿐만 아니라 이식 후 수개월이 지난 후에도 뇌 미세순환을 관찰할 수 있게 합니다.먼저, 동물을 스테레오택식 프레임(stereotaxic frame)에 고정하기 전에 체온을 확인하고, 이전에 준비한 형광 표지 적혈구를 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입합니다. 이를 통해 이후에 시연할 적혈구 추적이 가능해집니다. 그런 다음, 이소플루란(isoflurane)으로 마우스를 가볍게 마취합니다.유도를 위해 4%, 유지 시에는 1~2%를 사용합니다. 다음으로, 가열 패드 위의 정위 고정 틀(stereotaxic frame)에 동물을 엎드린 자세로 놓습니다. 이어바(ear bars)를 사용하여 머리를 조심스럽게 고정하고, 좌우 레버를 사용하여 수평을 조절합니다.미네랄 오일을 적신 면봉으로 두개창(cranial window)의 커버 슬립을 부드럽게 닦아냅니다. 그런 다음 디지털 카메라와 연결된 실체 현미경을 사용하여 창 아래의 혈관을 파노라마 사진으로 몇 장 촬영합니다. 파노라마 사진을 컴퓨터로 전송한 후, 출력하여 식별 및 날짜 표기를 할 가장 적절한 사진을 선택합니다.이 사진은 다음 단계에서 생체 내 현미경 검사를 시작하기 위해 시연할 혈관 직경 및 적혈구 속도 측정의 지도로 사용됩니다. 마우스를 맞춤형 생체 내 현미경 스테이지로 옮기십시오. 치과용 아크릴로 형성된 홈을 이용하여 두개창 위에 물 한 방울을 떨어뜨리십시오.개구수가 0.5인 20배 수침 대물렌즈를 사용합니다. 이미지는 컴퓨터 및 모니터에 연결된 디지털 저조도 고속 카메라와 VCR 테이프, 타임스탬프 및 컬러 모니터에 연결된 저조도 아날로그 카메라의 두 대의 카메라를 사용하여 기록합니다. 측정할 혈관을 선택하기 전에, 혈관들을 확인하여 표본의 품질을 평가하고, 모든 혈관에서 혈류가 흐르고 있다면 측정할 혈관들을 선택하십시오. 선택 대상에는 다양한 직경의 정맥과 동맥이 포함되어야 하며, 윈도우에 의해 노출된 영역 내의 서로 다른 위치를 포함해야 합니다.본 실험에서는 두개창 내의 다양한 영역을 관찰하며 측정 대상 혈관 12개를 선택합니다. 혈관을 선택하기 위해, 앞서 촬영한 PY 혈관 사진에서 측정할 각 지점의 정확한 위치를 표시합니다. 각 지점의 혈관 직경은 이미지 시어(image shear) 장치를 사용하여 측정합니다. 지점이 선택되면 혈관 이미지를 수직 위치로 정렬하고, 반대편까지 이미지를 시어링합니다.양 끝단을 맞추고 측정값을 기록합니다. 적혈주 추적을 위해, 디지털 카메라로 각 지점을 최소 30초 동안 촬영하며, 비디오 영상은 초당 150프레임으로 기록합니다. 이 속도는 최대 6 mm/s의 속도를 결정하기 위해 하나의 비디오 프레임당 세포의 이미지를 1~6장 얻을 수 있도록 설정된 것입니다.데이터 수집이 완료되면, 마우스를 정위 고정 장치에서 분리하고 적절한 소프트웨어를 사용하여 마취에서 회복될 수 있도록 케이지로 되돌립니다. 획득한 비디오 이미지는 디지털화되며, 각 세포 이미지에 대한 XY 좌표 데이터를 얻습니다. 세포의 위치는 이미지 분석이 아닌 수동으로 결정합니다.훈련된 관찰자의 육안은 세포 중심의 위치를 잘 추정할 수 있으며, 이는 일반적으로 관찰되는 최대 형광 위치와 일치합니다. 대부분의 세포 방향에 대해, 각 혈관당 15개 세포의 위치와 속도를 측정합니다. 혈관 직경과 RBC 속도 측정값이 확보되면, 평균을 내어 평균 RBC 속도를 구합니다.각 혈관의 혈류량은 Q = (D/2)² × π × V 공식을 사용하여 계산할 수 있으며, 여기서 Q는 혈류량, V는 RBC 속도, D는 혈관 직경으로, 관류 평가 및 모세혈관 내 백혈구 부착 분석에 사용됩니다. 생체 내 현미경 관찰은 FSE 표지 알부민과 Texas Red로 표지된 범백혈구 마커 CD 45 항체 혼합물을 주입한 동물에서 수행됩니다. 형광 표지된 알부민은 관통 혈관을 포함한 혈관 네트워크의 시각화를 개선하며, 특히 뇌 말라리아와 같은 질환 상태에서 관류되지 않거나 관류가 부족한 혈관을 확인하는 데 유용합니다.형광 표지된 anti CD 45 항체를 사용하면 백혈구가 혈관에 부착하거나 굴러가는 현상을 쉽게 식별하고 정량화할 수 있습니다. 백혈구 부착의 정량화는 100 micron 혈관 길이 내의 백혈구 수를 측정하여 수행합니다. 굴러가는 현상은 동일한 100 micron 길이 내에서 30초 동안 혈류 속도보다 현저히 느린 속도로 이동하는 백혈구의 수를 세어 정량화합니다. 제시됨.다음은 고속 형광 촬영의 세포 추적을 통한 미세혈관 내 적혈구 속도 측정의 예시입니다. 비디오 녹화 영상의 사진 A부터 F는 미세순환의 연속 이미지입니다. 각 사진은 고속 카메라에 의해 프레임별로 캡처된, 흐르고 있는 단일 적혈구의 위치를 나타냅니다.대표적인 실험 결과인 이 그래프는 시간에 따른 뇌혈류의 변화를 보여줍니다. plasmodium, burgi, onca에 감염된 마우스의 경우, 대조군 마우스의 뇌혈류가 시간에 따라 비교적 안정적인 반면, PBA에 감염된 마우스는 뇌 말라리아가 발생하는 시점에 혈류량이 현저히 감소하는 양상을 보입니다.6일 차에 anti CD 45, Texas red 형광 항체로 염색하여 관찰한 결과, plasmodium burgi onca에 감염된 마우스의 모세혈관에 다수의 백혈구가 부착되어 있음을 알 수 있습니다. 이 절차는 오늘 다루는 작업 외에도 광범위하게 응용될 수 있습니다. in vivo에서 사용 가능한 모든 광학 기술을 이 모델에 적용할 수 있으며, 조직, 조직 내 산소 농도, pH, 활성 산소종 및 백혈구와 내피세포의 상호작용과 같은 파라미터를 이 모델을 통해 연구할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

대뇌 피질의 혈류 역학은 2 광자 현미경과 설치류 동물의 꼬리 정맥에 주입 이미징 형광 dextran의 염료에 의해 생체내에서 공부하실 수 있습니다. 이 비디오는 어떻게 유리 커버 두개골 윈도우 준비를 통해 마우스의 네크로 텍스의 이미지 혈류 역학을 보여줍니다.

두개골의 창문을 통해 네크로 텍스의 혈류의 2 광자 이미징을위한 방법

우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

이 비디오에서는 이식된 두개골 창을 통해 마우스 모델에서 사전 주입된 암세포의 생체 내 이미징을 수행합니다. 이 고해상도 타임 랩스 이미징 기술을 통해 살아있는 쥐에서 암세포의 동적 거동을 연구할 수 있습니다.

마우스 모델의 두개창 기반 생체 내 이미징: 쥐 모델의 뇌에서 사전 주입된 암세포의 행동을 연구하기 위한 이미징 기술

출처: Sweeney, AM, et al. 형광 거시경을 이용한 온전한 마우스 두개골을 통한 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징. J. Vis. Exp. (2019) 이 비디오는 형광 영상을 사용하여 마우스 뇌의 뇌척수액(CSF) 흐름을 시각화하는 과정을 보여줍니다. 형광 추적자를 수조 마그나(CM)에 주입하여 지주막하 및 혈관주위 공간을 통해 CSF와의 움직임을 추적할 수 있습니다. 타임랩스 이미징은 추적자의 여정을 포착하여 세동맥을 통해 뇌 조직으로의 분포를 강조합니다.

형광 거시경을 이용한 마우스 뇌에서 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

말단 중간 대뇌 동맥 분기 (MCAO)의 수술 폐색 실험 뇌졸중 연구에서 자주 사용하는 모델입니다. 이 논문은 마우스에서 생체 내에 길이 현미경을위한 기회를 제공하는 측의 두개 창에 삽입, 결합 영구 MCAO의 기본적인 기술을 설명한다.

측면 만성 두개골 창 준비 활성화 생체 마우스의 말초 중간 대뇌 동맥 폐색에 따라 관측

이 원고는 세로 두 광자 현미경을 사용하여 생체 내에서 아밀로이드 플라크 축적 동안 cerebrovasculature의 리모델링을 추적하는 절차를 설명합니다. 얇아진 두개골 제제는 알츠하이머 질환의 마우스 모델에서 뇌 손상의 진행을 평가하기 위해, 형광 염료의 시각화를 가능하게한다.

종<em&gt; 생체</em&gt;은 Cerebrovasculature의 이미징 : CNS 질환에 관련성

경두개 광학 화상 진찰은 온전한 두개골을 통해 살아있는 마우스의 피질에 있는 뇌척수액 수송의 광시야 화상 진찰을 허용합니다.

형광 매크로법을 사용하여 그대로 마우스 두개골을 통해 뇌척수액 수송의 생체 내 이미징

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

이 연구는 이광자 현미경을 사용하여 뉴런 발현 EGFP의 후속 생체 내 이미징을 위해 마우스에 반복적인 외상성 뇌 손상을 전달하고 두개골 창을 동시에 이식하는 방법을 보여줍니다.

Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope(2광자 현미경을 사용한 폐쇄 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스의 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징)

이 프로토콜은 형광 스티렌 미세구를 이용한 생 체 내 2광자 현미경 영상에 최적화된 만성 두개골 창문 및 미세혈관 색전증 마우스 모델에 대한 단계별 접근법을 상세히 설명하고 있습니다.

형광 폴리스티렌 미세구를 이용한 생체 내 2광자 현미경용 미세혈관 색전증 마우스 모델

학습하세요 마우스 뇌 미세순환을 연구하는 생체현미경 기법으로, 만성 두개골 윈도우를 이용하여 혈역학적 변화와 염증 반응을 실시간으로 관찰하는 방법입니다. 이 기술은 뇌 질환 연구에 필수적인 도구입니다.

휴일 두개골 윈도우를 사용하여 마우스 뇌 엑기스의 Intravital 현미경

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