형광 폴리스티렌 미세구를 이용한 생체 내 2광자 현미경용 미세혈관 색전증 마우스 모델

이 미세구체 주입법을 사용하여 모세혈관 차단의 단기 및 장기 영향을 해명하고, 대뇌 모세혈관 네트워크에서 색전이 제거될 잠재적 메커니즘을 조사하는 것을 목표로 합니다. 이 기술은 피질 모세혈관 네트워크 내 형광 입자의 실시간 생체 내 영상 촬영과 추적을 가능하게 합니다. 미세구와 국소 부작용은 주사 후 몇 주간 추적할 수 있습니다.

저희 연구는 미세혈관 폐색으로 인한 국소 조직 손상을 이해하는 데 도움을 줍니다. 이러한 결과는 새로운 치료 전략으로 이어질 수 있기를 기대합니다. 우리는 이제 모세혈관 막힘이 혈관을 변화시키고, 세포를 활성화하며, 혈류를 변화시키고, 혈뇌장벽을 손상시키는 과정을 하루, 그리고 몇 주씩 연구할 수 있습니다.

먼저, 마취된 쥐의 발가락을 꼬집어 마취 깊이를 확인해 보세요. 수술용 가위와 박리 겸자를 사용해 하악골 아래 기관 위 약 0.5cm 중앙선 절개를 합니다. 미세봉합 겸자를 사용해 경추근막 표면의 결합 조직을 해리하여 기저의 흉골 설골근을 노출시킵니다.

이제 왼쪽과 오른쪽 흉골 설골근을 부드럽게 결합 조직을 찢어 분리하세요. 조직 훅으로 오른쪽 오모모하피근을 후리-외측으로 당깁니다. 총경동맥, 내경동맥, 외경동맥을 포함한 오른쪽 경동맥 삼각형이 명확히 보이도록 하세요.

다음으로, 총경동맥 주변에 남아 있는 근막과 지방 조직을 제거합니다. 총경동맥을 미주신경에서 조심스럽게 분리하세요. 총경동맥 주위에 4/0 1.5 실을 두 개 감고 느슨하게 묶어 혈류를 방해하지 않도록 하세요.

내경동맥과 후두정동맥에서 근막과 지방 조직을 제거하세요. 그 후 후두정동맥과 후두동맥을 포함한 모든 내경동맥 측지에 4/0 1.5 실로 매듭을 묶어 임시로 결찰합니다. 외경동맥과 측두동맥에서 근막과 지방 조직을 제거하세요.

외경동맥과 측두동맥 주위에 4/0 사이즈 1.5 실을 사용해 느슨한 매듭 두 개를 만듭니다. 가장 원위쪽 실을 Y자형 분기점에서 최대한 멀리 위치시키고, 이를 이용해 외경동맥과 측두동맥을 영구적으로 결찰하세요. 근접 매듭은 풀어두세요.

10마이크로미터 마이크로스피어를 균질화하고 초음파 처리하여 개별 입자의 균일한 현탁을 얻습니다. 균질화된 마이크로스피어 20마이크로리터와 FITC-덱터런 140마이크로리터를 더하면, 최종 160마이크로리터의 혼합물이 1.44 곱하기 10의 5마이크로스피어 거듭제곱을 얻는다. 카테터에 연결된 주사기를 잠시 당겨 에어록을 만드세요.

그런 다음 카테터 끝을 준비된 FITC-덱스트란/트윈20/마이크로스피어 혼합물에 담그고 주사기를 천천히 당겨 혼합물이 카테터 안에 들어갈 때까지 조절합니다. 카테터 안에 기포가 없는지 확인하세요. 주사기를 주사기 펌프에 넣으세요.

펌프를 분당 10마이크로리터로 설정하고 카테터 끝에 미세구어 혼합물이 작은 방울이 나올 때까지 작동시킵니다. 이제 내경동맥에 혈관 클립을 끼우고, 미리 준비해둔 근위부 매듭 중 하나를 총경동맥 주위에 조여 주세요. 마이크로 가위를 사용해 외경동맥에 결찰 실에서 약 0.5밀리미터 떨어진 곳에 작은 대각선 절개를 하여 절개 크기가 카테터 직경보다 약간 작도록 합니다.

멸균된 천으로 혈액을 흡수하세요. 잠시 주사기 펌프를 작동시켜 카테터 끝에 미세구상 혼합물을 한 방울씩 형성하고, 카테터 끝에 공기가 남아 있지 않는지 확인합니다. 외경동맥 절개부를 열고 미세한 마이크로 겸자로 카테터를 삽입합니다.

그 후 외경동맥 주위의 근위 봉합선을 조여 카테터를 고정합니다. 분당 10마이크로리터로 점차 펌핑하여 동맥이 눈에 띄게 커지고 녹색 FITC 염료가 외경동맥을 채워 성공적인 주입을 확인합니다. 다음으로, 내경동맥에서 혈관 클립을 제거합니다.

그 다음 주사기 펌프 유량을 분당 20마이크로리터로 늘립니다. 후두정동맥 분기점의 내경동맥이 FITC 염료로 채워져 있는지 확인하여 성공적인 미세구어 주입을 확인합니다. 주입이 성공하면, 총경동맥을 연결하던 실을 제거하여 미세구상 혼합물이 내경동맥으로 흐르도록 합니다.

주사 중에도 외경동맥 내에 FITC 염료가 관찰됩니다. 카테터 내 혼합물이 80마이크로리터에 도달하면 주사기를 멈추세요. 그 다음 총경동맥을 결찰하고, 내경동맥을 클립한 뒤 카테터를 부드럽게 제거하며, 고정실은 고정하세요.

카테터를 고정한 실을 조여 외경동맥을 영구적으로 결찰합니다. 혈관 클립과 총경동맥, 내경동맥, 후두정동맥 주변의 실을 제거하여 혈류를 회복하세요. 미세혈관 색전증 수술의 성공은 수술 4일 후 전신 및 전뇌 사후 현장 영상 촬영으로 확인되었습니다.

시상형 뇌 절편에서는 뇌 내 미세구가 머물고 있는 것이 확인되었습니다. 수술 후 하루 촬영한 추출된 쥐 뇌 영상 결과, 미세구체가 주로 동측 반구의 중전동맥 흐름 영역에 박혀 있음이 밝혀졌다. 뇌 절편 내 미세구어 개수는 미세구 혼합물에 Tween20을 추가했을 때 유의미하게 증가했습니다.

쥐들은 Tween20이 포함된 마이크로스피어 혼합물을 주입했을 때 수술 후 체중 감량이 적고 회복 속도도 더 빨랐습니다. 수술 후 0.5시간 후 촬영한 뇌 피질의 형광 현미경 이미지에서는 모세혈관을 막는 미세구체를 나타내는 개별 흰 점들이 보였습니다. 2광자 z-스택 투사 이미지는 미시구가 관류 장애와 함께 뇌 미세혈관 색전증을 유발하는 것을 보여주었습니다.

색전은 혈관에서 눈에 띄는 염료 누출로 인해 혈뇌장벽도 손상됩니다.