Name: 컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 췌장 아일릿 질량, 크기 유통과 건축의 부량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: 배우세요 췌장 아일릿의 대규모 3D 분석 방법을 ImageJ와 Stereo Investigator를 활용하여 정량화합니다. 이 기술은 비만과 당뇨병 연구에서 베타세포 질량 및 아일릿 구조 변화를 정밀하게 측정할 수 있게 합니다.

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연구는에서 지원하는 미국 보건 서비스 그랜트 DK - 081527, DK - 072473 시카고 당뇨병 연구 및 교육 센터 (동물 모델 코어) 대학 및 Kovler 가족 재단에서 선물 DK - 20595.

1. Immunohistochemically 스테인드 이미지의 가상 조각 만들기 <ol><li> 오픈 StereoInvestigator. 현미경 홀더에 샘플을 들고 청소 슬라이드를 삽입하고 "라이브 이미지"(수집 → 라이브 이미지) 후 "취득"을 클릭하고하여 스테레오 인베스티게이터에 그것을 시각화. 각 채널에 대한 노출 수준을 결정, 우리의 구체적인 예제에서, 채널 2 Cy7에 대한 DAPI, Cy5에 대한 GFP, RFP, 채널 5 채널 4 채널 3, 채널 6에 사용됩니다. 노출 수준을 결정하기 위해, 형광의 강도를 표시하는 "비디오 히스토그램"창을 사용합니다. 적절한 형광 농도에 도달하는 경우 비디오 히스토그램의 오른쪽 끝에있는 강도 꼬리 내려. 노출 수준은 "카메라 설정"창에서 변경할 수 있습니다. 비디오 히스토그램은 현미경의 초점 바퀴로 초점을 맞추고 있습니다. </li><li> 가상 슬라이스를 만들기 전에, 기준점을 표시합니다 떨어진 샘플에서 지점에서 화면을 클릭하고, 다음 예제의 개요 주변을 클릭하여 샘플을 컨투어. 등고선이 완료되면 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 시작 및 끝 지점을 연결하는 "닫기 컨투어"를 선택하십시오. </li><li> 등고선이 닫힌 후, 예제에 대한 가상 슬라이스 (취득 → 가상 슬라이스를 취득)을 캡처합니다. 열린 가상 슬라이스 창 옵션 "고속은 취득"뿐만 아니라 자동으로 옆에있는 확인란의 선택을 취소하여 초점을 선택하면 "수동." 파일을 저장합니다. </li><li> 가상 슬라이스 prefocus은 즉, 사이트는 가상 슬라이스 미리보기, 선택에 의해 보정 (오른쪽 클릭 → 사이트 목록을 포커스에 추가)와 수동으로 여러 임의의 부분을 집중해야합니다. 여러 사이트가 집중되었을 경우, 가상 슬라이스 시작 (마우스 오른쪽을 클릭 → Prefocus와 가상 슬라이스를 시작합니다.) 첫 번째 예제의 가상 슬라이스가 완료되면 다음 채널로 전환하고 이에 따라 노출을 조정합니다. 각 채널에 대해 4 단계와 5 단계를 반복합니다. </li></ol> 2. 컴퓨터를 이용한 2 차원 분석 아일 레츠의 부량 <ol><li> 이미지는 다음 첫 번째 (즉, 베타, 알파, 델타 세포 인구의 각 영역과 같은 세포 구성 등 아일 레츠의 특징을 분석 로드된 이미지를 준비하고 단정 "IHCVS"라는 ImageJ 매크로를 사용하여 처리하고, 아일릿 아르 합계 값 구역). 스택은 각 채널 immunohistochemical 얼룩에 따라 별도의 이미지를 보여주는 여기서 ImageJ 년 별도 채널로 나뉩니다. 각각의 이미지가 자동으로 thresholded 이미지의 8 비트 흑백 이미지 또는 마스크, 생산되는 후, thresholded입니다. 별도의 채널 이미지는 다음 복합 마스크로 arithmetically 함께 추가하고, ImageJ에 내장된 입자 분석 합성 이미지에 수행됩니다. </li><li> 하나의 베타 세포보다 작은 입자를 제외 동안 로아는 다음 구분됩니다 (&lt;170 μm의 2,하라 외, 2003.; 지역 ~ 15 μm의의 직경을 사용하여 계산). 결과 로아 분석 및 ImageJ를 사용하여 계량되며 부량는 경계 (주변 거리), 순환성 (숫자 1.0는 완벽한 원을 모습 진원도의 정도), Feret의 직경 (지역 가장 긴 거리)와 센터를 포함할 수 있습니다 각각의 분석 영역에 대한 좌표 있도록 아일릿 분포가 수학적으로 이러한 매개 변수의 다양한 조합을 사용하여 분석하고 3 차원 그래프로 꾸몄다 수있는 데이터가있는 수학적 모델링을 위해 사용됩니다. 단일 가상 슬라이스 이미지는 30 초 이내에 분석이다. 여러 이미지가 ImageJ 매크로 언어가 지원하는 루프 구문에 영상 처리 및 분석 스크립트를 삽입하여 분석하실 수 있습니다. 루프는 주어진 디렉토리에있는 모든 파일을 엽니다 이미지를 분석하고, Excel 파일과 같은 새 위치로 결과를 출력합니다. </li><li> 집계 결과는 이미지에 표시된 해당 숫자와 함께, 같은 지역, 경계, 순환성, Feret의 직경, 각 아일릿에 대한 아일릿 중심지로 데이터를 저장, Excel 스프레드 시트에 저장됩니다. </li></ol> 전산 분석 및 히스토그램 설정 <ol><li> 자동으로 시작되면 실행 Mathematica 스크립트는, 항목 수십만 amounting, 수집된 스프레드 시트 데이터를 처리하는 데 사용됩니다. 실행하는 핵심 프로세스 중 하나는 크기 분포를 조사하고 또한 데이터에 outliers를 결정하는 데 사용되는 히스토그램을 구성 주파수 분석입니다. 스크립트에서 총 아일릿 영역 측정 및 기타 매개 변수에 비해 특히 시간이 지점 또는 췌장의 나이에, 그리고 적절하게 그래프로 표시됩니다. </li></ol> 3. 2 차원 Immunohistochemically 스테인드 가상 슬라이스 이미지의 세 차원 재건 가상 조각의 3D 재건 <ol><li> 해당 디렉토리 (즉, 폴더)로 스크립트를 ( "im_jp2_2_tiff") 복사jp2 이미지가 포함되어 있습니다. 콘솔에 "./im_jp2_2_tiff"를 입력한 다음 Enter 키를 눌러 리눅스 쉘과 함께 스크립트를 실행합니다. 이 스크립트를 실행하면 자동으로 가상 조각의 세 차원 스택의 건설, 부량에서 사용되는 형식입니다 TIFF 파일로 디렉토리에있는 jp2 이미지를 모두 변환합니다. (참고 :. 입력 "chmod를 + X im_jp2_2_tiff"제대로 실행할 수 있도록 스크립트로 텍스트 파일을 변환 스크립트가 실행되지 않는 경우) </li><li> 촬영된 이미지의 모든 jp2에서 TIFF 파일 변환되었을 경우, 그들은 ImageJ에서 분석을 위해 사용될 준비가 된 것입니다. </li><li> ImageJ와 함께, 첫번째 예제 (이 경우 다섯 이미지 : DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7)에 대한 이미지를 모두 열고 하나의 이미지 (이미지 → 색상 → 병합 채널)로 병합. 샘플 각각에 대해이 과정을 반복합니다. 샘플의 모든 단일 이미지로 통합되었을 경우, "다각형 선택"도구를 사용하여 원치 않는 영역을 선택하고 (편집 → 기입)에서 그들을 작성하여 이미지를 청소하십시오. (필요한 경우 작은 크기로 이미지를 크기 조정). 다음 RGB 컬러 이미지 (이미지 → 입력 → RGB 색상)으로 각각의 이미지를 변환합니다. 필요한 경우 마지막으로, 그들은 더 이상 "스택 등록"플러그인에 부합 수있는 후 (스택에 스택 이미지 → → 이미지) 이미지의 스택을 만들 수 있습니다. 궁극적으로, 채널을 합병 후 이미지를 결합하면 전체 췌장에있는 아일 레츠의 모든 3D 몽타주를 만듭니다. 이미지를 보려면, "3D 뷰어."다음 "플러그인"을 클릭하고 </li></ol> 4. 아일릿 매핑 이미지 스택을 수집 <ol><li> 현미경 전체 마운트 췌장 아일 레츠을 ...을 놓다. </li><li> Slidebook 소프트웨어를 여십시오. "Ctrl + Shift + E."를 눌러 "캡처 및 제어를 초점"액세스 "초점 제어"창에서 아일릿의 크기에 따라 20X 또는 40X로 목표를 설정합니다. 물 침지 객관적인 렌즈를 사용하는 경우 물을 적용합니다. </li><li> "초점 컨트롤"창에서 배 및 User1에 필터 설정을 설정하는 "빈"설정 아일 레츠를 찾을 수있는 현미경의 접안 렌즈를 사용하려면. "방출 선택은"100 % 눈 및 1 중립 밀도로 설정해야합니다. 다음 "GFP 어이"을 클릭 "열기 플루어합니다." </li><li> Slidebook에서 샘플을 시각화하기 위해 초점으로 돌아갑니다 윈도우를 제어하고 "라이브"를 클릭하십시오 "필터 설정"스위치 "GFP DS를." 센터 카메라 한 윈도우에 아일릿뿐만 아니라 가능으로 조이스틱을 사용합니다. 어딘가 세포가 쉽게 분별 수 아일릿의 중심 근처의 깊이에 초점. </li><li> 에서 "초점 컨트롤 창"에서 "Z 탭에서"을 선택하십시오. 기준점으로 현재의 깊이를 설정하는 윈도우의 왼쪽 상단에서 설정을 클릭합니다. 기능이 명확하게 분별 수있는 아일릿의 맨 위에 깊이으로 스크롤을 클릭하십시오 범위 컨트롤을 사용 "최고를 설정합니다." 아일릿의 하단으로 스크롤을 클릭 "설정 바텀." 참조 지점으로 돌아갑니다 "GO"를 클릭하십시오. </li><li> 캡처 창에서 "배"를 "빈 팩터"를 설정하고 '필터 설정'설정 '라이브를. " "3D"(오직 3D)에 '캡처 형식 "을 설정합니다. 창의 오른쪽에 "상단 및 하단 위치를 사용합니다"를 클릭하십시오. 클릭 "캡처 후 포인트를 참조로 돌아가기." 에있는 "단계 크기"설정 "3." </li><li> 아래 "필터 설정 상자"를 선택 DAPI dsu, GFP dsu, RFP dsu 및 Cy5 Dsu. 각각 들어, "노출을 조절"다음 선택한 노출 적합한지 확인하기 위해 "테스트"를 클릭 아래의 "최우수 찾기"를 클릭하십시오. 캡처를 시작하려면 "시작"을 클릭하십시오. </li><li> 캡처가 완료되면 필요에 따라 레벨을 조정하고 흰색 RFP에 대한 표시 색상을 변경할 수 있습니다. 슬라이드를 저장하고 → 내보내기 → TIFF 시리즈를보기로 이동합니다. 끝에 대시로 슬라이드의 이름을 입력하고 저장합니다. 개별 TIFF 파일의 수십가 생성되며, 그것이 별도의 폴더에 각 아일릿의 이미지 스택을 유지하기 위해 도움이 될 수도 있습니다. </li></ol> 이미지 스택을 매핑 <ol><li> 스테레오 탐정을 엽니다. 이미지 스택 (파일 → 이미지 → 이미지 스택 스택 열기) 열어 이미지를 시각화. 3.00 μm의에의 "이미지 스케일링 메뉴"SET "이미지 사이의 거리". Slidebook의 배 비닝에 대한 해결하려면 "무시 X와 Y의 스케일링"과 스케일링 "X와 Y의 출처에 대해 지정된 사용자"를 선택하고, X와 Y를 모두 0.65을 입력 </li><li> 에 대한 관심의 아일릿 중간에 클릭하여 센터 이미지 "매크로 창." 적절한 마커를 사용하여 하나 이상의 세포를 표시합니다. 베타 세포가 녹색으로 나타납니다, 알파 세포 붉은 나타납니다, 그리고 델타 세포가 흰색이 나타납니다; 사용 마커 2 (홀로 서클)는 알파 세포를 표시하는 베타 세포, 마커 5 (속이 빈 삼각형) 표시하고, 마커 6 ( 델타 세포에 빈 삼각형). 세포 샘플이 DAPI 물들일되어있다면 파란색으로 나타납니다들은 핵의 중앙에 표시되어야합니다. </li><li> 적어도 하나의 세포가 표시되면, 상단 메뉴에있는 아이콘을 사용하여 "오르토고널보기"를 표시합니다. "Z - 필터"와 확인 "대칭을." 범위의신고해야할 15.00로 설정합니다. 0.0 Z 수준에서 시작, 마우스 휠을 사용하여 아일릿 스크롤하고 적절한 표시와 함께 각 셀에 표시. 각 세포는 그 깊이의 중심에 한 번만 표시되어야합니다. Z - 레벨의 각, "Z - 필터"확인란을 선택하지 수를 표시 마무리시. 이것은 Z - 레벨의 모든에서 마커의 모든 표시됩니다. </li><li> 모든 세포가 표시되면, "DAT"파일 이름으로 파일을 저장 후 → 내보내기 추적을 파일로 이동합니다. "TXT"파일로 추적을 저장합니다. 새로운 아일 레츠를지도하기 전에 작업 영역을 취소합니다 "새 데이터 파일"을 클릭하십시오. </li></ol> 5. 대표 결과 : immunohistochemically 스테인드 췌장 샘플 밖으로 가상 조각의 준비 (모두 함께 아일 레츠 (그림 1A)로 개별적으로 별도의 채널에서 전체 췌장에 (알파, 베타, 델타 - 전지) 내분비 세포의 모든 검사를 수 그림 1B). 컴퓨터 프로그램과 스크립트의 도움으로 대규모 데이터의 대량 분석은 이러한 가상 조각을 수행할 수 있습니다. 특히, 복합 마스크 (그림 1C)의 입자 분석 아일릿 지역, 경계 (주변 거리), 순환성 (1.0 완벽한 원형을 나타냅니다 진원도의 정도)과 같은 매개 변수를 포함하는 통계 테이블로 출력하고, 각 아일릿에 대한 Feret의 직경 (지역 가장 긴 거리) (그림 1D) 발견. 총 아일릿 번호와 사이즈 배포 histograms뿐 아니라 알파, 베타, 델타 세포 분야의 상세한 비교의 생산에서 이러한 이미지 결과의 대규모 분석. 또한, 각 가상 슬라이스는 약 5 μm의 깊이에서 찍은 있으며, 각각의 2D 가상 조각의 모든 추가 전체 췌장 샘플의 3 차원 재건을 만들 정렬됩니다. 아일릿 매핑은 3D에서 아일 레츠를 캡처뿐 아니라 또 다른 인스턴스를 보여줍니다뿐만 아니라 자세한 컴퓨터를 이용한 분석. 아일릿 매핑은 별개의 아일 ​​레츠의 캡처 (그림 2A)과 마킹 이후 구성되어 알파, 베타, 델타 - 세포 다양한 Z - 비행기 (그림 2B)에서 3D로 아일릿 (그림 2C, D)을 시각화합니다. 매핑 아일 레츠의 자동 수학적 분석은 셀 셀 거리 (그림 2E)와 셀 - 셀 거리 배포판 (그림 2 층)의 누적 확률 포함한 세포 조성과 구조를 표시합니다. <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 가상 슬라이스를 사용하는 아일릿 배포판의 대규모 캡처 및 분석. 인간의 췌장 부분 A. 가상 슬라이스 볼 수 있습니다. A. 인슐린에 대한 Immunohistochemical 얼룩 (녹색), 글루카곤 (적색), somatostatin (흰색)와 DAPI (파란색). B. 자동 thresholding 이후 8 비트 마스크를 전환. 박스 지역은 각 채널의 BB보기에서 확대됩니다. A. 델타 세포, B. 베타 세포, C. 알파 - 세포와 D. 합성 이미지를 병합. C. 입자 분석 복합 마스크에 따라 수행했습니다. 작은 셀 클러스터 포함한 각 아일릿 구조 (파란색 강조 표시) 번호입니다. C.에 표시된 태그에 해당하는 ID가 각각의 구조물에 대한 측정 다양한 매개 변수 D. 통계 테이블, <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig2.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 2. Immunohistochemical 가상 슬라이스 분석. 그림 1의 A. 차원 스캐터 줄거리는 같은 지역, 순환성 및 feret의 직경과 같은 매개 변수에 의해 각 아일릿의 크기와 모양 분포를 보여주는. 그림 1의 B. 3 차원 스캐터 줄거리는 셀룰러 아일릿 구성 및 크기를 보여주는. 그림 1에서 전체 인간 섹션 분석 C. 아일릿 크기 분포 lognormal 확률 밀도 분포에 장착되어. 세포 구성 비율 D. 수리 분석 (베타 세포에서 녹색, 파란색 빨간색과 델타 세포에서 알파 - 세포) 그림 1의 각 아일릿 효과 직경 빈하십시오. E. A. 무작위 표본 추출 immunohistochemical 분석 아일릿 크기 분포 (왼쪽). 가상 슬라이스 분석 아일릿 크기 분포 (오른쪽). B. 무작위 샘플링 immunohistochemical 분석 (적색)과 가상 슬라이스 (파란색)의 로그 정상적인 플롯 비교. <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 아일릿 매핑 및 세포 조성과 구조의 수학적 분석. A : 스테레오 - 인베스티게이터에 올린 인간 아일릿의 이미지의 3D 복원 스택 (빨간색 녹색, 알파 세포에서 베타 세포, 흰색 델타 - 세포, 그리고 파란색의 핵)에서 하나의 초점 비행기를 보여주는 화면 - 캡처 . B : 형광 이미지 (왼쪽)와 세 가지 초점 비행기에서 해당 매핑 데이터 (오른쪽) 10 μm의의 간격으로 표시됩니다. C : 3D 복원 아일릿 매핑 데이터의 대표 볼 수 있습니다. D : 아일릿 매핑하여 얻은 좌표에 따라 분기 - 썬 아일릿의 3D 재건. E : 세포 조성과 구조의 수학적 분석. L전자 송금 (EFT). 단세포 인구에서 두 세포 사이의 세포 - 세포 거리의 상대 주파수. 맞아. 서로 다른 두 가지 세포 집단 사이의 셀 - 셀 거리의 상대 주파수. F : Kolmogorov - 스미 르 노프 (KS) 테스트합니다. 왼쪽. 의 누적 확률 휴대 세포에 알파 - 투 - 알파에 대한 거리 배포판, 베타 - 투 - 베타, 델타 - 투 - 델타 세포. 맞아. 해당하는 세 누적 확률에 대한 KS 거리.

<ol><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity+-+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22ISLETS%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> ISLETS. 2, 135-145 (2010).</li>
<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l, Kilimnik, G., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+architecture+-+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22ISLETS%22%5BJournal%5D)">Islet architecture - a comparative study.</a> ISLETS. 1, 129-136 (2009).</li>
<li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li>
<li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 부량 여기 췌장 아일릿 연구에서 4 가지 주요 포인트를 여유 제시 : (1) 췌장 표본의 대규모 분석 전체 아일릿 크기 분포 및 아일릿 아키텍처의 포괄적인 뷰를 제공합니다. (2) 세포 조성과 구조의 3 차원 재구성 및 수학적 분석은 더 아일릿 이내 내분비 세포의 공간적 배열의 시험을 용이하게합니다. (3) 서로 다른 종 간의 다양한 pathophysiological 조건 하에서 동일한 수종의 줬죠 아일릿 소성 오히려 종의 차이보다 신진 대사 변화에 대한 응답으로 evolutionarily 획득한 적응을 제안할 수 있습니다. (4) 특정 유전자 발현의 변화와 함께 내분비 세포 조성과 아일릿 아키텍처의 다시 정리하기는 더욱 intraislet의 내분비 세포 네트워크의 역할의 중요성을 제시의 기능 속성에 아일릿 적응을 반영될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>형광 현미경</td><td>현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-81</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>프로그램</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-GFP 마우스</td><td>마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mathematica</td><td>프로그램</td><td>울프람</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>프로그램</td><td>미국 국립보건원</td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이드북</td><td></td><td>프로그램</td><td>Olympus</td><td></td></tr></tbody></table>

컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 췌장 아일릿 질량, 크기 유통과 건축의 부량

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

췌장 아일릿는 베타 세포 (인슐린), 알파 세포 (글루카곤) 및 exocrine 조직에 포함된 1을 구성하는 델타 - 전지 (somatostatin)와 같은 여러 호르몬 secreting의 내분비 세포로 구성된 독특한 마이크로 기관입니다 - 전체 췌장의 2 %. 신체 및 췌장의 무게 사이에 밀접한 상관 관계가있다. 총 베타 세포 질량은 또한 몸 속에 인슐린의 수요에 대한 보상에 비례하여 증가합니다. 무엇이 비례 확장 아일 레츠의 크기 분포는 탈출. 같은 인간 같은 큰 동물이 마이크로 기관은 기능이 될 수있는 특정 크기 제한을 갖고 제안, 마우스와 유사한 아일릿 크기 배포판을 서로 나누세요. 비례 큰 아일 레츠를 생성하기 위해 대형 동물 pancreata의 무능력은 아일 레츠의 수가 증가하고 전체 아일릿 크기 분포에 큰 아일 레츠의 비율의 증가에 의해 보상됩니다. 또한, 아일 레츠 다양한 pathophysiological 조건 하에서 같은 종 내에서 서로 다른 종 사이 세포 조성과 건축과 또한 인상적인 소성을 나타냅니다. 현재 연구에서 우리는 이러한 역동적인 생물 학적 프로세스와 복잡한 구조의 연구에 대규모 이기종 데이터 컬렉션의 분석을 위해 수 있도록 분석 프로세스의 자동화를 촉진하기 위해 생물 학적 이미지 데이터의 분석을위한 새로운 접근 방법을 설명합니다. 이러한 연구로 인해 불편 샘플링의 기술적 어려움을 방해하고 대규모 데이터를 생성하는 것은 정확하게 아일릿 생물학의 생물 학적 프로세스의 복잡도를 캡처 설정되었습니다. 여기 샘플의 제한된 가용성 (또는 샘플 수집을 최소화하기 위해) 및 표준 실험 설정 이내 편견 &quot;대표&quot;데이터를 수집하고, 아일릿의 복잡한 입체 구조를 정확하게 분석하는 방법을 보여줍니다. 컴퓨터를 이용한 자동화 대규모 데이터 세트의 수집 및 분석을위한 수 있으며, 데이터의 편견 해석을 보장합니다. 또한, 아일릿 크기 분포와 공간 좌표 (즉, X, Y, Z - 위치)의 정확한 양을 정함뿐만 아니라 췌장 아일릿 구조 및 조성의 정확한 시각화로 연결뿐만 아니라, 우리가 변경 조건을 개발하고 적응하는 동안 패턴을 파악할 수 있습니다 수학적 모델링을 통해. 본 연구에서 개발된 방법은뿐만 아니라 다른 많은 시스템과 생물의 연구에 적용됩니다.

immunohistochemically 스테인드 췌장 표본의 대규모 조달 및 분석의 새로운 컴퓨터를 이용한 방법에 설명되어 있습니다 : 전체 섹션 (1) 가상 슬라이스 캡처를, 대규모 데이터 (2) 질량 분석, 2D 가상 조각 (3) 재건 (4) 3D 아일릿 매핑, 그리고 (5) 수학 분석.

췌장 섬은 베타 세포(인슐린), 알파 세포(글루카곤) 등과 같이 호르몬을 분비하는 여러 내분비 세포로 구성된 독특한 미세 기관입니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 제한된 샘플 내에서 편향되지 않은 대표 데이터를 수집하고 조직의 복잡한 3차원 구조를 정밀하게 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 면역조직화학적으로 염색된 췌장 절편의 가상 슬라이스를 캡처합니다. 그 다음, ImageJ 소프트웨어의 IHC 가상 슬라이스 매크로를 사용하여 가상 슬라이스를 정량화하고, Mathematica용으로 작성된 스크립트를 통해 데이터를 분석합니다.다음으로, Image J를 사용하여 가상 슬라이스의 3D 재구성을 수행합니다. 절차의 마지막 단계는 slide book 소프트웨어를 사용하여 개별 islet 이미지 스택을 캡처하고, stereo investigator를 사용하여 이미지 스택을 3차원으로 수동 매핑하는 것입니다. 결과적으로 3D 이미징과 수동 매핑의 결합 방법을 통해 각 islet 세포의 3D 좌표가 포함된 정밀한 islet 구조를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 생리학적 및 병리학적 상태가 췌장 베타 세포 질량, islet 분포 및 구조에 어떤 영향을 미치는지와 같은 비만 및 당뇨병 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.베타 세포 질량 변화에 대한 더 깊은 이해는 치료적 개입의 개발과 평가를 촉진할 것이므로, 이 기술의 시사점은 비만 및 당뇨병(diabetes Melitis)의 진단 또는 치료로 확장됩니다. 본 연구에서 설명한 방법은 특히 췌장의 역동적인 면역조직화학적 분석에 대한 통찰력을 제공하지만, 다양한 다른 생물체와 조직에도 적용될 수 있습니다. 컴퓨터 보조 분석 단계는 학습하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.2차원 및 3차원에서 이러한 대규모 데이터 세트를 분석하는 과정이 복잡하기 때문입니다. 화학적으로 염색된 췌장 면역조직화학 절편 전체가 놓인 깨끗한 슬라이드를 형광 현미경 홀더에 배치하여 이 절차를 시작하십시오. Stereo Investigator 소프트웨어를 실행하고 acquisition을 클릭하여 샘플을 시각화하십시오.그다음 라이브 이미지 모드로 전환합니다. 형광 강도를 나타내는 비디오 히스토그램 창을 사용하여 각 채널의 노출 수준을 결정합니다. 이 예시에서는 채널 2를 DAP P에, 채널 3을 GFP에, 채널 4를 RFP에, 채널 5를 sci 5에, 그리고 채널 6을 SCI 7에 사용합니다.카메라 설정 창을 사용하여 형광 강도가 서서히 감소하도록 노출 수준을 조정하십시오. 비디오 히스토그램의 오른쪽 끝을 보며 현미경 초점 조절 휠로 이미지의 초점을 맞출 수 있습니다. 가상 절편(virtual slice)을 생성하기 전, 샘플에서 떨어진 화면상의 한 지점을 클릭하여 기준점을 표시함으로써 샘플의 윤곽을 잡으십시오.그 후 윤곽선 작업이 완료되면 샘플의 외곽선을 따라 클릭하십시오. 윤곽선이 닫히면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 'close contour'를 선택하여 시작점과 끝점을 연결한 다음, 'acquisition'을 선택하고 'acquire virtual slice'를 클릭하여 샘플의 가상 슬라이스를 캡처하십시오. 가상 슬라이스 창 옵션이 열리면 'high speed acquire'를 선택하고 'manual' 옵션을 비활성화하십시오.manual 옆의 확인란을 해제하여 포커싱을 설정합니다. 파일을 저장합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 focus site list에 추가를 선택하여 prefo를 교정합니다.가상 슬라이스 미리보기에서 무작위로 여러 구역의 초점을 수동으로 맞춥니다. 여러 지점의 초점이 맞춰지면, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 'Start virtual slice with prefo'를 선택하여 가상 슬라이스를 시작합니다. 첫 번째 샘플의 가상 슬라이스가 완료되면, 다음 채널로 전환하고 노출을 적절히 조정합니다. 이 과정을 각 채널마다 반복하여 아이렛(eyelets)의 정량 분석을 수행합니다. I-H-C-V-S라는 이름의 ImageJ 매크로를 사용하여 이미지를 처리하며, 이 매크로는 먼저 로드된 이미지를 분석 가능하게 준비한 다음 세포 구성과 같은 아이렛의 특징을 정량화합니다.I-H-C-V-S 매크로는 스택을 각각의 색상 채널로 분리합니다. ImageJ에서 각 이미지를 8비트 흑백 마스크로 변환합니다. 자동 강도 임계값 설정 후, 분리된 채널 이미지들을 산술적으로 합산하여 복합 마스크를 생성합니다.합성 이미지에 대해 Image J의 내장 입자 분석(particle analysis) 기능을 사용하여 베타 세포 하나보다 작은 입자들은 제외하고 관심 영역(ROI)을 식별합니다. Image J를 이용한 ROI 정량화를 통해 세포 파라미터가 포함된 스프레드시트를 생성합니다.집계된 결과를 Excel 스프레드시트에 저장하십시오. 각 아이렛(eyelet)에 대한 면적, 둘레, 원형도, 페룰(fer) 직경, 아이렛 중심과 같은 데이터와 이미지에 표시된 해당 번호를 함께 저장합니다. 이러한 파라미터의 계산 분석은 서면 프로토콜에 기술된 대로 수행할 수 있습니다. 아이렛 분포 및 빈도 분석을 포함한 정보를 확인하려면, 디렉토리 내의 모든 JPG 이미지를 TIF 파일로 변환하는 스크립트를 실행하여 가상 단면의 3D 재구성을 수행하십시오. TIF는 가상 단면으로부터 3차원 스택을 구축하고 정량화하는 데 사용되는 형식입니다.여기서는 I MJ two two tiff라는 스크립트가 사용됩니다. 해당 스크립트를 JP two 이미지들이 포함된 디렉토리에 복사하십시오. 콘솔에 dot slash I am JP two two TIFF를 입력하고 엔터 키를 눌러 리눅스 쉘에서 스크립트를 실행하십시오.캡처한 모든 이미지가 JPEG2에서 TIFF 파일로 변환되면, Image J에서 분석에 사용할 준비가 된 것입니다. Image J를 사용하여 첫 번째 샘플(이 경우 인간 태아 췌장)의 모든 이미지를 열고, Image, Color, Merge Channels를 순서대로 선택하여 하나의 이미지로 병합합니다. 모든 샘플이 단일 이미지로 병합될 때까지 각 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다. 다각형 선택 도구(polygon selections tool)를 사용하여 원하지 않는 영역을 선택함으로써 이미지를 정리합니다.'편집(edit)'을 선택한 다음 '채우기(fill)'를 클릭하여 채웁니다. 각 이미지를 RGB 컬러 이미지로 변환하십시오. 마지막으로 이미지들로 스택(stack)을 생성하며, 이후 stack reg 플러그인을 사용하여 추가로 정렬할 수 있습니다.최종적으로, 채널을 병합하고 이미지를 결합하면 췌장 전체의 모든 아일렛(eyelets)에 대한 3D 몽타주가 생성됩니다. 이미지 스택을 수집하려면, 전체 마운트된 췌장 아일렛을 현미경 아래에 배치하십시오. 수침식 대물렌즈를 사용하는 경우 물을 도포하십시오.슬라이드 북 소프트웨어를 실행하고, 포커스 제어 창에서 Ctrl+Shift+E를 눌러 캡처 및 포커스 제어 메뉴에 접속하십시오. 아이렛의 크기에 따라 대물렌즈를 20배 또는 40배로 설정하십시오. 현미경 접안렌즈를 사용하여 아이렛의 위치를 찾으려면 bin을 2배로 설정하고 필터 세트를 user 1로 설정하십시오.초점 제어 창에서 방출 선택을 100%로 설정하고, 중성 농도를 한 클릭 GFP ey로 설정한 다음, 슬라이드 북에서 샘플을 시각화하기 위해 바닥면(floor)을 엽니다. 다시 초점 제어 창으로 돌아가 필터 세트를 fix로 전환합니다. 그런 다음 G-F-P-D-S를 클릭합니다. 조이스틱을 사용하여 카메라 1 창에서 아이렛(eyelet)을 최대한 중앙에 맞춥니다.세포를 쉽게 식별할 수 있는 아이렛(eyelet) 중심 부근의 깊이에 초점을 맞춥니다. 초점 제어 창에서 zab을 선택하십시오. 스코프 제어기를 사용하여 특징이 명확하게 식별되는 아이렛의 최상단 깊이까지 스크롤한 후, set top을 클릭하십시오.아이렛(eyelet)의 맨 아래로 스크롤한 후 '설정(set)'을 클릭하십시오. 하단 클릭 후 '시작(go)'을 누르십시오. 캡처 창의 기준점으로 돌아가려면 '고급(advanced)'을 클릭한 다음 '채널 모드(channel mode)'의 '대체(alternate)'를 클릭하십시오.창의 오른쪽에서 bin factor를 2배로, capture type을 3D로 설정하십시오. use top and bottom positions와 return to center volume after capture를 클릭하십시오. step size를 3으로 설정하십시오. filter set 박스 아래에서 filter set을 live로 설정하십시오.DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U 및 SCI five DSU를 선택하십시오. 각각의 항목에 대해 노출 조정(adjust exposure) 아래의 최적값 찾기(find best)를 클릭하십시오. 그런 다음 테스트(test)를 클릭하여 선택한 노출 값이 적절한지 확인하십시오.시작을 클릭하여 캡처를 시작하십시오. 캡처가 완료되면 필요에 따라 레벨을 조정하고 RFP의 표시 색상을 흰색으로 변경하십시오. 슬라이드를 저장하고 TIFF 시리즈 내보내기 뷰로 이동하십시오.슬라이드 이름 끝에 대시(-)를 입력하고 저장하십시오. 수십 개의 개별 TIF 파일이 생성되므로, 각 아이렛(eyelet) 이미지 스택을 별도의 폴더에 보관하는 것이 유용할 수 있습니다. 이미지 스택을 매핑하려면 Stereo Investigator 소프트웨어를 실행하십시오.이미지 스케일링 메뉴에서 이미지 스택을 열어 이미지를 시각화하십시오. 2배 굴절을 보정하기 위해 이미지 간 거리를 3 µm로 설정하십시오. 슬라이드 북(slide book)에서 X 및 Y 스케일링 재정의(override X and Y scaling)를 선택하고, X 및 Y 스케일링 소스로 지정된 값(specified)을 사용하십시오.X 및 Y 중심값에 각각 0.65를 입력하고 확대 버튼을 클릭하여 이미지를 확대하십시오. 그다음 매크로 창에서 관심 있는 섬(islet)의 중앙에 있는 세포를 최소 하나 이상 표시하십시오. 적절한 마커를 사용하면 베타 세포는 녹색으로, 알파 세포는 빨간색으로, 델타 세포는 흰색으로 표시됩니다.DPI로 염색된 샘플의 경우 핵이 파란색으로 나타나는데, 핵의 중심부를 표시하십시오. 마커 2로 베타 세포를, 마커 5로 알파 세포를, 마커 6으로 델타 세포를 표시하십시오. 최소 하나 이상의 세포가 표시되면 상단 메뉴의 아이콘을 사용하여 직교 뷰(orthogonal view)를 표시하고, Z 필터와 대칭(symmetric) 항목을 확인하십시오.범위는 15.00으로 설정해야 합니다. 0.0 Z에서 시작하십시오. 마우스 휠을 사용하여 아이렛(eyelets)을 스크롤하고, 각 세포의 깊이 중심부에 적절한 마커로 한 번씩만 표시하십시오. 각 Z 레벨의 표시를 모두 마치면 Z 필터 체크 박스의 선택을 해제할 수 있습니다.이렇게 하면 모든 Z 레벨의 모든 마커가 표시됩니다. 모든 세포에 마킹을 완료한 후, 파일을 DAT 파일로 저장하십시오. 그런 다음 파일의 tracing 내보내기(export tracing)로 이동하십시오.트레이싱 결과물을 TXT 파일로 저장하십시오. 마지막으로, 새로운 아이렛(eyelet) 매핑을 시도하기 전에 'new data file'을 클릭하여 작업 공간을 비웁니다. 면역조직화학 염색된 췌장 시료로부터 가상 슬라이스를 제작하면, 췌장 전체의 알파, 베타 및 델타 내분비 세포를 췌도(islets)로서 함께 관찰할 수 있습니다. 인슐린에 대한 면역조직화학 염색은 녹색, 글루카곤은 적색, 소마토스타틴은 백색, 그리고 dap는 청색으로 나타납니다.그 후 자동 임계값 설정을 통해 이미지를 8비트 마스크로 변환하였습니다. 여기에는 병합된 합성 이미지가 표시되어 있습니다. 하지만 가상 슬라이스를 이용한 eyelet 분포 분석을 통해 개별 채널에서의 개별 분석 또한 가능합니다.여기에서는 delta 세포, beta 세포 및 alpha 세포를 드러내기 위해 각 채널의 뷰를 보여줍니다. 각 eyelet 구조에 번호를 매기고 파란색으로 강조 표시한 복합 마스크를 사용하여 입자 분석을 수행했습니다. 복합 마스크의 입자 분석 결과는 검출된 각 eyelet의 Islas 면적, 둘레, 원형도 및 다양한 직경과 같은 파라미터를 포함하는 데이터 테이블로 출력되며, 각 ID는 복합 마스크의 번호 표시 태그와 일치합니다.이러한 이미지들에 대한 대규모 분석을 통해 전체 아일렛(eyelet) 수와 크기 분포 히스토그램을 생성하며, 알파, 베타 및 델타 세포 영역에 대한 상세한 비교 분석을 수행합니다. Stereo Investigator에 업로드된 인간 아일렛의 3D 재구성 이미지 스택으로부터 세포 구성 및 구조의 매핑과 수학적 분석을 통해 단일 초점 평면을 확인할 수 있습니다. 여기서 베타 세포는 녹색, 알파 세포는 적색, 델타 세포는 백색, 그리고 핵은 청색으로 표시됩니다.개별 아이렛(eyelet)을 캡처한 후, 여기의 다양한 해수면 평면에서 알파, 베타 및 델타 세포를 표시하였으며, 10 microns 간격의 세 가지 서로 다른 초점 평면에 대한 형광 이미지와 해당 맵 데이터가 표시되어 있습니다. 다양한 평면에서 알파, 베타 및 델타 세포가 표시되면, 아이렛을 3D로 시각화할 수 있습니다. 여기에는 아이렛 매핑을 통해 얻은 좌표를 기반으로 한 4분할 절단 아이렛의 3D 재구성 모습이 나타나 있습니다.또한, 매핑된 아이렛(eyelet)의 자동화된 수학적 분석을 통해 세포 구성과 구조를 나타낼 수 있습니다. 여기에서는 단일 세포 집단 내의 두 세포 간 거리의 상대 빈도를 보여줍니다. 또한, 서로 다른 두 세포 집단 간의 세포 거리의 상대 빈도도 함께 제시되어 있습니다.또한 alpha-alpha, beta-beta 및 delta-delta 세포 간 거리 분포의 누적 확률이 표시되어 있습니다. 이러한 확률에 대해 Kolmogorov-Smirnov(KS) 검사를 수행하여 해당 KS 거리값을 얻을 수 있습니다. 숙련되면 조직 절편 전체에 대한 대규모 이미징 및 분석을 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.조직 블록의 3D 재구성은 30분 이내에 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 적절하게 수행한다면 3D 이미징과 수동 매핑을 4시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 섹션의 고품질 면역조직화학 염색부터 시작하는 것이 중요합니다.이후 분석의 정확도는 모두 원천 데이터에 달려 있습니다. 또한, 개발 후 이러한 대규모 분석을 처리하기 위해 컴퓨터에 최소 8GB의 RAM이 확보되었는지 확인하십시오. 이 기술은 비만 및 당뇨병 분야뿐만 아니라 표준 병리학적 분석을 사용하는 많은 다른 분야의 연구자들에게 길을 열어주었습니다.이 방법은 특히 샘플의 가용성이 제한적일 때 유용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 표준 기술을 사용하여 제한된 샘플 크기 내에서 편향되지 않은 대표 데이터를 수집하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 췌장 소도 분포 연구에서 보여준 바와 같이, 특정 영역만 선택하는 것은 전체 상황을 대표하지 못할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

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여기에서, 우리는 췌도 세포와 같은 이기종 세포 집단에 있는 칼슘 역학을 화상 진찰 그리고 정량화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 형광 기자는 그 때 고정화되고 심상되는, 그리고 형광 강렬의 역학의 세포 당 분석이 수행되는 작은 틀 내의 세포의 말초 층으로 전달됩니다.

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이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.

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이 프로토콜은 거의 생리학적 조건에서 세포 기능을 연구하기 위해 사망한 장기 기증자로부터 인간 췌장 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 혁신적인 접근법은 정상 및 구조적으로 손상된 섬과 내분비 구획 간의 복잡한 상호 작용을 조사할 수 있게 합니다.

내분비 및 외분비 췌장 생리학을 연구하기 위해 인간 췌장 조직 절편 생성

Metagenomic 도서관 대규모 화면

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