컴퓨터를 이용한 대규모 시각화 및 췌장 아일릿 질량, 크기 유통과 건축의 부량

이 절차의 전반적인 목표는 제한된 샘플 내에서 편향되지 않은 대표 데이터를 수집하고 조직의 복잡한 3차원 구조를 정확하게 분석하는 것입니다. 이는 먼저 화학적으로 염색된 췌장 절편인 면역노히스토의 가상 조각을 캡처하여 수행됩니다. 그런 다음 이미지 J 소프트웨어의 IHC 가상 슬라이스 매크로를 사용하여 가상 슬라이스를 정량화하고 Mathematica를 위해 작성된 스크립트로 데이터를 분석합니다.

다음으로, 이미지 J를 사용하여 가상 슬라이스의 3D 재구성을 수행합니다.절차의 마지막 단계는 슬라이드 북 소프트웨어를 사용하여 개별 섬 이미지의 스택을 캡처하고 스테레오 조사자를 사용하여 이미지 스택을 3차원으로 수동으로 매핑하는 것입니다. 궁극적으로 각 아일릿 세포에 대한 3D 좌표를 가진 정밀한 아일릿 아키텍처는 3D 이미징과 수동 매핑의 결합된 방법을 통해 얻을 수 있습니다. 이 방법은 생리학적 및 생리학적 조건의 경로가 췌장, 베타 세포 질량 구멍 분포 및 구조에 미치는 영향과 같은 비만 및 당뇨병 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 의미는 베타 세포 질량의 변화에 대한 더 나은 이해가 치료 개입의 개발 및 평가를 용이하게 하기 때문에 비만 및 당뇨병 Melitis의 진단 또는 치료로 확장됩니다. 본 연구에서 구체적으로 설명한 방법은 췌장의 동적 면역조직화학적 분석에 대한 통찰력을 제공하지만, 다른 유기체 및 조직의 배열에도 적용될 수 있습니다. 컴퓨터 지원 분석 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다.

이러한 대규모 데이터 세트를 2차원과 3차원으로 분석하는 것이 복잡하기 때문입니다. 화학적으로 염색된 면역조직항체의 전체 부분을 형광 현미경 홀더에 넣는 깨끗한 슬라이드를 놓아 이 절차를 시작합니다. 스테레오 조사자 소프트웨어를 열고 acquisition을 클릭하여 샘플을 시각화합니다.

그리고 라이브 이미지. 형광의 강도를 표시하는 비디오 히스토그램 창을 사용하여 각 채널의 노출 수준을 확인합니다. 이 예에서 채널 2는 RFP의 경우 GFP 채널 4의 경우 DAP P 채널 3, sci 5의 경우 채널 5, SCI 7의 경우 채널 6에 사용됩니다.

카메라 설정 창을 사용하여 형광 강도가 꼬리를 내리도록 노출 수준을 조정합니다. 비디오 히스토그램의 오른쪽 끝에서 현미경 초점 휠로 이미지의 초점을 맞출 수 있습니다. 가상 슬라이스를 만들기 전에 샘플에서 떨어진 지점에서 화면을 클릭하여 샘플의 윤곽을 그리면 기준점이 표시됩니다.

그런 다음 윤곽이 완성되면 샘플의 윤곽선 주위를 클릭합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Close contour를 선택하여 윤곽이 닫히면 시작점과 끝점을 연결하고, Acquisition을 선택하여 샘플에 대한 가상 슬라이스를 캡처한 다음 가상 슬라이스를 획득합니다. 가상 슬라이스 창 옵션이 열리면 고속 획득을 선택하고 수동으로 비활성화합니다.

manual 옆에 있는 상자를 선택 취소하여 초점을 맞춥니다. 파일을 저장합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 포커스 사이트 목록에 추가를 선택하여 prefo를 보정합니다.

가상 슬라이스 미리보기에서 여러 임의 섹션에 수동으로 초점 맞추기 여러 사이트에 초점이 맞춰지면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 선택하여 가상 슬라이스를 시작합니다. 첫 번째 샘플에 대해 가상 슬라이스가 완료된 후 prefo로 가상 슬라이스를 시작하고 다음 채널로 전환하고 그에 따라 노출을 조정합니다. 이 절차는 각 채널에 대해 반복되어 구멍의 정량화를 수행하고, I-H-C-V-S라는 이미지 J 매크로를 사용하여 이미지를 처리하며, 먼저 분석을 위해 로드된 이미지를 준비한 다음 세포 구성과 같은 구멍의 특징을 정량화합니다.

I-H-C-V-S 매크로는 스택을 해당 색상 채널로 분할합니다. 이미지 J에서 J는 각 이미지를 8비트 흑백 마스크로 변환합니다. 자동 강도 후 임계값을 설정하고 개별 채널 이미지를 산술적으로 복합 마스크에 추가합니다.

그런 다음 복합 이미지에 대한 Image J의 내장 입자 분석을 통해 하나의 베타 세포보다 작은 입자는 제외하면서 관심 영역 또는 ROI를 식별합니다. ROI의 정량화. 영상 J를 사용하면 셀 파라미터로 구성된 스프레드시트가 생성됩니다.

집계된 결과를 Excel 스프레드시트에 저장합니다. 각 구멍의 면적 둘레 원형도, fer 직경 및 구멍 중심과 같은 데이터를 이미지에 레이블이 지정된 해당 번호와 함께 저장합니다. 이러한 매개변수의 전산 분석은 아일릿 분포 및 빈도 분석을 포함한 정보를 밝히기 위해 디렉토리에 있는 모든 JP 2 이미지를 가상 슬라이스에서 3차원 스택의 구성 및 정량화에 사용되는 형식인 TIF 파일로 변환하는 스크립트를 실행하여 가상 슬라이스의 3D 재구성을 수행할 수 있습니다.

여기서는 I MJ two two tiff라는 스크립트가 사용됩니다. JP 두 이미지가 포함된 디렉토리에 스크립트를 복사합니다. 콘솔에 dot slash I am JP two two TIFF를 입력한 다음 Enter 키를 눌러 Linux 셸로 스크립트를 실행합니다.

캡처된 모든 이미지가 JP 2에서 TIFF 파일로 변환되면 이미지 J에서 분석에 사용할 준비가 된 것입니다.이미지 J를 사용하여 첫 번째 샘플에 대한 모든 이미지(이 경우 인간 태아 췌장에서 가져온 이미지)를 열고 이미지, 색상, 그런 다음 채널을 병합합니다. 모든 샘플이 단일 이미지로 결합되었을 때 각 샘플에 대해 이 프로세스를 반복합니다. polygon selections 도구로 원하지 않는 영역을 선택하여 이미지를 정리합니다.

편집을 선택하여 채운 다음 채웁니다. 각 이미지를 RGB 컬러 이미지로 변환합니다. 마지막으로, 이미지에서 스택을 만든 후 stack reg 플러그인과 추가로 정렬할 수 있습니다.

궁극적으로 채널을 병합하고 이미지를 결합하면 전체 췌장에 있는 모든 구멍의 3D 몽타주가 생성됩니다. 이미지 스택을 수집하려면 전체 마운트 췌장 구멍을 현미경 아래에 배치합니다. 침수 대물 렌즈를 사용하는 경우 물을 바르십시오.

슬라이드 북 소프트웨어를 열고 초점 제어 창에서 control과 shift plus E를 눌러 캡처 및 초점 제어에 액세스합니다. 구멍의 크기에 따라 대물렌즈를 20회 또는 40회로 설정합니다. 현미경 접안렌즈를 사용하여 구멍을 찾으려면 빈을 두 번으로 설정하고 필터 세트를 사용자 1로 설정합니다.

초점 제어 창에서 방출 선택은 100% Eyes로 설정해야 합니다.중립 밀도의 눈은 한 번의 클릭으로 GFP ey로 설정해야 합니다., 그런 다음 바닥을 열어 시각화해야 합니다.amp슬라이드 북의 파일, 초점 제어 창으로 돌아가서 필터 세트를 고정으로 전환합니다. 그런 다음 G-F-P-D-S를 클릭합니다. 조이스틱을 사용하여 가능한 한 한 개의 창에서 카메라의 구멍 중앙에 구멍을 배치합니다.

세포를 쉽게 식별할 수 있는 구멍의 중앙 근처 어딘가에 초점을 맞춥니다. 초점 제어 창에서 zab을 선택합니다. 범위 컨트롤을 사용하여 특징을 명확하게 식별할 수 있는 구멍의 맨 위 깊이로 스크롤하고 맨 위로 설정을 클릭합니다.

작은 구멍의 맨 아래로 스크롤하고 설정을 클릭합니다. 아래쪽 클릭 이동을 클릭합니다. 캡처 창에서 참조 지점으로 돌아가려면 고급을 클릭한 다음 채널 모드 대체를 클릭합니다.

창 오른쪽에서 bin factor를 두 번으로, capture type을 3D로 설정하고 위쪽 및 아래쪽 위치를 클릭하여 캡처 후 중앙 볼륨으로 돌아갑니다. 단계 크기를 3으로 설정합니다. 필터 세트를 필터 세트 상자 아래에 있도록 설정합니다.

DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-u 및 SCI five DSU를 선택합니다. 각각에 대해 adjust exposure(노출 조정)에서 find best(최적 찾기)를 클릭합니다. 그런 다음 테스트를 클릭하여 선택한 노출이 적합한지 확인합니다.

시작을 클릭하여 캡처를 시작합니다. 캡처가 완료되면 필요에 따라 레벨을 조정하고 RFP에 대해 표시된 색상을 흰색으로 변경합니다. 슬라이드를 저장하고 TIFF 시리즈 내보내기 보기로 이동합니다.

끝에 대시가 있는 슬라이드 이름을 입력하고 저장합니다. 수십 개의 개별 TIF 파일이 생성되므로 각 구멍 이미지 스택을 별도의 폴더에 보관하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이미지 스택을 매핑하려면 스테레오 조사기 소프트웨어를 엽니다.

이미지 스케일링 메뉴에서 이미지 스택을 열어 이미지를 시각화합니다. 이미지 사이의 거리를 3미크론으로 설정하여 두 번 굽힘을 보정합니다. 슬라이드 북에서 X 및 Y 배율 재정의를 선택하고 x 및 Y 배율 소스에 대해 지정된 를 사용합니다.

X 및 Y 센터 모두에 0.65를 입력하고 확대/축소 버튼을 클릭하여 이미지를 확대한 다음 매크로 창 시장에서 관심 있는 일리스 중간에 하나 이상의 셀을 확대합니다. 적절한 마커를 사용하면 베타 셀이 녹색으로 나타납니다. 알파 셀은 빨간색으로 표시되고 델타 셀은 흰색으로 표시됩니다.

핵 중앙에 있는 세포를 표시하면 샘플이 DPI 마커 2로 염색된 경우 파란색으로 나타나고 마커 2를 사용하여 베타 세포를 표시합니다. 마커 5는 알파 셀을 표시하고, 마커 6은 델타 셀을 표시합니다. 하나 이상의 셀이 표시되면 상단 메뉴의 아이콘을 사용하여 직교 보기를 표시하고 Z 필터 및 대칭을 선택합니다.

범위는 15.00으로 설정해야 합니다. 0.0 Z.에서 시작하여 마우스 휠을 사용하여 구멍을 스크롤하고 각 셀을 적절한 마커로 표시하고 각 셀을 깊이 중심에 한 번만 표시합니다. 각 Z 레벨 표시를 마치면 Z 필터 확인란을 선택 취소할 수 있습니다.

이렇게 하면 모든 Z 레벨의 모든 마커가 표시됩니다. 모든 셀이 표시되면 파일을 DAT 파일로 저장합니다. 그런 다음 파일 내보내기 추적으로 이동합니다.

추적을 TXT 파일로 저장합니다. 마지막으로, 새 구멍 매핑을 시도하기 전에 새 데이터 파일을 클릭하여 작업 공간을 지웁니다. 면역조직화학물질로 염색된 췌장 샘플에서 가상 슬라이스를 준비하면 전체 췌장의 알파, 베타 및 델타 내분비 세포를 함께 검사할 수 있으며, 인슐린에 대한 면역조직화학적 염색은 녹색, 글루카곤은 빨간색, 소마토스타틴은 흰색, DAP는 파란색으로 볼 수 있습니다.

그런 다음 이미지는 자동 임계값 설정 후 8비트 마스크로 변환되었습니다. 다음은 병합 복합 이미지입니다. 그러나 가상 슬라이스를 사용한 아일릿 분포를 통해 별도의 채널에서 개별 분석도 가능합니다.

여기에서 각 채널의 보기는 델타 셀, 베타 셀 및 알파 셀을 나타냅니다. 복합 마스크에 대해 수행된 입자 분석은 각 구멍 구조에 번호가 매겨지고 파란색으로 강조 표시됩니다. 복합 마스크의 입자 분석은 Islas 면적 둘레 원형도 및 감지된 각 구멍에 대한 다양한 직경과 같은 매개변수를 포함하는 데이터 테이블로 출력되며, 이러한 매개변수는 복합 마스크의 번호가 매겨진 태그에 해당하는 ID를 갖습니다.

이러한 이미지의 대규모 분석을 통해 총 구멍 수 및 크기 분포 히스토그램을 생성할 수 있을 뿐만 아니라 알파, 베타 및 델타 세포 영역을 자세히 비교할 수 있습니다. 아일릿 매핑과 세포 구성 및 구조에 대한 수학적 분석은 스테레오 조사자에 업로드된 인간 아일릿의 3D 재구성 이미지 스택에서 단일 초점면을 드러낼 수 있습니다. 여기서 베타 세포는 녹색, 알파 세포는 빨간색, 델타 세포는 흰색, 핵은 파란색입니다.

뚜렷한 구멍을 포착한 후 알파, 베타 및 델타 세포가 이곳의 다양한 해상 평면에 표시되고, 형광 이미지 및 해당 지도 데이터가 10미크론 간격으로 세 개의 서로 다른 초점면에 대해 표시됩니다. 알파, 베타 및 델타 셀이 다양한 평면에 표시되면 구멍을 3D로 시각화할 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 아일릿 매핑으로 얻은 좌표를 기반으로 한 쿼터 슬라이스 아일렛의 3D 재구성입니다.

또한 매핑된 구멍의 자동화된 수학적 분석은 세포 구성 및 구조를 표시할 수 있습니다. 여기서, 단일 세포 집단에서 두 세포 사이의 세포 거리의 상대적 빈도가 표시됩니다. 또한 두 개의 서로 다른 세포 집단 사이의 세포 세포 거리의 상대적 빈도도 표시됩니다.

또한 알파에서 알파, 베타에서 베타, 델타에서 델타 세포에 대한 세포 간 거리 분포의 누적 확률도 표시됩니다. 이러한 확률에 대해 cole OV smirnov 또는 KS 검정을 수행하여 해당 KS 거리를 얻을 수 있습니다. 일단 마스터하면 전체 조직 절편에 대한 대규모 이미징 및 분석을 4시간 내에 수행할 수 있습니다.

조직 블록의 3D 재구성은 30분 안에 완료할 수 있습니다. 마지막으로, 3D 이미징 및 수동 매핑은 적절하게 수행되면 4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 단면의 고품질 면역조직화학적 염색으로 시작하는 것이 중요합니다.

후속 분석의 정확도는 모두 원시 데이터에 따라 달라집니다. 또한 개발 후 이러한 대규모 분석을 처리할 수 있는 최소 8GB의 RAM이 컴퓨터에 있는지 확인하십시오. 이 기술은 비만과 당뇨병 분야뿐만 아니라 표준 병리학적 분석을 사용하는 다른 많은 분야의 연구자들에게 길을 열어주었습니다.

샘플의 가용성이 제한된 경우에 특히 유용할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 표준 기법을 사용하여 제한된 표본 크기 내에서 편향되지 않은 대표 데이터를 수집하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 특정 영역만 선택하는 것은 췌장 구멍 분포 연구를 통해 보여준 것처럼 전체 그림을 대표하지 않을 수 있습니다.