마우스 블레더 월 주입

이 절차의 전반적인 목표는 방광벽의 특정 영역에 세포를 도입하는 것입니다. 이는 먼저 복부 절개를 통해 방광을 노출시킴으로써 수행됩니다. 절차의 다음 단계는 바늘의 사면을 방광벽 내로 삽입하는 것입니다.

절차의 마지막 단계는 시린지의 플런저를 밀어 관심 세포를 방광벽에 주입하는 것입니다. 세포가 성공적으로 이식되면 액체가 새지 않고 크기가 일정하게 유지되는 국소적인 수포(bleb)가 형성됩니다. 세포를 요도를 통해 접종하는 기존의 마우스 접종법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 방광 내에서 세포가 이식될 위치를 직접 지정할 수 있다는 점입니다.

근육 내 주사 부위의 시각적 시연은 주사 위치를 익히기가 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 방광으로 들어가는 바늘의 정확한 각도와 진입 위치를 아는 것이 기술적 성공의 필수 요소입니다. 실험의 필요에 따라 마우스의 연령, 성별 및 계통을 선택하십시오.

8~12주령의 마우스를 사용하며, 먼저 비누와 물로 수술대의 표면을 깨끗이 닦습니다. 다음으로, 사이드스와이프(sideswipes) 또는 살균 티슈로 수술대 표면을 닦아냅니다. 수술 도구는 수술 전 오토클레이브(autoclave)로 멸균해야 합니다.

사용 직전에 기구들을 70% ethanol로 닦고, 개별 수술 사이에 열구슬 멸균기로 다시 멸균합니다. 30 gauge 바늘이 장착된 100 microliter Hamilton 시린지를 절대 알코올로 반복적으로 흡입하여 세척한 후, 멸균된 phosphate buffered saline으로 세척합니다. 마취된 동물을 가온 패드 위에 등으로 누운 자세로 배치하여 정상 체온을 유지하도록 합니다.

기화된 isof fluorine이 포함된 노즐에 동물의 코를 위치시켜 충분한 수준의 마취 상태를 유지합니다. 다음으로, 클리퍼를 사용하여 복부 피부의 털을 제거합니다. 수술 중 분변 오염을 방지하기 위해 일회용 멸균 수술 포로 항문 부위를 덮습니다.

두 번째 수술용 드레이프를 하복부에 덮고 수술창을 노출시킵니다. 해부 현미경으로 확대하여 Betadine과 알코올을 반복적으로 도포해 수술 부위를 멸균합니다. 가위로 하복부 정중선 절개를 실시합니다.

복부에 가벼운 압력을 가해 방광을 노출시킵니다. 방광은 대개 부분적으로 또는 완전히 채워져 있으므로, 복부에 압력을 가하면 다른 장기들이 우선적으로 밀려나 방광이 절개 부위로 드러나게 됩니다. 방광이 가득 차 있는 경우, 돔(dome) 부위에 가벼운 하방 압력을 가해 부분적으로 감압시킵니다.

멸균된 Hamilton 시린지에 샘플 용액 50 µL를 채웁니다. 바늘의 베벨(bevel)이 위를 향하도록 하여 방광 벽에 삽입한 후 샘플 용액을 주입합니다. 성공적인 주입은 액체가 새지 않고 일정한 크기를 유지하며 국소적으로 잘 형성된 돌출부(bleb)로 확인됩니다.

주사 후 상처 클립으로 절개 부위를 폐쇄합니다. 가온 패드 위에서 마스터가 회복되도록 합니다. 이 기술은 적절하게 수행될 경우 10분에서 15분 이내에 완료될 수 있습니다.

성공 여부는 주입 후 일정 간격의 시점에서 방광의 조직학적 분석을 통해 확인할 수 있습니다.