Clonogenic 분석 : 자기편 셀

안녕하세요, 제 이름은 Lum이고 저는 현재 BE IDI 심장 및 당뇨병 연구소에서 Epigenomic Medicine Lab의 책임자인 Tom Carianne 박사의 감독 하에 박사 과정을 밟고 있습니다. 이 비디오에서는 Clon Genic Survival Assay로 알려진 절차를 시연할 것입니다. 이것은 50년 된 기술로, 방사선 또는 화학 작용제에 대한 노출과 같은 다양한 치료법이 세포 생식 생존력에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

선천성 생존 분석은 다양한 세포주의 방사선 감도를 평가하고 다양한 방사선 보호 또는 방사선 감작 화합물의 효능을 테스트하기 위한 방사선 생물학의 핵심 기술입니다. A 부착 세포주를 사용할 때 극저온 생존 분석은 3단계로 구성됩니다. 첫째, 부착 세포의 단층(mono layer)을 처리하는 것입니다.

둘째, 단일 세포 현탁액의 제조 및 알려진 수의 세포 및 페인트 접시의 도금, 셋째, 배양 기간 후에 형성된 염색, 계수 및 콜로니. 이 비디오에서는 불멸의 인간 cino site 세포를 사용하여 다인자 성경 분석을 사용하여 천연 항산화제의 무선 보호 특성을 결정하는 방법을 시연할 것입니다. 1225 M 플라스는 실험 당일에 플라스크 당 100 만 개의 세포가 있도록 사전에 5 mil의 배지에 세포를 파종합니다.

50 마이크로 리터의 약물은 필요한 농도를 달성하기 위해 적절하게 표지 된 각 플라스크의 5 mils 매체에 다른 농도로 첨가되며, 5 가지 농도와 1 개의 차량 제어 장치,이 경우 PBS가 사용됩니다. 약물을 투입한 후, 배양 후 사용하는 세포주에 적합한 조건으로 세포를 1시간 동안 배양합니다. 대조군을 제외한 플럭스는 선택한 용량으로 조사되며, 이 경우 감마선을 방출하는 세슘 소스에 의해 생성되는 4개의 회색입니다.

방사선 조사 후 배지가 쏟아지고 각 플라스크는 5분 동안 2mil의 PBS로 세척됩니다. PBS를 부은 후 각 플라스크에 0.05% 트립신 2mil을 첨가하여 플라스크에서 A 부착 세포를 분리합니다. 그런 다음 10%의 소 태아 혈청을 함유한 DMEM의 하단 5밀리리터를 각 플라스크에 첨가하여 트립신을 비활성화합니다.

그런 다음 fasc의 전체 내용물을 표지된 10ml 팔콘 튜브로 옮깁니다. 완료되면 이 튜브를 5분 동안 원심분리한 후 입천장을 방해하지 않고 supinator를 조심스럽게 버리고 각 튜브에 5mil의 crecy media를 추가합니다. 각 샘플에 대한 세포의 농도는 ENC로 계산되며, 각 샘플의 최종 농도를 달성하기 위해 필요한 부피도 계산되어 각각 5ml의 배지가 있는 샘플당 5개의 페트리 접시에 도말됩니다.

예를 들어, 대조군의 경우 접시당 100개의 세포가 도금되므로 25밀리리터당 500개의 세포를 달성하는 데 필요한 부피를 계산하면 더 농축된 샘플에 대해 10배 희석 또는 100배 연속 희석을 수행하여 100마이크로리터 미만의 부피를 사용할 때 관련된 오류를 최소화합니다. 이제 이전에 계산된 부피는 각 샘플에 대해 25ml의 배지를 포함하는 Falcon 튜브로 준비됩니다. 이제 샘플을 이전에 라벨이 부착된 사전 접시로 옮길 수 있으며, 각 접시에 5ml를 추가하여 취급 및 운반이 더 쉬워졌습니다.

접시는 크거나 멸균되거나 소독된 용기에 보관하십시오. 그런 다음 접시를 적절한 조건의 가습 인큐베이터에 넣고 8일 동안 배양합니다. 8일 후에 각질 세포를 사용하는 경우 인큐베이터에서 접시를 조심스럽게 꺼내 배기 후드 안에 하나씩 모두 놓습니다.

형성된 군체가 방해받지 않도록 장소를 부드럽게 다루도록 주의하십시오. 뚜껑을 제거하고 각 접시에 0.9% 식염수 5ml를 추가하여 씻습니다. 준비 팁을 접시 모서리로 향하게 하고 접시 바닥을 만지지 않도록 하여 집락이 실수로 긁히지 않도록 합니다.

5분 후, 조심스럽게 식염수를 흡입합니다. 이제 콜로니는 3 밀리리터의 4 % 공식으로 고정되며 증발을 피하기 위해 리드를 교체해야합니다. 15분에서 30분 후에 포뮬러를 흡인하고 적절하게 폐기합니다.

이제 군체는 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색할 준비가 되었으며 각 접시에 5밀리리터를 추가하고 30분에서 1시간 후에 뚜껑을 교체합니다. 그런 다음 염료를 증류수로 씻어내고 접시를 뒤집어 밤새 건조시킵니다. 이제 식민지를 셀 준비가 되었습니다.

군집은 해부 현미경을 사용하여 수동으로 계수할 수 있습니다. 50개 이상의 세포를 포함하는 모든 세포 클러스터는 콜로니로 간주됩니다. 이것으로 Congenic 생존 분석에 대한 시연을 마칩니다.

다른 기술에 비해 이 분석의 주요 장점은 매우 민감하고 6로그의 세포 사멸 후에도 넓은 범위에서 생존을 검출할 수 있다는 것입니다. 이러한 민감도는 더 큰 세포 수를 도금함으로써 달성됩니다. 이 에세이는 세포 독성 테스트와 같은 테스트와 같은 다른 목적으로 쉽게 사용할 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다.