Name: Clonogenic 분석 : 자기편 셀 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: 배우세요 부착세포를 이용한 클로노제닉 분석법으로 방사선 및 화학물질 처리 후 세포 생식 능력을 평가하는 방법을 익히세요. 이 기법은 방사선 생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. HR은 대학원 호주와 BakerIDI 밝은 점화 수상에 의해 지원됩니다. 이 작품은 바이오 메디컬 이미징 개발 회사 (CRC - 입찰가) 설립과 호주 정부의 협동 연구 센터 프로그램에 따라 지원을 위해 CRC에 의해 자금입니다. CO는 호주 대학원 보너스 및 CRC - 입찰 보조 장학금받는 사람입니다.

1. 세포 배양 및 실험 설정 <ol><li> 인간 keratinocytes는 keratinocyte - SFM 15 ML (K - SFM)이있는 75cm 두 조직 문화 flasks에 monolayers로 유지 L - 글루타민 (2 ㎜), 표피 성장 인자 (5 NG와 보충 매체 (GIBCO, 혈청이없는 배지) / ML), 소 뇌하수체 추출 (40 μg / ML) 20 MG / ML gentamicin. 세포 ° C.에게 37 humidified 5 % CO 2 환경에서 재배 </li><li> 전지는 K - SFM 매체의 5 ML을 포함 12 X 25cm 두 조직 문화 flasks에 씨앗을 품고 있습니다. </li></ol> 단세포 suspensions는 trypsinization에 의해 준비가되어 있습니다. 세포는 칼륨이 염분 버퍼와 세탁 및 50~10분에 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 incubated 있습니다. 세포가되기 시작하면 반올림과 ~ 30 %가 떨어뜨려 10 % 태아 소 혈청이 포함된 Dulbecco의 수정 독수리 매체 3 볼륨이 트립신을 중화에 추가됩니다. 세포는 (20 번)와 아래로 pipetting에 의해 떨어뜨려졌다. 세포는 hemocytometer를 사용하여 계산됩니다. 적절한 셀 번호는 세포주 (인간 FEP - 1811 keratinocytes에 대한 약 20 시간)의 두 배로 시간에 따라 씨앗을 품고 있습니다. 목적은 실험 당일 ~ 90 % confluency을 (술병 회 ~ 10 6 세포) 달성하는 것입니다. 12 flasks 구성 실험 약 4 시간에 완료할 수 단일 clonogenic 분석 (6 unirradiated 제어 여섯 조사 flasks)에 최적입니다. 2. 치료 및 조사 <ol><li> 관련 방사선 - 수정 화합물과 적절한 시간에 세포를 치료하고 이온화 방사선 γ - 방사선 또는 X - 선 중 하나에 세포를 노출. </li></ol> 일반적으로 여섯 flasks는 도금 효율 (치료)와 약물에만 컨트롤로 제공하고 있습니다. 다른 여섯 flasks가 조사하고 있습니다. 1 시간, 수용성 천연 항산화 제제,이 예제에서 인간 keratinocytes는 Cinnulin PF의 다양한 농도 (20 μg / ML은 아래와 같습니다에 대한 대표적인 데이터를,, 무결성 Nutraceuticals 국제, 스프링 힐, TN, 미국 CPF)로 처리됩니다 37 ° C. 세포는 137 고사 소스를 (; Nordion 국제, ON, 캐나다, 1.6 쥐 / 분 Gammacell 1000 엘리트 irradiator)를 사용하여 4 쥐와 함께 조사하고 있습니다. 3. 도금 <ol><li> 앞에서 설명한로 치료에 따라, 단일 셀 suspensions을 얻을 수 있습니다. </li><li> 각각의 샘플에있는 세포의 숫자는 신중하게 hemocytometer를 사용하여 계산과 같은 것이 적절한 세포 번호가 (5가 15mm 요리 각각의 복제) 배양 접시에 씨앗을 품고 아르 희석 수 있습니다. 판 당 종자로 세포의 수를 결정할 때 도금 효율 및 / 또는 분수에서 살아남는은 예상해야합니다. 150 식민지 - 목표는 20 ~의 범위를 달성하는 것입니다. </li> 배양 접시는 humidified 플라스틱 복제 상자에서 정렬 및 ° C 콜로니 형성 37 5 % CO 2 환경에서 incubated입니다. </ol> 콜로니 형성을위한 인큐베이션 시간이 서로 다른 세포 라인 1-3 주간 다릅니다, 그것은 시간이 적어도 6 셀 부문에 해당되어야 인정합니다. 이 예제에서는, 인간 keratinocytes에 대한 제어 요리 팔일 50 개 이상의 세포로 이루어진 충분히 많은 클론을 형성해야합니다. 4. 식민지를 해결하고 스테 이닝 펌 후드에서 다음 단계를 완료합니다. <ol><li> 부드럽게 흡인하여 접시의 각 미디어를 제거합니다. </li><li> 5 ML 0.9 %의 식염수에 각각의 접시를 씻으십시오. </li><li> 15-30분 5 ML 10% 중립 버퍼 포르말린 용액으로 식민지를 수정. </li><li> 30~60분에 대한 DH 2 O 5 ML 0.01 % (W / V) 크리스탈 바이올렛과 얼룩. </li><li> DH 2 O와 함께 여분의 크리스탈 바이올렛 씻고 요리 건조 수 있습니다. </li></ol> 5. 콜로니 카운팅 Stereomicroscope <ol><li> 50 개 이상의 개별 세포를 포함하는 식민지가 stereomicroscope를 사용하여 계산됩니다. </li></ol> 이미징 소프트웨어를 사용하여 디지털 이미징과 카운트 <ol><li> 식민지의 디지털 이미지는 카메라를 사용하거나 장치를 스캐닝를 얻을 수있다 </li><li> 식민지은 아래 설명 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 계산됩니다. </li></ol> ImageJ (피지 버전 1.44a)를 사용하여 셀 카운트 <ol><li> 피지에있는 이미지 파일을 열고, 파일 이동 -&gt; 엽니다. </li><li> &gt; 조정 ...-&gt; 임계값 - 8 비트 형식으로 이미지를 변환 필요한 경우, 이미지로 이동합니다. </li><li> 오직 식민지가 감지되도록 불특정 배경 수준을 줄이기 위해 임계값을 조정합니다. </li><li> 다음을 사용하여 식민지를 카운트 : 프로세스로 이동 -&gt; 이진 -&gt; 맥시멈를 찾습니다. </li></ol> 이 이미지 포맷에 대한 소음의 허용 오차는 0으로 설정할 수 있습니다. 저기 저 반짝 이는 불빛 배경 옵션을 쳤다되었는지 확인하고 모든 세포 식민지가 올바르게 등록되었는지 확인하기 위해 감지된 맥시멈를 미리 봅니다.

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+x-rays+on+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Action of x-rays on mammalian cells.</a> J Exp Med. 103, 653-666 (1956).</li>
<li>Hurlin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 예제에서는 인간 FEP - 1811 keratinocytes 100 μg / ML CPF에 다양한 농도와 치료를했다, 데이터는 37에서 1 시간 20 μg / ML CPF ° C.에 대해 표시됩니다 다음 치료 세포는 137 고사 소스를 (; Nordion 국제, ON, 캐나다, 1.6 쥐 / 분 Gammacell 1000 엘리트 irradiator)를 사용하여 4 쥐와 함께 조사했다. 컨트롤에 대한 치료 및 약물 치료에만 100 세포는 각 배양 접시에있는 도금되었으며 요리 1000 세포가 조사 샘플 도금했다. 위의 표에 표시, 식민지는 stereomicroscope 또는 디지털 이미지 (그림 1)를 사용하여 계산되었습니다 ImageJ를 사용하여 계산을 위해 이동했다. 다섯 가지 요리에 대한 평균 콜로니 개수는 도금 효율과 살아남은 소수를 계산하는 데 사용되었다. 데이터는 천연 항산화 제제와 방사선 보호 효과 (보호 요소 ~ 3)을 지적했다. 대표 결과 </...

<table><tbody><tr><td>케라티노사이트 무혈청 배지(Keratinocyte-serum free medium)</td><td>성장 배지</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>2mM L-glutamine, 20&amp;#x03BC;g/ml gentamicin, 표피 성장 인자, 소 뇌하수체 추출물을 첨가함.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>부착 세포 분리를 위한 0.05% trypsin / EDTA; Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;가 없는 PBS로 희석한 10배 농축액.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified essential medium</td><td>성장 배지</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td>10% FBS 및 20&amp;#x03BC;g/ml gentamicin을 첨가함; trypsin/EDTA 중화용으로 사용.</td></tr><tr><td>0.09% 식염수</td><td>용액</td><td></td><td></td><td>콜로니 세척에 사용.</td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린 용액</td><td>용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>~4% formaldehyde; 콜로니 고정용으로 사용.</td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛(Crystal violet)</td><td>분말</td><td>SPI Supplies</td><td>02577-MB</td><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O로 제조한 0.01% 크리스탈 바이올렛 용액, 콜로니 염색에 사용.</td></tr><tr><td>Gammacell 1000 elite 조사기</td><td></td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>60 x 15 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td></td><td>Hawksley; Medical and Laboratory Equipment</td><td>AC1000</td><td></td></tr><tr><td>클로닝 박스</td><td></td><td></td><td></td><td>뚜껑 양쪽에 구멍이 뚫린 플라스틱 박스; 콜로니 형성을 위한 장기 배양 중 페트리 접시 보관용.</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Type 102</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>&amp;gt;50개의 세포로 구성된 콜로니 수를 세는 데 사용.</td></tr></tbody></table>

clonogenic 분석 : 자기편 셀

Clonogenic Assay: Adherent Cells

clonogenic (또는 콜로니 형성) 분석은 이상의 50 년 동안 설립되었습니다, 기술을 설명하는 원래의 논문은 1956 1이 공개되었습니다. 분리 방법을 문서화에서 최초 획기적인 연구 문화 1 X - 선 조사 포유 동물 (헬라) 세포에 대한 최초의 방사선 선량 - 반응 곡선을 생성. 제어 치료 세포와 같은 노출 등 다양한 트리 트먼트를받은 세포 사이에, 기본적으로 clonogenic 분석은 생식 생존의 차이 (50 이상 세포의 식민지를 형성하는 하나의 세포 즉 자손을 만들어 세포의 능력)의 평가를 수 방사선을 이온화하는 다양한 화합물 (예 : 세포 독성 대리인) 또는 그 밖의 경우에는 유전자 조작. 분석은 방사선 생물학에서 가장 널리 인정 기술되어 널리 다른 세포 라인의 방사선 감도를 평가에 사용되고 있습니다. 또한, clonogenic 분석은 일반적으로 방사선 수정 화합물의 효능을 모니터링하고 다른 세포 라인의 콜로니 형성 능력에 세포 독성 에이전트 및 다른 안티 암 치료제의 효과를 결정하는 데 사용됩니다. 자기편 세포 라인을 사용하는 전형적인 clonogenic 서바이벌 실험 식민지를 해결하고 얼룩 세 개의 서로 다른 구성 요소 1) 조직 문화 flasks의 세포 monolayer 치료, 2) 단일 세포 suspensions의 준비 및 배양 접시와 3 세포의 적절한 숫자를 도금)을 포함 관련 잠복기 다음, 이것은 세포 라인에 따라, 1-3 주에서 범위 수 있습니다. 여기서 우리는 영원히 인간 keratinocyte 세포 라인의 사용 (FEP - 1811) 2 자기편 세포 라인 clonogenic 분석을 수행하기위한 일반적인 절차를 보여줍니다. 또한, 우리의 목적은 방사선 세포의 노출 후 도금 효율성과 생존 분수의 계산을 포함 clonogenic의 assays의 일반적인 기능을 설명하고, 천연 항산화 제제의 사용과 방사선 반응의 수정을 예시하는 것입니다.

생식 가능성을 평가하기위한 clonogenic 분석의 응용은 이상의 50 년 동안 설립되었습니다. 여기 자기편 세포와 clonogenic 분석을 수행하기위한 일반적인 절차를 보여줍니다.

Clonogenic 분석 : 자기편 셀

클론 생성(또는 콜로니 형성) 분석법은 50년 이상 전에 확립되었으며, 이 기술을 설명한 최초의 논문은 1956년에 발표되었습니다1. ...

안녕하세요, 제 이름은 Lum이며 현재 Epigenomic Medicine Lab의 책임자인 Dr.Tom Carianne의 지도 아래 BE IDI Heart and Diabetes Institute에서 박사 과정을 밟고 있습니다. 이번 영상에서는 Clon Genic Survival Assay라고 알려진 절차를 시연하겠습니다. 이 기술은 50년 전에 개발된 기법으로, 방사선 노출이나 화학 물질 처리와 같은 다양한 처치가 세포의 생식 능력(reproductive viability)에 미치는 영향을 평가할 수 있게 해줍니다.동종성 생존 분석(Congenic survival assay)은 다양한 세포주의 방사선 민감도를 평가하고, 다양한 방사선 보호제 또는 방사선 감작제의 효능을 테스트하는 방사선 생물학의 핵심 기술입니다. 부착성 세포주를 사용할 때, 저온 생존 분석은 세 단계로 구성됩니다. 첫 번째는 부착성 세포 단층의 처리 단계입니다.둘째로, 단일 세포 현탁액의 준비와 정해진 수의 세포를 도말한 플레이트 준비 과정이며, 셋째로, 일정 기간의 배양 후 염색, 계수 및 형성된 콜로니를 확인하는 과정입니다. 본 영상에서는 불멸화된 인간 시노사이트(cino site) 세포를 사용하여 천연 항산화제의 방사선 보호 특성을 결정하는 데 다핵성 돌기 분석법(polygenic Bible assay)을 어떻게 활용할 수 있는지 시연하겠습니다. 실험 당일에 플라스크당 100만 개의 세포가 확보될 수 있도록, 사전에 5 mL의 배지가 담긴 T25 플라스크에 세포를 분주해 두었습니다.적절하게 라벨이 부착된 각 플라스크의 배지 5 mL에 필요한 농도가 되도록 서로 다른 농도의 약물을 50 µL씩 첨가하며, 이 경우에는 다섯 가지 농도와 하나의 용매 대조군인 PBS를 사용합니다. 약물을 첨가한 후, 사용된 세포주에 적합한 조건에서 세포를 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 대조군을 제외한 플라스크에 세슘 감마선원으로 생성된 4 Gy의 선정된 선량으로 조사를 수행합니다.조사 후, 배지를 따라내고 각 플라스크를 2 mL의 PBS로 5분 동안 세척합니다. PBS를 따라낸 후, 플라스크에 부착된 세포를 분리하기 위해 0.05% trypsin 2 mL를 각 플라스크에 첨가합니다. 그 다음, trypsin을 비활성화하기 위해 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM 5 mL를 각 플라스크에 첨가합니다.그 후 fasc의 전체 내용물을 라벨이 부착된 10 milliliter falcon tube로 옮깁니다. 옮기기가 완료되면, 이 튜브들을 5분 동안 원심분리하고, 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거한 다음, 각 튜브에 5 mils의 crecy media를 첨가합니다. 각 샘플의 세포 농도를 계산하고, 샘플당 5 milliliter의 배지가 담긴 5개의 Petri dish에 도말하기 위한 최종 세포 농도를 맞추기 위해 필요한 각 샘플의 부피를 산출합니다.예를 들어, 대조군의 경우 디쉬당 100개의 세포를 플레이팅하므로, 25 milliliters당 500개의 세포를 달성하는 데 필요한 부피를 계산합니다. 더 농축된 샘플의 경우, 100 microliters 미만의 부피를 사용할 때 발생하는 오차를 최소화하기 위해 10배 희석 또는 100배 연속 희석을 수행합니다. 이제 이전에 계산된 부피를 각 샘플에 대해 25 milliliters의 배지가 들어 있는 Falcon 튜브에 준비합니다. 이제 샘플을 이전에 라벨링한 디쉬로 옮길 수 있으며, 취급과 운반을 용이하게 하기 위해 각 디쉬에 5 milliliters씩 추가합니다.디쉬를 크고 멸균되었거나 소독된 용기에 보관하십시오. 그런 다음 디쉬를 적절한 조건의 가습 인큐베이터에 넣고 8일 동안 배양합니다. 8일 후에 각질 형성 세포(keratinocytes)를 사용하는 경우, 인큐베이터에서 디쉬를 조심스럽게 꺼내 흄 후드 내부에 하나씩 펼쳐 놓으십시오.형성된 콜로니가 손상되지 않도록 플레이트를 조심스럽게 다루십시오. 뚜껑을 열고 각 디시에 0.9% saline 5 mL를 첨가하여 세척합니다. 피펫 팁을 디시의 모서리 방향으로 조준하고 디시 바닥에 닿지 않게 하여 콜로니가 실수로 긁혀 나가지 않도록 주의하십시오.5분 후, 식염수를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 이제 4% 포뮬러 3 mL로 콜로니를 고정하며, 증발을 방지하기 위해 덮개를 다시 닫아야 합니다. 15분에서 30분 후, 포뮬러를 흡입하여 제거하고 적절하게 폐기합니다.이제 콜로니를 0.1% Crystal violet으로 염색할 준비가 되었습니다. 각 디쉬에 5 mL를 첨가하고 30분에서 1시간 후에 뚜껑을 닫습니다. 그 다음 증류수로 염료를 씻어내고, 디쉬를 뒤집어 하룻밤 동안 건조시킵니다. 이제 콜로니를 계수할 준비가 되었습니다.해부 현미경을 사용하여 콜로니 수를 수동으로 측정할 수 있습니다. 50개 이상의 세포를 포함하는 모든 세포 집단은 하나의 콜로니로 간주합니다. 이것으로 동계 생존 분석법(Congenic survival assay) 시연을 마치겠습니다.다른 기술과 비교했을 때 이 분석법의 주요 장점은 감도가 매우 뛰어나 세포가 6 log만큼 사멸한 후에도 넓은 범위에서 생존 여부를 검출할 수 있다는 점입니다. 이러한 감도는 더 많은 수의 세포를 도말함으로써 달성됩니다. 이 분석법은 세포 독성 테스트와 같은 다른 목적으로도 쉽게 활용될 수 있습니다.시청해주셔서 감사합니다.

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