체외 골수에서 에스트로겐에 민감한 유방암의 휴면 모델 : 분자 메커니즘 연구 및 가설 생성을위한 도구

다음 실험의 전반적인 목표는 이 체외 휴면 모델을 적용하여 분자 및 세포 메커니즘을 연구하고 생물학적으로 더 복잡한 생체 내 모델에서 테스트하기 위한 가설을 생성하는 것입니다. 이는 에스트로겐 양성 유방암 세포를 피브린 목으로 인코딩된 조직 배양 플레이트에서 선천성 밀도로 배양함으로써 달성되며, 이들의 상호 작용은 주로 서로가 아닌 하층과 이루어집니다. 두 번째 단계로, 휴면 상태는 골수에서 유방암 세포를 대표하는 FGF 2와 피브로넥틴에 의해 지지되고 유지되는 일부 에스트로겐 양성 세포에서 활성화됩니다.

다음으로, 휴면 세포의 다양한 표현형 및 분자 측면을 파괴하고 휴면 상태의 유지에 있어 이들의 역할을 결정하기 위해 항체, 억제제, 펩타이드 또는 핵산의 첨가에 의해 시스템이 교란됩니다. 결과는 피브로넥틴 코팅 플레이트에서 FGF 2로 배양된 세포를 처리한 결과인 성장 및 휴면 콜로니의 수와 모양을 보여줍니다. 이 방법은 어떤 신호 경로, 접착 분자 또는 기타 특정 분자 메커니즘이 골수 미세환경에 위치한 에스트로겐 의존성 유방암 세포의 휴면 발달 및 유지를 담당하는지 답변하는 데 도움이 될 수 있습니다.

먼저 CF 7개의 세포주와 약 50% 접촉하는 플레이트에서 배양 배지를 흡인하고 예열 PBS로 RIN합니다. 그런 다음 태아 송아지 혈청이 없는 고포도당 배지인 DMEM에 용해된 포인트 25 트립신 EDTA 용액 1ml를 추가합니다. 세포가 분리되기 시작하는 동안 섭씨 37도에서 1-4분 동안 플레이트를 배양합니다.

세포가 플레이트에서 분리되어 단일 세포 현탁액을 형성하기 시작하면 2ml 피펫으로 위아래로 여러 번 피펫팅하여 남아 있는 세포 덩어리를 분해합니다. 트립신 4분 후에도 세포 덩어리가 남아 있으면 세포를 버리고 4분 후에 서로 붙어 있는 새로운 배양 세포를 준비하면 콜로니 수를 계산할 때 오류가 발생할 수 있습니다. 트립스가 주입된 세포를 구개하고 밀리리터당 1, 500개의 세포로 재현탁합니다. 배양 배지에서 5ml 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 세포 계수를 수행하고 자동화된 세포 계수기를 사용하여 현탁액이 주로 단일 세포로 구성되어 있는지 확인합니다.

이것은 또한 위상차 현미경 아래의 계수 챔버를 사용하여 수동으로 수행할 수도 있습니다. 그런 다음 3ml의 세포 현탁액을 추출하고 한 번에 24개의 웰 피브로넥틴 코팅 플레이트에서 2개의 웰로 1ml를 분산시킵니다. 세포의 공간 분포를 최적화하려면 현탁액을 웰 중앙으로 피펫팅하고 세포가 침전되어 부착되기 전에 플레이트를 더 이상 움직이지 마십시오.

나머지 세포 현탁액을 마스터 세포 혼합물에 되돌려 놓고 다시 3 밀리리터를 더 추출하기 전에 세포를 혼합합니다. 이 절차는 세포가 튜브에 지속적으로 침전되고 피펫이 빠르게 작동하여 많은 양의 세포를 분배하기 때문에 세포가 실온에서 현탁액 상태로 있고 CO2 농도가 섭씨 37도에서 세포를 배양하는 선천적 잠재력을 조절하기 때문에 세포 수 변동성을 줄일 수 있습니다. 이것은 하루를 뺀 값으로 간주됩니다.

실험의 타임라인에서. 분석 0일차에 배지를 섬유아세포 성장 밀리리터당 10나노그램을 포함하는 1밀리리터의 신선, 중간 또는 신선 배지로 교체합니다. 두 번째 요인으로, 6일 후 웰 내 세포 수가 적어도 영양소 또는 사이토카인 조성이나 원래 배지의 pH에 큰 영향을 미치지 않습니다.

3일째에, PI 3 키나아제 억제제, LY 2 9 4 0 0 2 음성 대조군 LY 3 0 3 5 1 1 또는 배지 대조군과 같은 교란제의 최종 의도 농도의 10배를 포함하는 용액 100마이크로리터를 이미 웰에 있는 1밀리리터의 배지에 추가합니다. 그리고 용액이 확산에 의해 혼합되도록하십시오. 플레이트를 인큐베이터에 다시 3일 동안 다시 넣고 6일째 디졸브합니다. 0.1%crystal 바이올을 2%의 에탄올과 10밀리몰 붕산나트륨 용액에 넣습니다.

pH 9에서 웰의 매체를 흡입하고 20분 동안 각 웰에 1ml의 크리스탈 바이올렛 용액을 추가합니다. 싱크대에 얼음 양동이를 놓고 우물 구멍이 양동이에 예각으로 아래를 향하도록 하여 물에 담그어 양동이 세척판에 물을 계속 흐르게 하여 아린 스테이션을 설정합니다. 일단 물속에 들어가면 플레이트를 수평 각도로 기울여 우물 개구부가 아래를 향하도록 합니다.

그런 다음 플레이트를 예각으로 다시 기울이고 한 번의 부드러운 동작으로 제거합니다. 우물 바닥의 물이 더 이상 파란색으로 나타나지 않을 때까지 담그기를 두세 번 반복합니다. 그런 다음 접시를 벤치 상단의 수건 위에 거꾸로 놓고 밤새 말리십시오.

건조되면 플레이트를 반전 위상차 현미경 아래에 놓고 각 웰에서 성장하는 군체와 휴면 군체의 수를 계산합니다. 40배 배율에서는 30개 이상의 세포 군체를 성장 중으로, 12개 미만의 세포 군체를 휴면 상태로 간주합니다. 표시. 다음은 성장하는 식민지와 휴면 식민지의 전형적인 모습입니다.

성장하는 콜로니에는 30개 이상의 세포가 포함되어 있고 휴면 콜로에는 12개 이하의 세포가 포함되어 있으며, 이는 배양에 FGF 2를 추가하지 않고 큰 세포질 대 핵 비율을 가진 세포보다 몇 배나 큽니다. 군체는 주로 성장하는 클론으로 대표됩니다. FGF 2가 있는 경우 대다수의 클론은 휴면 상태이지만, 추가 제제의 효과도 시스템을 사용하여 평가할 수 있습니다.여기서, 이전에 결정된 농도의 두 교란 제제를 Congenic 분석의 3일차에 웰에 첨가했습니다.

그림은 PI 3 키나아제 억제제 LY 2 9 4 0 2에 의한 휴면 클론의 우선적 억제를 나타내지만, 음성 대조군 LY 3 0 3 511에 의한 효과의 부족을 나타낸다. 이러한 실험은 휴면 상태와 치료에 대한 저항을 지배하는 요소를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서, PI i 3 키나아제 억제제로 처리된 살아남은 휴면 세포는 퍼짐 모양을 잃고 작은 수지상 돌기가 되며 괴로워하는 것처럼 보였습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 휴면 세포에서 성장하기 위한 이 선천성 분석을 설정하는 방법, 휴면 상태를 설정한 후 특정 억제제 또는 교란제를 추가하여 세포를 교란하는 방법, 교란제의 효과를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이 분석은 휴면 콜로니를 계산하거나 초구조적 면역형 또는 분자 이벤트를 측정하여 정량적 및 정성적 결과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다 휴면 및 교란 세포에서. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.