다음 실험의 전반적인 목표는 본 인비트로(in vitro) 휴면 모델을 적용하여 분자 및 세포 메커니즘을 연구하고, 생물학적으로 더 복잡한 인비보(in vivo) 모델에서 검증하기 위한 가설을 생성하는 것입니다. 이는 에스트로겐 양성 유방암 세포를 피브린 넥(fibrin neck)이 코팅된 조직 배양 플레이트에서 세포 간의 상호작용보다 기질과의 상호작용이 주로 일어나는 동종 밀도로 배양함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 골수 내 유방암 세포를 모사하여 FGF two 및 피브로넥틴에 의해 지지 및 유지되는 일부 에스트로겐 양성 세포에서 휴면 상태를 활성화합니다.

다음으로, 휴면 세포의 다양한 표현형 및 분자적 측면을 교란하고 휴면 상태 유지에서의 역할을 결정하기 위해 항체, 억제제, 펩타이드 또는 핵산을 첨가하여 시스템을 섭동시킵니다. 결과는 피브로넥틴이 코팅된 플레이트에서 FGF2로 배양된 세포를 처리했을 때 나타나는 성장 콜로니와 휴면 콜로니의 수 및 외형을 보여줍니다. 이 방법은 골수 미세환경에 위치한 에스트로겐 의존성 유방암 세포의 휴면 형성 및 유지에 어떤 신호 전달 경로, 접착 분자 또는 기타 특정 분자 기전이 관여하는지 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

먼저 CF 7개 세포주가 약 50% 밀도로 증식한 플레이트에서 배양액을 흡입하여 제거하고, 미리 데워둔 PBS로 세척합니다. 그런 다음, 태아 송아지 혈청이 포함되지 않은 DMEM 고농도 포도당 배지에 용해된 0.25% trypsin EDTA 용액 1 mL를 첨가합니다. 세포가 떨어지기 시작할 때까지 플레이트를 37 °C에서 1~4분 동안 배양합니다.

세포가 플레이트에서 떨어져 단일 세포 현탁액을 형성하기 시작하면, 2 mL 피펫으로 여러 번 파이펫팅하여 남아 있는 세포 덩어리를 분쇄합니다. 트립신 처리 후 4분이 지나도 세포 덩어리가 남아 있다면, 해당 세포를 폐기하고 새로운 배양 세포를 준비하십시오. 4분 후에도 서로 부착되어 있는 세포가 남아 있으면 콜로니 수를 측정할 때 오차가 발생할 가능성이 높습니다. 트립신 처리된 세포를 플레이팅하고, 배양액에서 mL당 1,500 cells 농도로 재현탁합니다. 5 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 부드럽게 파이펫팅하여 혼합한 뒤, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고 현탁액이 주로 단일 세포로 구성되어 있는지 확인합니다.

위 과정은 위상차 현미경 하에서 카운팅 챔버를 사용하여 수동으로 수행할 수도 있습니다. 그런 다음 세포 현탁액 3 mL를 취하여 피브로넥틴이 코팅된 24웰 플레이트의 웰 두 개에 한 번에 1 mL씩 분주합니다. 세포의 공간적 분포를 최적화하려면 현탁액을 웰의 중앙에 피펫팅하고, 세포가 가라앉아 부착될 때까지 플레이트를 더 이상 움직이지 않도록 주의하십시오.

남은 세포 현탁액을 마스터 세포 혼합액에 다시 넣고, 3 mL를 추가로 취하기 전에 세포를 다시 혼합합니다. 세포가 튜브 내에서 지속적으로 침전되므로 이 절차를 통해 세포 수의 변동성을 줄일 수 있으며, 많은 양의 세포를 빠르게 분배하기 위해 피펫 작업을 신속히 수행해야 합니다. 세포를 상온 및 CO2 농도에서 현탁 상태로 방치하면 공통 유전적 잠재력(congenic potential)이 조절될 수 있으므로, 세포를 37 °C, 5% CO2에서 배양하십시오. 이를 -1일 차로 간주합니다.

실험 일정에 따라, 분석 0일 차에 배지를 1 mL의 신선한 배지 또는 10 ng/mL의 fibroblast growth factor 2가 포함된 신선한 배지로 교체합니다. 6일 후 웰 내의 적은 세포 수는 기존 배지의 영양분이나 사이토카인 조성 및 pH에 유의미한 영향을 미치지 않습니다.

3일 차에, PI3K 억제제인 LY294002, 음성 대조군인 LY303511 또는 배지 대조군과 같은 교란제의 최종 의도 농도의 10배가 포함된 용액 100 µL를 웰에 이미 들어 있는 1 mL의 배지에 추가하고, 확산에 의해 용액이 섞이도록 둡니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 3일 동안 더 배양합니다. 6일 차에 0.1% crystal violet을 2% 에탄올과 10 mM sodium borate 용액에 녹입니다.

pH 9에서 웰의 배지를 흡입하여 제거한 다음, 각 웰에 crystal violet 용액 1 mL를 넣고 20분 동안 반응시킵니다. 싱크대에 얼음 버킷을 놓고 물을 계속해서 흘려보내 세척 스테이션을 설정합니다. 웰 입구가 버킷 바닥을 향해 예각이 되도록 물속에 담가 플레이트를 세척합니다. 플레이트가 물에 완전히 잠기면 수평으로 기울여 웰 입구가 아래를 향하게 합니다.

그런 다음 플레이트를 다시 예각으로 기울여 부드럽고 매끄러운 동작으로 한 번에 꺼냅니다. 웰 바닥의 물이 더 이상 파랗게 보이지 않을 때까지 침지 과정을 2~3회 반복합니다. 그 후 플레이트를 뒤집어 벤치 탑의 타월 위에 올려두고 하룻밤 동안 건조시킵니다.

건조가 완료되면 플레이트를 도립 위상차 현미경 아래에 놓고 각 웰에서 성장 중인 콜로니와 휴면 상태인 콜로니의 수를 측정합니다. 40배 배율에서 세포 수가 30개보다 많은 콜로니는 성장 중인 것으로, 세포 수가 12개 이하인 콜로니는 휴면 상태인 것으로 측정합니다. 표시됨. 여기 성장 중인 콜로니와 휴면 상태인 콜로니의 전형적인 모습이 있습니다.

성장 중인 콜로니는 30개 이상의 세포를 포함하고, 휴면 콜로니는 12개 이하의 세포를 포함하며, 휴면 세포는 배양액에 FGF two를 추가하지 않았을 때 세포질 대 핵 비율이 커서 성장 중인 세포보다 훨씬 더 큽니다. 콜로니는 주로 성장 중인 클론으로 구성됩니다. FGF two가 존재하는 경우에는 대부분의 클론이 휴면 상태이지만, 이 시스템을 사용하여 추가 약제의 효과 또한 평가할 수 있습니다. 본 실험에서는 이전에 결정된 농도의 두 가지 섭동 약제를 Congenic 분석 3일 차에 웰에 첨가하였습니다.

이 그림은 PI three kinase 억제제인 LY 2 9 4 0 2에 의한 휴면 클론의 선택적 억제와 음성 대조군인 LY 3 0 3 511의 효과 없음이 나타낸 결과입니다. 이러한 실험은 휴면 및 치료 저항성을 조절하는 요소들을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서 PI i three kinase 억제제로 처리된 생존 휴면 세포들은 퍼진 형태를 잃고 작고 수지상인 모양으로 변하며 스트레스를 받은 것처럼 보였습니다.

이 영상을 시청하신 후, 휴면 세포 배양을 위한 이 동계성 분석법(congenic assay)을 구축하는 방법, 휴면 상태 구축 후 특정 억제제나 섭동제를 첨가하여 세포에 섭동을 주는 방법, 그리고 섭동제의 효과를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다. 이 분석법은 휴면 콜로니 수를 세거나, 휴면 및 섭동된 세포에서 나타나는 다양한 초미세 구조적 면역 표현형 또는 분자적 사건을 측정함으로써 정량적 및 정성적 결과를 모두 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.