Name: 체외 골수에서 에스트로겐에 민감한 유방암의 휴면 모델 : 분자 메커니즘 연구 및 가설 생성을위한 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 학습하세요 체외 유방암 휴면 모델을 통해 에스트로겐 양성 세포의 분자 메커니즘을 연구하는 방법을. FGF2와 피브로넥틴을 이용해 휴면 상태를 유도하고 다양한 억제제로 신호 전달 경로를 분석합니다.

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1. 클론 원성 분석 <ol><li> 단계를 이용하여 MCF-7 및 T47D 세포는 아래 설명 에스트로겐 의존성 유방암 세포주의 단일 세포 현탁액을 준비 <ol><li> MCF-7, T-47D 세포를 더 이상 50 % 합류하지 10cm 조직 배양 접시에서 배양 배지 (DMEM / 10 % 열 비활성화 우태 혈청 / 글루타민 및 펜 / 패 혈성)를 대기음. PBS로 씻어. 1-4 분 동안 37 ° C에서 0.25 % / 2.21 mM의 EDTA는 DMEM 높은 포도당에 용해 된 트립신 품어. </li><li> 단일 세포 분포를 보장하기 위해 위상차 현미경 하에서 1 분 간격으로 세포를 확인한다. 거의 불변, 단일 세포 상태를 달성하기 위해 세포 - 세포 접촉을 방해하는 여러 번까지 피펫 팅에 의해 아래로 2 mL를 피펫으로 세포를 재현 탁. </li><li> 당신이 배양의 2 분 후 세포의 덩어리를 관찰하는 경우 최대 4 분 동안 37 ° C에서 트립신에서 세포를 배양 계속합니다. 그들은 전자에 부착 남아 있으면 클론 원성 연구에 대한 이러한 세포를 사용하지 마십시오트립신의 4 분 후에 다른 ACH는 오류가 콜로니 번호 수율로 도입 될 것이기 때문에. 주 : 세포가 응집되어있는 경우, 콜로니의 수가 배양 세포 수보다 적은 수의 제품을 반영 할 것이다. 세포를 트립신 처리 지나치게되면 그 전위는 클론 원성이 감소 될 수있다. </li><li> 필요한 전체 볼륨을 포함하는 하나의 마스터 튜브의 연속 희석하여 (셀 타입 또는 통로의 수에 따라, + 500 세포 / ml) 24 웰 플레이트, 이하 대한 / ㎖ 배지 1500 세포의 단일 세포 현탁액을 제조 실험에서의 모든 변수. 참고 : 목표는 800 세포 / ㎠ (약 500 1,100 세포 / ㎠의 범위)의 최종 세포 밀도이다. 목표는 상대적으로 쉽게 계산을 허용하는, 약 100 + 50 식민지를 얻을 것입니다 군집을 방지하고 식민지가 증가 또는 실험 perturba 감소 할 때 통계적으로 유의 한 차이가 발생하기에 충분한 식민지를 허용TIONS. </li></ol></li><li> 단계를 사용하여 클론 원성 밀도에 품어 세포는 아래에 설명 <ol><li> 1,500 세포 / ml의 마스터 단일 세포 현탁액 관에서 / 잘 1,500 세포의 클론 원성 밀도에서 24 잘 피브로넥틴 코팅 접시에 사통 우물에서 세포를 품어. 3 ㎖를 그리기 2 각 웰에 1 ml의 배지를 조제하여 5 ml의 피펫 세포를 함유하는 배지를 씹다. 참고 : 피브로넥틴 코팅 된 플레이트는 사전 코팅 구입해야 상용 공급 업체. 제어 품질의 외부 도장 판은, 요철면의 자동화 된 처리 결과는이 분석을 위해 적합하지. </li><li> , 5 ㎖의 피펫와 피펫 팅에 의해 아래로 현탁액을 혼합 세포 현탁액 3 ㎖를 작성하고 1 ml를 각각 2 우물을 입력합니다. 한 피펫에서 한 번에 단지 2 우물을 입력합니다. 아래로 피펫 팅에 의해 다시, 마스터 튜브에 세포 현탁액에 피펫에 재현 탁 세포를 나머지 볼륨을 반환하고 다른 2 WEL을 채우기 위해 다른 3 ㎖를 작성1 ml를 각각 LS. 주 : 세포가 연속적으로 침강하므로 마스터 튜브의 연속 혼합이 필요하다. 단지 2 웰을 채우는 데 충분한 용적을 그리기 세포뿐만 피펫 퇴적물 때문에 각 웰에 유사한 세포 수를 추가 할 필요가있다. </li><li> 허용 세포들은 클론 원성 잠재력 (관찰되지 않은)을 변조한다 실온 CO 2 농도로 현탁액에 앉아 있기 때문에 세포의 대량 분배 빠르게 작동. </li><li> 식민지 분석을위한 우물로 피펫 팅의 행위 중에 세포의 공간 분포를 최적화 할 수 있습니다. 천천히 웰의 중앙으로 최종 세포 농도를 함유하는 현탁액을 피펫 팅에 의해 그렇게. 세포가 바닥에 정착하기 전에 운동을 촉진 할 수있는 판을 가하지 마십시오. 원형 혼합 효과적으로 육일에서 잘 만드는 높은 세포 밀도와 셀 수없는 합류 식민지의 주변에 세포를 원심 분리 때문에 판을 소용돌이하지 마십시오. 참고 :이 전혀 현탁액 세포와 볼륨을 도입 한 후 믹싱보다 바람직하기 때문에 필요한 경우가 아니면 함께 사용하지 마십시오. 이 세포를 혼합 할 필요가있는 경우,이 평탄한 표면에 달려있는 동안 수직 방향으로 앞뒤로 이동하여 판 그렇게. </li><li> 육일에 대한 미디어의 변화없이 37 ℃, 5 % CO 2에서 세포를 품어. 도 6 일 후 세포의 수는 현저히 작은 영양소 또는 사이토킨 조성물도 원래 배지의 pH에​​ 영향을주지한다. </li><li> 다음과 같이 분석의 시간 코스 디자인 : 1 ml의 새로운 배지 또는 새로운 배지 함유 매체를 기존의 교체 일 1. 피브로넥틴 코팅 하층에 세포를 품어 FGF-2와 아래 하루 6 일 0 얼룩 세포에 10 ng를 / ㎖ 1.4). ) 1.3에서 다음과 같이, 3 일에 모든 실험 섭동을 실시한다. </li></ol></li><li> 분자 신호 전달 또는 접착 분자의 설정 실험 교란 <ol><li> 3 일에 100를 추가56; 웰에 1 ml의 배지에 섭동 화제의 최종 농도의 10 배의 의도를 함유하는 용액의 리​​터. 혼합하지 마십시오. 추가로 3 일간 37 ℃, 5 % CO 2에서 세포를 배양하기 위해 계속합니다. 참고 : 에이전트를 교란하는 휴면 상태를 지원하는 역할을 할 수있는 억제제의 종류 및 부착 분자, 수용체 또는 다른 표면 단백질, 세포 내 신호 경로, 분자, 요소, 보조 인자 또는 구조 단백질의 억제제의 차단제를 포함 할 수있다. </li><li> 6 일에 얼룩 식민지로는 다음과 같다. </li></ol></li><li> 얼룩 식민지 <ol><li> 2 % 에탄올 / 10 MM의 붕산 나트륨의 갓 0.1 % 크리스탈 바이올렛 (PH 9.0) 용액과 문화 6 일 후 얼룩 세포. 기음 미디어와 20 분 동안 각 웰에 하나 ㎖의 크리스탈 바이올렛 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 얼음 양동이에 예각으로 아래로 향하게 아니라 구멍이 지속적으로 실행 탭 넘쳐로 몰입하여 판을 씻으십시오싱크대에 물. 한 번 수중 수평 각도 판을 기울 잘 아래로 열고, 한 부드러운 흐르는 움직임에 제거 할 때 다음 예각으로 다시 기울이십시오. </li><li> 웰의 바닥에 물이 더 이상 청색이 될 때까지 침지 2 또는 3 회 반복하지 않는다. 활발한 세척은 계산과 데이터의 오류에 크게 추가로 인해 실험 개입에 덜 부착되어 세포 나 식민지를 제거 할 수 있습니다. </li><li> 거꾸로 대응하는 표지 커버 옆에있는 벤치 위에 수건을 배치하여 밤새 건조 판. </li></ol></li><li> 식민지 카운트 <ol><li> 배양, 염색 및 건조의 각 웰 후 6 일 만에 성장과 휴면 콜로니의 수를 계산합니다. 역 위상차 현미경에 최적으로 40 배 배율로 식민지를 계산합니다. 세포 성장, 큰 expa에 비해 매우 큰 사이즈의 형태 학적 외관, 성장과 12 이하 세포의 식민지로&gt; (30) 세포의 콜로니를 계산큰 세포질과 nded 세포질 그림 1 7,15에 표시된 비율을, 핵. 주 :이 간단 휴면 분석에 매우 자주하지로 13-29 세포의 클러스터가 정상적으로 계산되지 않습니다. 섭동 어느 성장 또는 휴면 세포의 성장 잠재력을 이동 한 경우에는 계산 될 수있다. 이러한 결과는 생물학적 중요성과 상관 될 필요가있다. </li></ol></li></ol> 면역 형광 연구 2. 클론 원성 배양 <ol><li> 숫자 / 24 아니라 실험과 유사한 표면 영역을 셀에 대응, 6 웰 플레이트에 / 웰 약 7,500-8,000 세포에 세포 수를 조정합니다. </li><li> 세포 또한 이전 이미징 연구를위한 6 웰 플레이트의 각 웰 기본으로 라운드, 멸균, 피브로넥틴 코팅 커버 슬립을 놓습니다. 1.2)에서 상기 클론 원성 실험 한 바와 같이 각 웰에 3 ㎖의 부피 피펫 세포 농도에서 한번에 2 웰은 설명했다. </li><li> 세포를 품어위와 1.2.4과 1.2.5 6 일합니다. 1.3의 식민지 분석 절차에 설명 된대로), 300 μL 볼륨에서 10 배 농도에서 3 일에 섭동 요소를 추가합니다. </li><li> 항체 6 일째 얼룩 세포는, 예를 들면 인테그린의 α4, α5, α6, β1, β3, 예를 들면, 국소 유착 복잡한 분자 FAK, paxillin 및 vinculin 같은 부착 분자를 셀에 같은 α-tubulin에 같은 운동성에 관여하는 단백질, 예를 들면, 인산화 된 Akt, 인산화 ERK, 포스 P38, 포스 JNK, 예를 들면, 또는 휴면에서의 역할에 대한 연구의 대상이 직접 또는 간접적으로 표준 기술을 이용하여, 임의의 다른 단백질로서 시그널링 경로 부재 면역 형광 염색법. <ol><li> 아세톤에 집게 하루 6. 수정을 슬라이드 / 제거 메탄올 1 : 1 -20 20 분 공기 건조를 위해 C를 °. 대안 정착액 필요할 경우 파라 포름 알데히드와 같은, 사용될 수있다. 2 분 F 0.1 % 트리톤 X-100, 0.1 % 시트르산 나트륨으로 세포 Permeabilize 하시려면세포 내 항원 또는 검출. PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 간접 immunofluorecence 염색, 5 % BSA와 함께 실온에서 1 시간 동안 또는 이차 항체가 생성 된 종으로부터의 10 % 혈청 preimmune 블록 슬라이드. </li><li> 경로 구성원이나 PBS에 제조업체에서 권장하는 특정 희석에 희석 수면에서의 역할에 대한 조사의 대상은 다른 단백질 신호, 부착 분자, 초점 복잡한 분자를 셀에 차 항체를 4 ℃에서 하룻밤 품어 0.1 % 트리톤 X -100. </li><li> PBS로 3 회 반복한다. 실온에서 2 시간 동안 형광체 공역 항체 커버 슬립을 부화. 예로서, 형석 알렉사 488 당나귀 항 - 마우스 IgG 항체는 뮤린 모노클 일차 항체를 검출하는데 사용될 수있다. 마운트 DAPI와 antifade 에이전트를 이용한 유리 슬라이드에 내려 셀측을 커버 슬립. 매니큐어와 둘레를 밀봉합니다. </li><li> 직접 면역 형광의 경우, BSA을 수행위와 2.4.2에서) 차단, 4 ℃에서 하룻밤 형광체 - 복합 일차 항체에 품어. PBS로 3 회 반복한다. 매니큐어와 antifade 에이전트와 DAPI와 물개와 슬라이드를 품어. </li><li> 4에서 알루미늄 호일 및 저장과 커버 슬라이드 트레이 영상 및 사진에 대해 언제까지 몇 주 이상으로 C를 °. 1000 배 확대 한 카메라가 장착 임의 형광 현미경 영상 시스템을 이용하여 조회 및 사진 셀. </li><li> 근모 액틴 염색, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 슬라이드 블록을 30 분 동안 및 실온에서 20 분 동안 BODIPY FL-Phallacidin (녹색) 또는 로다 민 팔로이 딘 (적색)에서 배양. antifade 에이전트를 추가하고 위와 같이 밀봉. </li></ol></li></ol> 분자 연구 3. 클론 원성 배양 <ol><li> 서양 오 점 <ol><li> fibronec에 20,000 세포 / 60mm 판과 50,000 세포 / 100mm 판의 클론 원성 밀도에서 ER + 유방암 세포 MCF-7 또는 T47D을 품어주석 도금, 5 % CO 2에서 37 ℃에서 플레이트. </li><li> 해물에서 단백질 mg의 양을 필요로하는 분자 연구에 75,000 세포 / 100mm 판의 약간 높은 밀도에서 세포를 품어. 서양 말을 사용하여 분자 연구 또는 북부 말에 대한 RNA 분리에 대한 충분한 단백질을 수집하는 실험 포인트 당 열 플레이트까지 사용할 수 있습니다. </li><li> 휴대폰 번호를 기반으로 젤 로딩은 매우 다른 크기의 성장과 휴면 세포에서 단백질 발현을 비교하기위한 필요한 부가입니다. trypsinizing에 의해 세포를 수집하고 대신 하나의 에지 블레이드 세포를 긁어 서양 말에 대한 해물의 준비를 위해 0.2 % 트리 판 블루에서 혈구에서 나누어지는을 계산합니다. </li><li> 원심 셀 2 분 동안 10,000 XG에서, 흡인 매체를 제거 200 μL 용해 완충액을 추가 용해 완충액에 세포를 초음파 처리하고, 단백질 농도를 결정한다. </li><li> 셀의 개수에 의해 단백질 수율 나누어 세포 당 단백질의 양을 계산그 금액을 생성합니다. 동등한 세포 수를 나타내는 단백질의) 상응하는 금액과 B) 단백질의 양을 모두 나타내는 별도의 폴리 아크릴 아마이드 겔의 각 웰에 해물을 넣습니다. 적어도 25 μg의 단백질은 물론 각에로드해야합니다. 참고 :이 크기와 단백질 함량 (그림 1)에서 유의 한 차이가있는 성장과 휴면 세포 사이의 비교를 허용합니다. </li></ol></li><li> 유동 세포 계측법 <ol><li> 3.1에서와 같이, 트립신에 의해 100mm 판에서 세포를 수집하고 2.4에 설명 된대로, 세포 내 또는 세포 외 항원 중 하나에 대한 기본 또는 보조 면역 형광 염색법을 사용하여 (FACS) 프로토콜을 정렬 기준 형광 활성 세포에 의해 분석한다. 주 : 항체 표지에 의해 결정되는 트립신에 의해 조직 배양 플레이트로부터 세포를 분리하는 막 단백질의 농도에 영향을 미치지 않는다. </li></ol></li></ol>

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국방 보조금 DAMD17-01-C-0343 계열 DAMD17-03-1-0524, 뉴저지 주위원회 암 연구에 02-1140-CCR-E0 및 암 연구 루스 에스 트린 골드버그 기념관 (RW) 지원

우리의 모델은 골수에서 휴면 여러 주요 요소로 구성된다. 그것은 피브로넥틴, 골수의 주요 구성 요소, FGF-2, 성장 인자가 풍부 골수 기질 합성 이루어져 에스트로겐 장시간 10 골수에서 휴면 가능성 유형 감수성 세포를 이루어져 무겁게 상호 작용은 주로 하층 아르 클론 원성 세포의 밀도에서 골수 31,32 배양의 세포 외 매트릭스에 침착. 골수 미세 환경을 훨씬 더 복잡하지만 특정 기계론 질문을 필요에 따라, 이러한 단순한 시스템은 많은 복잡성으로 구축 될 수있다. 모델은 다수의 방식으로 세포의 성장 세포 생물학 기술, 기술 및 생체 분자 기법을 포함한 수면과 비교하기 위해 사용될 수있다. 세포 표현형을 다시 복제, 운동에 의해 분석 될 수있다과 침략 부착되지 종양이 특정 차단 항체 또는 펩티드 7을 사용하여 미세 환경과의 상호 작용에 대한 기능성 연구를 소 구체 형성 (36...

질병 빨리 작은 종양 혈관 2,3- 개발로, 검출 한 전에 유방암 세포는 골수 전이. 전이 과정은 신속한하지만 비효율적이다. 세포는 하루 4 당 수백만, 빠르게 새로운 혈관을 입력하지만 몇 원격 장기 (5)에 여행을 생존. 그럼에도 불구하고, 일부 미세 전이는 뼈에서 생존 및 단일 세포 또는 새로 진단 된 환자 1에서 골수 흡인 작은 세포 덩어리로 찾을 수 있습니다. 이러한 세포들을 6을 제거 할 목적으로 아주 반트 투여되는 화학 요법 레지스트. 이 저항은 골수 미세 환경 7,8과의 상호 작용에 의해 개시 시그널링 생존하여, 실질적으로 부여된다. 미세 전이는 지역화 된 유방암 여성의 약 1/3에서 찾을 수 있으며, 단 변량 분석 (9)에 의해 분석 할 때 생존의 독립적 인 지표를 나타낼 수 있습니다. 일부 micrometastases 성장 시작하지만 재발의 패턴은 세포 유형에 따라 달라집니다. 트리플 부정적인 유방암 환자는 휴면 상태를 통해 가난한 제어를 제안, 1~4년 사이에 재발하는 경향이있다. ER / PR + 세포를 포함한 다른 세포 유형은 재발 (10)의 안정, 지속적인 속도, 최대 20 년 동안 휴면 남아있을 수 있습니다. ER + 및 ER- 유방암 세포주와 종양 사이의 휴면 유전자 발현 서명 차이는 다른 휴지 전위 (11)를 반영하지만, 골수 기질과의 상호 작용 가능성 휴면에 크게 기여하고있다. 미세 전이가 드문 이상 10 6 -fold에 의해 조혈 세포에 의해 열세 때문에 생체 내에서 휴면의 연구는 매우 어렵다. 따라서, 관련 모델 메커니즘을 제안하고 생체 내에서 검증 가능한 가설을 생성 할 수 있습니다 체외 데이터를 제공하는 생성해야합니다. mathe 포함 휴면 모델 번호,matical 모델 (12, 13), 시험 관내 모델 7,8,14,15, 생체 이종 이식 모델 (16), 시험 관내 조합 및 이종 이식 모델 (17, 18) 및 자발적 종양 및 전이 모델 (19), 암 세포 휴면 (20)에 대한 통찰력을 수득 한 . 이러한 모델은 각각 자신의 한계를 가지고 있고 자신 분자 시그널링 및 휴면 더 생물학적으로 중요한 모델에서 시험 될 지배 상호 작용에 관한 가설을 생성하기위한 주로 유용하다. 휴면의 분자 메커니즘, ER + 세포의 재발을 초래할주기 정지, 재분화 및 치료 저항 및 메커니즘 결과 미세 환경과의 상호 작용을 정의의 전반적인 목표로, 우리는의 관련 요소를 선택 제공하는 체외 모델을 개발 간질 미세 7. 그 COMPO에있는 동안 상대적으로 드문 드문 한이 모델은,넌트는 휴면의 중요한 기능에 영향을주는 특정 분자 메커니즘을 유도하기 위해 수사관을 허용 할 수있을만큼 충분히 강력하다. 이러한 실험은 생체 내에서 직접 테스트 할 수있는 가설을 발생시킨다. 이 모델은 우리가 휴면에 관련 증명 몇 가지 핵심 요소에 의존한다. 그들은 그들의 상호 작용이 기층과 매체의 수용성 성분, 피브로넥틴 하층 및 염기성 섬유 아세포 성장 인자의 존재에 주로 클론 원성 밀도 에스트로겐 의존성 유방암 세포, 세포 배양의 사용을 포함한다 (FGF-2) 배지. 우리는, TGFβ (22)을 통해 매개 된 FGF-2 (21)에 의해 세포주기 정지의 유도를 포함한 체외에서 시스템을 제어하는 메커니즘을 특징에 의존 상피 표현형에 PI3 키나제 7,8 및 ERK (8)와 형태 형성의 분화를 통한 신호 생존 에서 RhoA의 비활성화, 인테그린45; 5β1 상향 조절과 생존 7,15에 대한 기질 피브로넥틴의 결찰 (그림 1). MCF-7 세포에 FGF-2의 생체 외 세포주기 효과는 농도 10 NG / ㎖ (21,23) 아래에 적어도 하나의 로그를 시작한다. 이론적 근거는 포유류 24 ~ 27의 숫자에 유방 유관 형태 형성, 순환 확장과 경기 침체에 적용 FGF-2 발현의 시간적 제어를 기반으로했다. 우리는 FGF-2 도관 3D 문화 (28)의 형태 형성, 일반적으로 인간의 종양 (29)의 악성 변화로 손실되는 FGF-2의 발현을 포함, 분화를 유도하는 것을 보여 주었다. FGR1의 발현은 4 FGF 수용체 (30)을 표현하기 위해 계속 (29) 및 MCF-7 세포 조사 유방암에 그대로 남아 있었다. 휴면 맥락에서, FGF-2에 의해 반출되고, 심하게는 조혈 줄기 세포 (33)의 기능에 보존 골수 기질 (31, 32) 상에 침착. 우리 민주 공화국FGF-2가 7 형태 형성 분화를 유도 골수에도 풍부한 피브로넥틴 하층, 배양 ER + 유방암 세포에서 휴면 상태를 유도함 onstrated. 모델에서 유방암 세포 성장 억제되어, RhoGap 그라프를 통해의 Rho을 비활성화 상피 표현형에 재분화 및 악성 진행과 인테그린 α5β1 lost-Express를 다시. 그들은 인테그린 α5β1 통해 피브로넥틴을 결합하고 그 세포 독성 치료 7,8,15 (그림 1)에 내성 렌더링 신호 생존을 활성화합니다. 클래스의 Rho GTP 아제 저해 휴면 34 표현형을 유도하는 이미 입증되었다. 여기에서 우리는 모델을 설정하고 ER + 유방암 세포의 휴면을 관리하는 특정 분자 세포 메커니즘을 연구하는 연구자를 허용 할 특정 절차를 간략하게 설명합니다. 여기에 제시된 실험에서는 모델의 사용을 설명하기우리의 Akt 억제제 및 PI3K 억제제와 팬의 Rho 억제제와의 Rho 키나제 (ROCK) 억제제와의 Rho 가족 (그림 1B)의 모든 회원들과 PI3K 경로 (그림 1B)를 대상으로.

<table><tbody><tr><td>MCF-7 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>T47D 세포&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-123</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC 처리 멀티웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>354411</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes</td><td>Corning</td><td>354403</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes</td><td>Corning</td><td>354451</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat 22x22mm #1 인간 피브로넥틴의 균일한 적용을 위한 Glass Coverslip</td><td>Corning</td><td>354088</td><td></td></tr><tr><td>6 Well tissue culture plate</td><td>CellTreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder</td><td>Corning Life Sciences</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화, 소 태아 혈</td><td>청 혈청 Source International</td><td>FB02-500HI</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신/2.21mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민, 100X, 액체</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF&nbsp; 기본</td><td>R & D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>Akt 억제제 (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)</td><td>CalBiochem</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>LY294002&nbsp;</td><td>CalBiochem</td><td>19-142</td><td>Chenical PI3K 억제제</td></tr><tr><td>C3 전이효소&nbsp;</td><td>세포골격</td><td>CTO3</td>는 <td>RhoA, RhoB, RhoC를 억제하지만, Cdc42 또는 Rac1</td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드로클로라이드</td>와 같은 관련 GTPase는 억제하지 않습니다.<td>산타크루즈 생명공학</td><td>129830-28-2</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY FL-Phallacidin (녹색)&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>B607</td><td>플루오로크롬 피브릴라 액틴 염색</td></tr><tr><td>BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (빨간색)&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>R415</td><td>플루오로크롬 섬유질 액틴 염색</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티-마우스 IgG 항체, ReadyProbes 시약&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>R37114</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>P-36931</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; 체외</em&gt; 골수에서 에스트로겐에 민감한 유방암의 휴면 모델 : 분자 메커니즘 연구 및 가설 생성을위한 도구

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

골수에서의 유방암 휴면에 대한 연구는 휴면 세포와 미세 환경의 상호 작용의 복잡성, 희귀성 및 조혈 세포의 압도적인 과잉으로 인해 매우 어려운 작업입니다. 이를 위해 우리는 골수에서 에스트로겐에 민감한 유방암 세포의 휴면에 대한 체외 2D 클론 생성 모델을 개발했습니다. 이 모델은 휴면에 필요한 몇 가지 핵심 요소로 구성됩니다. 여기에는 1) 장기간 휴면 상태로 유지될 가능성이 있는 유형인 에스트로겐에 민감한 유방암 세포의 사용, 2) 각 세포의 구조적 상호 작용이 주로 하층과 이루어지는 클론 생성 밀도의 세포 배양, 3) 골수의 주요 구조 요소인 피브로넥틴, 4) 골수 기질 세포에 의해 풍부하게 합성되어 세포 외 기질에 많이 축적된 성장 인자인 FGF-2가 포함됩니다. FGF-2로 배양된 세포는 6일 후 휴면 클론을 형성하며, 이는 뚜렷하게 평평한 모양을 가진 12개 이하의 세포로 구성되며 성장하는 세포보다 훨씬 더 크고 더 퍼져 있으며 세포질 대 핵 비율이 큽니다. 대조적으로, FGF-2 없이 배양된 세포는 주로 >30개의 비교적 작은 세포로 구성된 성장 콜로니를 형성합니다. 배양 후 3일째에 항체, 억제제, 펩타이드 또는 핵산으로 인한 시스템의 교란은 6일째에 휴면 세포의 다양한 표현형 및 분자 측면에 상당한 영향을 미칠 수 있으며 휴면 상태 또는 휴면 세포의 생존에 대한 막 국소 또는 세포 내 분자, 요인 또는 신호 경로의 역할을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 분석법의 시험관 내 특성을 인식하는 동시에 휴면 세포의 형성 및 생존에 필요한 분자 메커니즘에 대한 중요한 정보를 수집하는 데 매우 유용한 도구로 기능할 수 있습니다. 이 데이터는 생체 내 모델을 테스트할 가설을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

<html> 실험은 분석 요점을 되풀이하기 위해 실시 하였다. 실험의 시간 코스는도 2a에 도시되어있다. 세포가 하루 -1에 클론 원성 밀도로 배양, FGF-2 새로운 배지에서 하루 0에 추가되고 그들이 염색하고 식민지가 계산 될 때 세포는 6 일까지 배양. 시스템에 대한 교란이 10 배 최종 농도 100 μL 볼륨에서 3 일에 투여 원하는. 그림 (b)는 성장과 휴면 식민지의 전형적인 모습을 보여줍니다. 성장 식민지&gt; 30 세포를 포함하고 휴면 식민지가 큰 세포질 / 핵 비율로 세포를 성장보다 더 많은 배 12 이하 세포가 포함되어 있습니다. 그림 (c) 4 번씩 실시 전형적인 실험 결과를 보여줍니다. , FGF-2의 존재하에, 클론의 대부분이 휴면 상태 FGF-2를 첨가하지 않은 세포의 우세한 분포 성장 클론에 의해 표현된다. &gt; 그림 3 교란 에이전트가 날 3. 그림에 추가 된 실험의 ...

우리는 에스트로겐에 민감한 유방암 세포에 대한 골수의 휴면에 대한 체외 모델을 개발했습니다. 이 프로토콜의 목표는 휴면 상태의 분자 및 세포 생물학 연구와 생체 내 후속 테스트를 위한 가설 생성을 위한 모델 사용을 입증하는 것입니다.

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

다음 실험의 전반적인 목표는 본 인비트로(in vitro) 휴면 모델을 적용하여 분자 및 세포 메커니즘을 연구하고, 생물학적으로 더 복잡한 인비보(in vivo) 모델에서 검증하기 위한 가설을 생성하는 것입니다. 이는 에스트로겐 양성 유방암 세포를 피브린 넥(fibrin neck)이 코팅된 조직 배양 플레이트에서 세포 간의 상호작용보다 기질과의 상호작용이 주로 일어나는 동종 밀도로 배양함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 골수 내 유방암 세포를 모사하여 FGF two 및 피브로넥틴에 의해 지지 및 유지되는 일부 에스트로겐 양성 세포에서 휴면 상태를 활성화합니다.다음으로, 휴면 세포의 다양한 표현형 및 분자적 측면을 교란하고 휴면 상태 유지에서의 역할을 결정하기 위해 항체, 억제제, 펩타이드 또는 핵산을 첨가하여 시스템을 섭동시킵니다. 결과는 피브로넥틴이 코팅된 플레이트에서 FGF2로 배양된 세포를 처리했을 때 나타나는 성장 콜로니와 휴면 콜로니의 수 및 외형을 보여줍니다. 이 방법은 골수 미세환경에 위치한 에스트로겐 의존성 유방암 세포의 휴면 형성 및 유지에 어떤 신호 전달 경로, 접착 분자 또는 기타 특정 분자 기전이 관여하는지 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.먼저 CF 7개 세포주가 약 50% 밀도로 증식한 플레이트에서 배양액을 흡입하여 제거하고, 미리 데워둔 PBS로 세척합니다. 그런 다음, 태아 송아지 혈청이 포함되지 않은 DMEM 고농도 포도당 배지에 용해된 0.25% trypsin EDTA 용액 1 mL를 첨가합니다. 세포가 떨어지기 시작할 때까지 플레이트를 37 °C에서 1~4분 동안 배양합니다.세포가 플레이트에서 떨어져 단일 세포 현탁액을 형성하기 시작하면, 2 mL 피펫으로 여러 번 파이펫팅하여 남아 있는 세포 덩어리를 분쇄합니다. 트립신 처리 후 4분이 지나도 세포 덩어리가 남아 있다면, 해당 세포를 폐기하고 새로운 배양 세포를 준비하십시오. 4분 후에도 서로 부착되어 있는 세포가 남아 있으면 콜로니 수를 측정할 때 오차가 발생할 가능성이 높습니다. 트립신 처리된 세포를 플레이팅하고, 배양액에서 mL당 1,500 cells 농도로 재현탁합니다. 5 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 부드럽게 파이펫팅하여 혼합한 뒤, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고 현탁액이 주로 단일 세포로 구성되어 있는지 확인합니다.위 과정은 위상차 현미경 하에서 카운팅 챔버를 사용하여 수동으로 수행할 수

an-vitro-dormancy-model-estrogen-sensitive-breast-cancer-bone-marrow

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

체외 시스템에 수정 3 - D는 재구성 지하 막 여러 종양 세포 라인의 성장 특성 전이성 보조 사이트에서 종양 세포의 휴지 또는 proliferative 행위와 연관있는...

체외에서</em전이성 종양 성장에 휴면하고 스위치를 연구하기> 시스템

동물 모델은 자주 뼈에 암 전이를 공부하는 활용하고 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 뼈 전이 연구에 대한 종양 접종의 일반적인 두 가지 방법을 설명하고 간략하게이 모델을 모니터링하고 정량화하기 위해 이용 분석의 일부를 설명합니다.

뼈 전이의 모델

암 종양 주변 조직뿐만 아니라 로컬 프 및 항 염증 매개 의해 영향 복잡한 질환이다. 따라서, 오히려 피하 모델보다 이방성 주입 모델은 방식으로 더 잘 모방 인간의 병리 암의 진행을 연구하기 위해 유용 할 수 있습니다.

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

우리는 인간의 유방암에서 호르몬 작용을 연구하기위한 새로운 생체 모델을 개발했다. 이 조직 구조, 세포 간 상호 작용 및 분비 신호를 보존 수술 유방 조직 표본으로부터 분리 미세 조직에 기초한다.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 모델은 인간의 유방암에서 호르몬 행동을 연구하기 위해

프로토콜 인간 뼈 조직 이식편 모델 시스템에서 유방암 세포의 이동, 증식 및 집락 공부 설명된다.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

현재 보고서는 가장 화학저항성이 높은 하위 모집단의 농축에 중점을 두고 백혈병 세포에 대한 골수 미세환경 틈새의 영향을 모델링하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 요약합니다.

모델링 화학 요법 내성 백혈병<em&gt; 체외</em

이 원고는 종양 저산소증이 전이에 미치는 영향을 직접 테스트하고 그 작용 메커니즘을 해독할 수 있는 동물 모델의 개발을 설명합니다. 여기에 설명된 실험은 유잉 육종에 초점을 맞추고 있지만, 다른 종양 유형에도 유사한 접근법을 적용할 수 있습니다.

종양의 전이에 저산소증의 테스트 효과에 대한 생체 내 모델에서

이 프로토콜 생체 외에서 인간 전 임상 모델의 주변 혈액 monocytes 배양 암 세포 osteoclast 상호 작용을 모방 하기 위해 유 방 암 세포 라인에서 osteoclastogenesis의 개발을 설명 합니다. 모델 뼈 전이 형성의 우리의 이해를 심화 하 고 향상 치료 옵션 사용 될 수 있습니다.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

다리 (OS)의 뼈 기질 (괜 찮) 모델은 잘 설립 하 고 그림 여기. 그것은 기본 종양 성장에서 생체 외에서 흉내 낸 및 OS의 조직학 및 cytogenic이 공부에 대 한 이상적인 모델을 제공 하는 적당 한 발판으로 사용할 수 있습니다.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

환자 유래 제노이식(PDX) 모델과 이식 가능한 유전자 조작 마우스 모델은 인체 질환을 충실히 재구성하고 기본 및 번역 형 유방암 연구를 위한 선호 모델입니다. 여기서, 종양 생물학을 연구하고 약물 반응을 평가하기 위해 유방 지방 패드로 유방 종양 단편을 정형전으로 이식하는 방법이 설명된다.

유방암을 위한 전임상 모형으로 유방 종양의 정형소 이식

유방 상피 세포와 내피 세포 사이 교차 토크는 중요한 유방암 진행에 기여, 종양 성장, 및 전이. 이 연구에서는, 스페로이드는 혈관 및/또는 림프 성 내피 세포와 함께 유방암 세포에서 만들어졌으며 유방암 연구를위한 체외 시스템으로서 자신의 적용성을 입증했습니다.

유방암 연구를 위한 잠재적인 기능적인 시험관 내 모형으로 유방 상피 및 내피 세포 스페로이드

학습하세요 체외 유방암 휴면 모델을 통해 에스트로겐 양성 세포의 분자 메커니즘을 연구하는 방법을. FGF2와 피브로넥틴을 이용해 휴면 상태를 유도하고 다양한 억제제로 신호 전달 경로를 분석합니다.

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