탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

이 비디오는 다공성 세뇨관 골격을 제작하고 동맥 조직 공학을 위한 동적 기계적 컨디셔닝을 적용하는 방법을 보여줍니다. 이는 먼저 생분해성 엘라스토머와 어썰트 융합 방법을 사용하여 스캐폴드를 제작함으로써 달성됩니다. 그런 다음 골격은 세포 파종을 위해 준비되고 생물 반응기 시스템으로 조립됩니다.

생물반응기에서 혈관 평활근 세포는 골격에 씨를 뿌리고 배양됩니다. 몇 주 후, 주사 전자 현미경, h 및 e 염색, 엘라스틴 자가형광을 사용하여 조직을 수확하고 분석합니다. 그 결과 생성된 평활근은 다층적이고 수직 방향입니다.

미립자 표백과 같이 존재하는 이 기술의 주요 장점은 유리 주형을 사용하여 다공성 관형 골격 및 히알루론산을 제조하는 것입니다. 금형이 삭제되면 비계 금형은 유리관 조각으로 준비됩니다. 튜브를 홀더에 넣고 전날 준비한 히알루론산 용액을 튜브에 붓습니다.

히알루론산은 내벽을 따라 천천히 아래로 흐릅니다. 금형 바닥에 도달하면 금형을 뒤집습니다. 금형의 내벽이 용액에 의해 균일하게 코팅될 때까지 이 단계를 반복합니다.

코팅 후 준비된 모든 유리 주형을 섭씨 37도의 진공 오븐에서 24시간 동안 건조시킵니다. 일반적으로 유리 주형이 건조되는 동안 4개의 주형이 동시에 준비됩니다. 소금 입자를 준비하고 소금 입자를 25-32 마이크로 미터로 붓고 분쇄하고 SVE합니다.

다음날, 준비된 유리 몰드 맨드릴, PTFE 튜브, 열수축 슬리브 및 PTFE 링을 조립합니다. 먼저 맨드릴을 65mm 길이의 PTFE 튜브에 넣고 섭씨 120도에서 5분 동안 굽습니다. 전쟁 전에 기다리는 동안 PTFE를 축소하기 위해 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 혼성화 인큐베이터

튜브가 맨드릴을 감싸면 열 수축 슬리브를 맨드릴에 밀어 넣어 자유롭게 움직이도록 합니다. 그런 다음 맨드릴을 유리 몰드 내부에 놓고 A-P-T-F-E 링을 맨드릴 바닥에 부착합니다. PTFE 링이 유리 몰드 바닥에 꼭 맞는지 확인하십시오.

다음으로 주걱과 실리콘 고무 깔때기를 사용하여 유리 틀에 소금 입자 죽을 추가합니다. 그런 다음 주걱으로 곰팡이를 부드럽게 두드려 입자가 고르게 분포되도록 하고 과도한 소금을 긁어냅니다. 이제 예열 된 인큐베이터를 끄고 빠르게 적재하십시오 소금으로 포장 된 곰팡이를 사용하면 소금이 다음 30 분 동안 융합 된 후 섭씨 37도의 진공 오븐에서 24 시간 동안 곰팡이를 건조시킵니다.

냉각 후 다음날 PTFE 링을 고정하면서 스테인리스 스틸 맨드릴을 밀어 금형에서 제거합니다. 필요한 경우 바늘 코 펜치를 사용하십시오. 그런 다음 금형 바닥에서 PTFE 링을 제거합니다.

다음으로 금형을 굽혀 슬리브를 축소하고 금형에서 수축된 슬리브를 제거합니다. 금형이 사용될 때까지 식히고 후드의 건조제에 보관하십시오. apo 스포이드를 사용하여 유리 주형을 45도 각도로 조정하고 PGS 용액을 내부 내강에 떨어뜨리면서 주형을 천천히 회전시킵니다.

PGS 용액이 금형 벽을 따라 흘러내리는지 확인합니다. 건조한 부분이 있으면 PGS를 더 추가하십시오 이제 THF가 후드에서 최소 30분 동안 증발하도록 합니다. THF가 사라지면 진공 오븐에서 금형을 경화하십시오.

하루 동안 경화 한 후 금형을 실온으로 식히고 섭씨 24도의 탈 이온수에 천천히 수직으로 담그십시오. 너무 빨리 기울어지면 기포가 생겨 골격이 찢어집니다. 금형을 수조에 조심스럽게 옮깁니다.

실리콘 튜브를 사용하여 비스듬히 놓고 히알루론산이 한 시간 이상 녹도록 합니다. 한 시간 후에도 히알루론산이 금형에서 분리되지 않으면 곰팡이가 여전히 잠긴 상태에서 주걱을 사용하여 히알루론산을 양쪽 끝에서 천천히 밀어낸 다음 곰팡이를 천천히 흔듭니다. 이제 비계가 유리 틀 내부로 움직이지 않았는지 확인하고, 움직였다면 집게로 비계를 천천히 당겨 틀에서 분리합니다.

다음으로, 섬세한 골격을 부드럽게 저어주면서 탈이온수 수조에 조심스럽게 옮겨 소금 입자를 침출합니다. 이 작업은 최소 3일이 소요되며 매일 물을 교체해야 합니다.소금을 모두 침출한 후 각 골격을 탈이온수로 채워진 15ml 원심분리기 튜브로 옮기고 드라이 아이스 박스에 한 시간 동안 얼립니다. 뚜껑을 연 상태에서 얼린 원심분리기 튜브를 동결 건조기에 3일 동안 넣습니다.

동결 건조가 완료되면 사용할 때까지 골격을 건조제에 보관하십시오. 골격을 25-30mm 길이로 자르는 것으로 시작하십시오. 다음으로, 각 마개의 중간 구멍을 통해 PTFE 튜브를 공급하여 두 개의 실리콘 고무 마개를 준비합니다.

그런 다음 1.5mm 길이의 hs 링을 자르고 골격의 한쪽 끝에 길이를 밀어 넣습니다. 스토퍼에 부착된 PTFE 튜브 하나를 HS 링 아래에 있을 만큼 충분히 겹쳐서 스캐폴드를 튜브에 단단히 연결하고 HS 링을 오븐에서 수축한 다음 어셈블리를 실온으로 식히십시오. 이제 생물 반응기 챔버 역할을 하는 50mm 폴리카보네이트 튜브가 골격 위로 미끄러져 실리콘 고무 마개의 내부 표면에 고정됩니다.

이전과 마찬가지로 다른 PTFE 튜브와 스토퍼가 hs 링으로 골격의 다른 쪽 끝에 고정되어 챔버를 완성합니다. 두 번째 스토퍼는 폴리카보네이트 튜브의 다른 쪽 끝에 부착됩니다. 다음으로, 스토퍼의 외부 표면은 두 개의 알루미늄 합금 판에 부착됩니다.

각 플레이트의 측면 구멍에 두 개의 나사산 막대를 넣고 나비 나사로 플레이트를 고정합니다. 생물 반응기에 골격을 부착합니다. 이제 두 hs 고리 사이의 거리인 각 골격의 가시 가능한 길이를 측정하고 내부 표면적을 계산합니다.

세포 파종용. 오토클레이브에서 생물반응기 장치의 각 부분과 함께 각각 호일로 개별적으로 포장된 챔버를 멸균합니다. 멸균이 완료되면 세포 배양 후드 내부에 생물 반응기를 조립했습니다.

흐름 회로에서 분당 1mm의 연동 펌프를 사용하여 일련의 관류로 골격을 전처리하고 헹굽니다. 먼저 70% 에탄올, 50% 에탄올, 25% 에탄올로 각각 한 시간 동안 헹굽니다. 에탄올 헹굼을 세 번 한 후 2시간 PBS 헹굼을 합니다.

마지막으로, 생물반응기를 SMC 배양 배지로 24시간 동안 관류한 후 세포 파종 및 실험을 위한 준비가 됩니다. 이제 동봉된 원고의 지침에 따라 제곱센티미터당 200만 개의 세포로 바이오리액터를 파종하고 다음 21일 동안 튜빙 매체를 교체하고 펌프 속도를 조정합니다. 점차적으로, 구조체의 압력은 배양 첫날의 약 4mm 수은에서 배양 2주 후, 배양 3주 후 100mm 수은으로 증가하여 세포를 수확하고 첨부된 원고에 명시된 대로 분석을 위해 준비합니다.

이 관형 PGS 스캐폴드는 염 융합 방법으로 제작되었습니다. 주사 전자 현미경 사진은 모든 골격이 균일한 벽 두께를 가지며 단면에 부분적인 결함이 없음을 보여주었습니다. 무작위로 분포된 거대 및 미세공이 모든 골격의 내강 표면에서 관찰되었습니다.

세포 배양 후 다층 SMC는 흐름 방향에 대한 수직 방향으로 성장했습니다. 또한, 세포와 DCM 단백질은 모든 PGS 구조체의 내강을 완전히 덮었습니다. 엘라스틴 자가형광은 또한 구조체의 내강 표면에서 원주방향으로 조직된 탄성 섬유를 보여주었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 다공성 관형 골격을 만드는 방법, 사전 설계된 생물 반응기를 사용하여 세포 및 배양 골격을 보는 방법을 이해해야합니다.