ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

이 절차의 전반적인 목표는 상처 치유를 돕기 위해 줄기 세포를 전달하고 분화하는 데 사용할 수 있는 천연 생체 재료로 만든 복합 매트릭스를 만드는 것입니다. 이는 먼저 실험 동물에서 지방 유래 줄기 세포 또는 SC를 분리함으로써 달성됩니다. 다음으로, A SC는 미리 만들어진 키토산 미세구에 적재됩니다.

그런 다음 FIBRILLATED 콜라겐 젤을 캐스팅하고 A-S-C-C-S-M 비드를 콜라겐 젤 위에 겹겹이 쌓습니다. 마지막으로, PEG 피브린 겔을 A-S-C-C-S-M 콜라겐 겔 위에 던지고 배지를 첨가합니다. 궁극적으로, CSM 비드에서 콜라겐 및 PEG 피브린 매트릭스로 A SC의 양방향 동시 이동을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 절차를 통해 하나의 단일 줄기 세포 공급원이 콜라겐 및 PEG 피브린 미세환경으로부터 차등 신호를 받아 차등 자극을 받아 다발성 인자를 생성하고 혈관 전 구조의 네트워크를 형성할 수 있습니다. 단일 재료 복합체 또는 탈세포화된 피부 대체물과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이러한 다른 제품이 숙주에 의한 제품의 혈관재생(revascularization)을 적극적으로 처리하지 않는다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 분리된 RAD A SE가 돼지 피브린 매트릭스에서 배양될 때 혈관 표현형으로 분화하는 경향이 있다는 것을 알게 되었을 때 처음 떠올랐습니다.

이 관찰은 단일 줄기 세포 공급원이 다른 생체 물질로 구성된 시스템에서 동시에 활용될 수 있다는 개념을 촉발시켰습니다. 지방 유래 줄기세포 또는 ASC를 분리 및 배양하고, 키토산 미세구 또는 CSM을 준비하고, ASC를 CSM에 로드한 후, 4ml의 tris 완충 식염수에 숙시닐 글럿 경감 변형 PEG를 용해하여 폴리에틸렌 글리콜, 피브린 하이드로겔을 준비합니다. 실험 직전에 0.22 미크론 필터를 사용하여 용액을 멸균합니다.

6웰 플레이트 혼합물의 배양 웰에서 500마이크로리터의 피브리노겐 스톡과 250마이크로리터의 PEG 스톡을 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 이전에 제조된 A-S-C-C-S-M 250마이크로리터를 페길화 피브리노겐 용액과 혼합하고, 즉시 1ml의 트롬빈 원액을 첨가하고 피펫을 사용하여 신속하게 1회 또는 2회 트리레이트를 사용하여 세포 겔 혼합물을 12웰 플레이트에 넣고 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 챔버에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 생성된 페그 피브린을 HBSS로 두 번 세척하고 11일 동안 표준 광학 현미경 기술을 사용하여 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 10% FBS가 보충된 알파 최소 필수 배지로 배양합니다.

CSM에서 두 개의 일반 수산화나트륨을 사용하여 쥐 꼬리 힘줄에서 추출한 1형 콜라겐이 있는 겔 믹스 A-S-C-C-S-M으로의 세포 이동을 관찰합니다. pH를 6.8로 조정하고 피브릴레이트합니다. 12 Well 플레이트에 피브릴 콜라겐, A-S-C-C-S-M 혼합물을 첨가하고 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.

세동이 완료되었는지 확인한 후 콜라겐 A-S-C-C-S-M 젤을 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 최대 11일 동안 배양합니다. 표준 현미경 기술을 사용하여 11일 동안 CSM에서 겔로의 세포 이동을 관찰하여 단일 줄기 세포 공급원의 이동 및 공동 유도 특성을 연구하기 위한 이중층 구조를 개발합니다. 두 개의 바이오 스캐폴드를 사용합니다.

다음과 같은 약간의 변형으로 콜라겐과 PEG 피브린 젤을 모두 준비하고 콜라겐 1ml당 7.5mg을 준비합니다. 그런 다음 혼합물을 6웰 조직 배양 삽입물로 옮기고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 완전한 세동 후, 콜라겐 표면 위에 200 마이크로 리터의 5 밀리그램의 A-S-C-C-S-M을 배양 배지에 놓습니다.

미세구가 겔 위에 정착한 후 250마이크로리터의 세포 배양 배지를 사용하여 PEG 피브린 겔을 준비합니다. 그런 다음 페길화된 피브리노겐 트롬빈 용액을 A-S-C-C-S-M 콜라겐 층 위에 층을 이룹니다. 완료되면 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 30분 동안 구조물을 배양하여 완성합니다.

마지막으로, 구조체 위의 상부 챔버에 1ml의 매체를 놓고 하단 챔버에 3ml의 매체를 놓습니다. 이 골격에 내장된 SC의 특성화는 SC가 로드된 CSM이 콜라겐과 페그 피브린 층 사이에 동시에 끼워져 있을 수 있으며 두 세포 외 환경에서 신호를 차등적으로 받아 새로운 조건에서 번성할 수 있음을 보여주었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 콜라겐은 ASC가 줄기세포를 유지할 수 있는 능력을 지원했으며, 이는 녹색으로 stro one을 발현하는 것과 섬유아세포와 같은 형태학에서 입증되었습니다.

대조적으로, PEG 피브린은 여기에 표시된 튜브와 같은 형태에서 알 수 있듯이 ASC가 무혈관 표현형으로 분화하도록 유도했으며, 여기에 빨간색으로 표시된 von Willow 브랜드 및 인자의 내피 세포 특이적 발현으로 완성되었습니다. 또한, 여기에서 입증된 바와 같이, 이러한 관찰된 표현형은 배양 초기에 발생하는 것으로 보였으며 11일 동안 유지되었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 쥐 지방 유래 줄기세포를 분리하고, 키토 및 미세구에 로드하고, FDA 승인 생체 재료를 사용하여 이중층 하이드로겔에 통합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 프로토콜에 사용되는 생체 재료와 세포는 동물과 인간에서 유래했으며 숙주의 병원체에 오염되면 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 그리고 이러한 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비 및 무균 세포 배양 기술과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.