원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

다음 실험의 전반적인 목표는 원자력 현미경 마이크로 압흔을 사용하여 신선한 거울 폐 조직의 국소 탄성 특성을 직접 측정하여 상주 세포와 관련된 공간적 규모에서 폐 실질의 국소 기계적 환경을 특성화하는 것입니다. 이는 면도칼이나 메스 날로 팽창된 쥐의 폐 조직을 절단하여 길이와 너비가 5mm x 5mm, 두께가 400마이크로미터인 폐 실질 스트립을 준비함으로써 달성됩니다. 다음으로 고정되지 않은 un perme 폐 조직 스트립은 FM 미세 압입에 대한 관심 영역을 식별하는 면역 염색입니다.

그런 다음 실온에서 PBS의 조직 스트립에 FM 마이크로 압흔을 수행합니다. 신선한 폐 조직의 국소 탄성 특성을 직접 측정하기 위해 결과를 얻습니다. 이는 정상 및 섬유성 폐 실질에서 조직 경직도의 범위와 분포에서 현저한 차이를 보여주며, 특히 섬유성 폐 샘플 내에서 경직도의 큰 공간적 변화를 보여줍니다.

FM 마이크로 압입(micro indentation)을 사용하여 얻은 강제 변위 곡선에서 추출한 강성 맵을 기반으로 합니다. 조직 스트립 스트레칭과 같은 기존 측정에 비해 이 기술의 주요 장점은 전례 없는 공간 해상도를 제공하여 조직 강성의 미시적 변화에 대한 고유한 관점을 제공한다는 것입니다. 이 측정은 조직 내에서 강성이 공간적으로 어떻게 변하는지, 질병에서 강성 변화의 범위와 공간적 규모가 무엇인지와 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

조직 리모델링을 초래하는 과정: 폐 조직 스트립을 준비하려면 고립된 쥐의 폐를 팽창시켜 절단을 위해 폐 구조를 안정화하는 것으로 시작합니다. PBS에서 준비한 따뜻한 2% 낮은 겔 포인트 아로스의 체중 1kg당 50ml로 기관내로 기관을 묶고 부풀어 오른 폐를 섭씨 4도의 PBS 욕조에서 60분 동안 냉각시킵니다. 아로스는 공기 공간에서 겔화되고 뻣뻣해져서 폐 구조를 부드럽게 안정화시킵니다.이 간격 동안 면도기나 메스를 사용하여 아로스 안정화된 쥐의 폐 조직을 길이와 너비가 약 5 x 5mm, 두께가 400마이크로미터인 스트립으로 자릅니다.

그런 다음 섭씨 37도의 PBS에서 스트립을 5분 동안 세척하여 잔류 아로를 제거하여 큰 기도와 혈관을 배제합니다. 기도가 큰 혈관을 이미지화해야 하는 경우 주 줄기 기관지에서 멀리 떨어진 흉막하 영역에서 스트립을 자르고, FM 마이크로 압입에 대한 관심 영역을 격리하기 위해 주 줄기 기관지에 더 근접한 폐 조직에서 스트립을 자릅니다. 얼굴 조영제 현미경 검사 또는 면역염색으로 조직을 시각화하고 형광 현미경으로 시각화합니다.

절차에 대해서는 이 프로토콜의 서면 부분을 참조하십시오. FM 특성화 직전에 떠 있는 조직 아래에서 커버 슬립을 들어 올려 조직 스트립을 폴리 L 라이신으로 코팅된 15mm 커버 슬립에 부착하고 조직 스트립이 커버 슬립 표면에 고르게 퍼지도록 합니다. 필요한 경우 스트립을 두 번째 깨끗한 코팅되지 않은 커버 슬립으로 끼우고 폴리 L 라이신 코팅 커버 슬립에 조직을 부착하는 데 도움이 되도록 약한 압력을 가합니다.

각 마이크로 압입 실험 직전에 제조업체의 지침에 따라 A FM 시스템을 보정하십시오. 이를 위해 두 가지 중요한 매개 변수를 결정하십시오. 공기 중 열 변동 방법을 사용하는 캔틸레버 스프링 상수와 캔틸레버 편향 감도는 포토 다이오드 출력 신호를 실제 캔틸레버 편향 거리로 확장하는 데 사용되는 매개변수입니다.

깨끗한 유리 슬라이드에서 PBS의 표준 강제 변위 곡선을 얻어 편향 감도를 보정합니다. 그런 다음 강제 변위 곡선 측정에서 강제 변위 곡선의 기울기를 계산합니다. A FM 팁은 팁 변위 델타 Z.It 의 함수로 모니터링되는 캔틸레버 델타 D의 편향과 함께 단일 위치에서 샘플 표면을 향해 확장되고 수축되며, 미터 당 0.06 뉴턴의 스프링 상수를 가진 FM 프로브를 사용하여 5 마이크로 미터 직경의 규산 보 실리케이트 구형 팁이있는 실리콘 질화물 삼각형 캔틸레버를 사용하는 것이 좋습니다.

우리는 기계적으로 100에서 50, 000 파스칼에 걸쳐있는 깎아 지른 것처럼 모듈화 된 부드러운 재료를 특성화했습니다. 샘플 커버 슬립의 바닥 표면을 티슈 페이퍼로 닦은 다음 진공 그리스를 바르고 표준 유리 슬라이드에 고정합니다. A FM 샘플에 유리 슬라이드를 장착합니다.tage 및 500마이크로리터의 실온 PBS로 조직을 덮습니다.

그런 다음 FM 스캐닝 헤드를 샘플 위에 놓습니다. 현미경 조정 sample stage를 사용하여 접안렌즈용 현미경을 설정합니다. viewA FM 팁을 필드 중앙에 정렬합니다. A FM 샘플 스테이지를 이동하여 조직의 관심 영역을 선택합니다.

그런 다음 CCD 카메라 보기로 전환하여 원하는 대로 조직의 위상차 이미지 및/또는 형광 이미지를 기록합니다. A FM 팁이 샘플과 접촉할 때까지 천천히 아래쪽으로 움직입니다.amp정확합니다. 소프트 샘플의 FM 마이크로 인덴테이션 특성화에는 큰 국소 변형을 피하기 위해 작은 인덴테이션 깊이가 필요하며, 이는 큰 변형을 피하기 위해 탄성 계수 계산에 사용되는 헤르츠 모델을 무효화하고 캔틸레버 최대 편향을 500나노미터로 설정하여 트리거 모드에서 인덴테이션을 수행합니다.

이 편향 한계는 최대 압입력을 30나노뉴턴 미만으로 제한합니다. 압흔 속도는 소프트 샘플의 점탄성 특성보다는 탄성 특성을 탐색할 수 있을 만큼 충분히 느리게 선택해야 합니다. 관심 영역에서 한 번의 측정을 위해 폐 조직에 대해 초당 2에서 20마이크로미터의 속도 범위를 선택합니다.

A FM 프로브를 관심 위치로 이동하고 한 번의 압흔을 수행하여 표준 힘 변위 곡선을 수집합니다. 프로브는 Z 방향으로만 이동합니다. 관심 영역을 자동으로 매핑하려면 강제 매핑 모드로 전환하고 스캔 크기와 s를 선택합니다.amp선택한 영역 내의 링 포인트.

A FM 팁은 압흔 이동 사이의 샘플 표면을 가로질러 RA를 진행하고 inde에서 정의된 샘플 그리드 내의 각 지점에서 개별 강제 변위 곡선을 수집합니다. 우리는 16 x 16 샘플 그리드를 사용하여 초당 20마이크로미터의 압입 속도로 80마이크로미터 x 80마이크로미터 영역을 매핑하는 것이 실용적이라는 것을 알게 되었으며, 이는 약 10분 안에 완료할 수 있습니다. Young의 계수를 계산하기 위해 여기에 표시된 대로 Lee square의 비선형 곡선 피팅을 사용하여 힘 변위 곡선을 헤르츠 구형 압흔 모델에 맞춥니다. 여기서 F는 K 하위 C 곱하기 델타 D는 캔틸레버를 구부리는 힘입니다.

K sub C는 캔틸레버 스프링 상수입니다. R은 구 팁 반경 델타가 델타 Z에서 델타 D를 뺀 값인 움푹 들어간 곳이고, 새로운 것은 샘플 포아송 비율로, 폐 조직의 경우 0.4와 같습니다. 피팅의 품질을 평가하려면 SSR 값 또는 비선형 곡선 피팅 중 데이터와 피팅 값 간의 차이의 제곱합을 계산하십시오.

SSR 값이 큰 잘못된 곡선에서 데이터를 버려 신뢰할 수 없거나 해석할 수 없는 측정값을 제거합니다. 원하는 경우 탄성 계수 또는 E를 순단 계수로 변환합니다. G. 관계 E를 사용하여 힘 맵 모드에서 수집된 강성의 공간 패턴을 시각화 G.To 새로운 시간을 더한 두 배와 같 힘 맵 모드, 플롯 계수 데이터 및 등고선 맵에서 수집된 강성의 공간 패턴을 시각화합니다(예: 80 마이크로미터 x 80 마이크로미터 영역을 포괄하는 16 x 16 그리드).

많은 양의 힘 곡선 데이터를 처리하기 위해 힘 변위 곡선을 자동으로 맞추고, 모듈 식을 추출하거나 윤곽 맵 또는 ELA 그래프를 플롯하는 사용자 지정 알고리즘을 작성할 수 있습니다. 방금 설명한 것과 동일한 절차와 매개 변수를 사용하여이 그림은 Im이 조직을 적절하게 절단하고 염색했음을 보여줍니다. 폐 실질의 폐포 마이크로는 기저막 구성 요소에 대한 면역형광 염색에 의해 관찰된 바와 같이 잘 보존되어 있으며, 고정 또는 투과 없이 라미닌입니다.

이 패널은 콜라겐에 대한 면역형광 염색을 보여주며, 그 중 하나는 이전에 PBS로 처리되거나 섬유증을 유발하기 위해 blio 마이신으로 처리된 마우스에서 채취한 고정되지 않은 신선한 폐에 있습니다. FM 마이크로 압흔에서 얻은 샘플 힘 변위 플롯은 동일한 적용된 힘으로 여기에 표시됩니다. A FM 팁은 부드러운 영역에 큰 움푹 들어간 곳을 생성하여, 작은 움푹 들어간 곳에 비해 파란색으로 표시되는 상대적으로 평평한 힘 변위 곡선과 빨간색으로 표시되는 더 뻣뻣한 영역에 대한 가파른 힘 변위 곡선을 생성합니다.

각 압흔 후 깨끗한 힘 곡선을 얻으려면 A FM 팁을 샘플 표면에서 완전히 후퇴시키고 다음 압흔 전에 접촉하지 않아야 합니다. 이 비접촉 상태는 팁이 캔틸레버 편향 없이 변환되는 곡선의 평평한 영역에 해당합니다. 이 그림은 소프트 샘플이 팁에 부착되는 경우와 같이 팁이 샘플 표면에서 완전히 후퇴하지 않을 때 발생하여 팁이 소프트 샘플에 완전히 갇힌 경우 접촉점을 결정할 수 없는 평평한 영역이 없는 일반적인 거짓 곡선을 보여줍니다.

곡선은 뚜렷한 편향이 없지만 작은 노이즈가 없는 것처럼 보일 수 있습니다. 이 그림은 강성을 보여줍니다. 강제 변위 곡선에서 추출한 데이터는 ELA 이식편이라고 하는 강성 맵으로 공간적으로 표시되며, 여기서 강성 ELA 이식편이 있는 색상 스케일은 정상 및 섬유성 폐 실질에서 조직 경직도의 범위와 분포의 현저한 차이와 특히 섬유성 폐 샘플 내에서 강성의 큰 공간적 변화를 보여줍니다.

이 비디오를 시청한 후에는 원자력 현미경 복사를 사용하여 신선한 폐 조직의 국소 탄성 특성을 직접 측정하여 폐 실질의 국소 기계적 환경을 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.