Name: 원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 배우세요 원자력 현미경 미세압입 기술을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성을 측정하는 방법을. 정상 및 섬유화 폐 조직 간 강성 차이를 고해상도로 분석하여 질병 기전을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

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우리가 그들의 지속적인 협력 A. Tager 및 B. 쉬어 감사하고, 여기에 데모 목적으로 사용되는 폐 조직을 제공. 이 작품은 건강 부여 HL - 092961 국립 연구소에 의해 지원되었다. 이 작품은 NSF 수상 항법 - 0,335,765 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원하는 Nanoscale 시스템 (CNS), 국립 나노기술 인프라 네트워크의 회원에 대한 센터에서 부분적으로 실시되었다. CNS는 하버드 대학에서 예술과 과학의 학부의 일부입니다.

1. 폐 조직 스트립 준비 <ol><li> 폐 조직은 고도로 규격 및 AFM 특성화를 위해 스트립으로 절단하기가 어렵습니다. transiently, 절삭에 대한 폐 구조를 안정화 2퍼센트 낮은 젤 포인트 아가로 오스 (PBS에서 준비) 50 ML / kg 체중과 intratracheally 고립 마우스 폐가 팽창하기 위해서는 37 ° C.에 예열 기관을 묶어 4에서 PBS의 목욕에있는 높게 폐가 멋진 ° C를 60 분. 아가로 오스는 젤 부드럽게이 간격 5시 폐 구조를 안정화하기 위해 airspaces에 굳어지다 것입니다. 높은 아가로 오스의 농도 즉, 3-4%는 추가 가공을 위해 조직 안정화를 향상하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 길이와 폭 5 X 5mm 두께 400 μm의의 스트립에 면도칼이나 메스 블레이드와 아가로 오스 - 안정화 마우스 폐 조직을 잘라 다음 37 미리 예열 PBS의 목욕에있는 스트립을 씻어 ° C 100 ML을 사용하여 잔류 아가로 오스를 제거하는 5 분간 벤치 - 최고 온수 저어 플레이트에 유리 비커. 대형 항공 및 선박을 제외하려면 주요 줄기 기관지에서 멀리 subpleural 지역에서 스트립을 잘라. 기도와 대형 선박이 몇 군데 수있다면, 주요 줄기 기관지 더 근위 폐 조직에서 스트립을 잘라. </li></ol> 2. AFM의 Microindentation 및 형광 이미징 <ol><li> AFM의 microindentation에 대한 관심 영역을 분리, 조직은 위상 콘트라스트 현미경에 의해 시각, 또는 immunostained 및 형광 현미경에 의해 시각하실 수 있습니다. immunostaining 들어, 실온에서 고정 또는 permeabilization없이 2 시간 동안 원하는 차 항체의 소스 (PBS)에서 혈청 5%와 조직에 부착된를 차단합니다. </li><li> 적절한 기본 항체와 조직 스트립을 품어 (예 : 토끼 전 지하 막을 시각화하기 위해 중간 콜라겐 (1:250 희석), 토끼 안티 laminin (1:250 희석)를 시각화하는 안티 - 콜라겐) 12 잘 판의 우물에 1 시간 동안 부드러운 떨고있는 락커에 1 형광 태그 (예 : 알렉사 플루어 546 염소 안티 - 토끼 보조 항체 (1:250 희석))에 복합 적절한 보조 항체 다음 5 분 PBS와 각 샘플 3 번이나 씻어 상온에서 시간. </li><li> 4 PBS에 PBS 및 저장과 광범위한 조직 스트립 와시 ° C </li><li> 즉시 AFM 특성화하기 전에, 부동 조직 아래에서 coverslip을 운반 조직 스트립이 coverslip 표면에 균일하게 확산 확인함으로써 폴리 - L - 라이신 - 코팅 15 mm coverslip으로 조직 스트립을 장착, 필요한 경우, 샌드위치 스트립 두 번째 깨끗한와 coverslip을 uncoated 및 폴리 - L - 라이신 - 코팅 coverslip으로 조직 첨부 파일과 함께 지원하는 가벼운 압력을 적용합니다. </li><li> microindentation 실험의 각 라운드 바로 앞에 제조의 지시에 따라 AFM 시스템을 보정합니다. ; 실제 캔틸레버 편향 거리에 photodiode 출력 신호를 확장하는 데 사용하는 매개 변수이며, 2) 캔틸레버 편향 감도, Δd 1) 캔틸레버 공기 6 열 변동의 방법을 사용하여 스프링 정수 두 가지 중요한 매개 변수를 확인합니다. 다음 힘 - 변위 곡선 (Fig.1B)의 기울기를 계산 깨끗한 유리 슬라이드에 PBS에서 표준 힘 - 변위 곡선을 얻어 편향 감도를 보정합니다. 팁 변위, Δz의 함수로 모니터 캔틸레버의 편향, Δd와, 힘 - 변위 곡선 측정에서 AFM 팁는쪽으로 확장하고 단일 위치에서 시료 표면 (XY 방향으로 rastering없이)에서 철회 . </li></ol> 우리는 5 μm의 직경 borosilicate 구형 팁 (Novascan)과 실리콘 질화물 삼각형 캔틸레버를 사용하는 것이 좋습니다. 0.06 N / m의 상수 온천과 AFM 프로브를 사용하여, 우리는 기계적 전단 moduli 50,000 PA에 100을 스팬와 부드러운 소재를 특징있다. <ol start="6"><li> 조직 종이로 샘플 coverslip 하단의 표면을 닦고, 진공 그리스와 표준 유리 슬라이드에 고정 AFM 샘플 단계에있는 유리 슬라이드를 탑재, 500 μl PBS (상온)로 조직을 커버. </li><li> 현미경 샘플 단계를 조정하여보기의 필드의 중앙에 AFM 팁 정렬하는 눈 - 피스 볼 수있는 현미경을 설정합니다. AFM 샘플 스테이지를 이동하여 조직에 대한 관심의 영역을 선택한 다음, 원하는대로, 위상 콘트라스트 이미지 및 / 또는 조직의 형광 이미지를 기록보기 CCD 카메라로 전환합니다. </li><li> 이 샘플과 접촉 때까지 천천히 아래쪽으로 AFM 팁을 이동하여 표준 AFM의 결합 작업을 수행합니다. </li><li> 부드러운 샘플 정확한 AFM의 microindentation 특성화 작은 압입 깊이가 탄성 계수 계산에 사용되는 헤르츠 모델을 무효화 대규모 지역 긴장을 피하기 위해 필요합니다. 대형 변종을 피하기 위해, 500 nm의로 캔틸레버 최대 편향 (트리거 포인트)을 설정하여 트리거 모드에서 들여쓰기를 수행합니다. 이 편향 제한을 억제합니다최대 압입 강제로 30 NN (F = 캔틸레버 스프링 상수 * 변위, 또는 F 최대 = 0.06 NN / NM * 500 NM = 30 NN). </li></ol> 압입 속도는 부드러운 샘플 7 탄성 오히려 점탄성 특성을 탐구하기 위해 충분히 속도로 선정한다. 초당 20-20 μm의의 속도 범위는 폐 조직에 적합합니다. <ol start="10"><li> 관심 영역에서 하나의 측정에 대한 관심의 위치에 AFM의 프로브를 이동하고 표준 힘 - 변위 곡선을 (탐사선이 XY 스캔하지 않고 Z - 방향으로 이동) 수집하는 하나의 들여쓰기를 수행합니다. </li><li> 관심 영역의 자동 매핑 들어, 강제 맵 모드로 전환 선택한 지역 스캔 크기 및 샘플 포인트를 선택합니다. 포스 -지도 모드에서 AFM 팁 들여쓰기 변동 사이의 시료 표면에 걸쳐 rasters하고 정의된 샘플 격자 내의 각 지점에서 개인 힘 - 변위 곡선을 수집합니다. 더 많은 샘플링 지점은 높은 공간 해상도를 제공하지만, 매핑에 필요한 시간을 길게합니다. 우리는 실천 ~ 10 분 이내에 완료할 수 초 당 20 μm의의 들여쓰기 속도에서 80 X 80 μm의 영역을지도로 16 x 16 픽셀의 샘플 격자를 사용하여 발견했습니다. </li></ol> 3. AFM 데이터 추출 <ol><li> 의 영 계수를 계산하기 위해 최소 제곱 비선형 휘었 피팅 8 (Fig.1 A, C)를 사용하여 헤르츠 구면 들여쓰기 모델 힘 - 변위 곡선에 맞게 : <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="방정식 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="방정식 1"> 어디 F = K C * Δ D는 캔틸레버을 휘게하는 힘이있다, K C는 상수 캔틸레버 온천, R은 둥근 팁 반경이며, δ = Δ Z - Δ D는 들여쓰기입니다 υ는 샘플 포이슨 비율 (는 υ = 폐 조직 9 0.4). </li><li> 적합의 품질을 평가하기 위해, 비선형 곡선 피팅 동안 SSR 값, 또는 데이터와 맞지 값 사이의 차이의 제곱의 합계를 계산합니다. 대형 SSR 값 "나쁜"곡선에서 폐기 데이터가 신뢰할하거나 선택을 취소 interpretable 측정을 제거합니다. </li><li> 원하는 경우, 관계를 이용하여 전단 계수 (G)로 탄성 계수 (E)를 변환 E = 2 X (1 + υ) × G.는, 등고선지도의 줄거리 계수 데이터를 강제로지도 모드에서 수집한 강성의 공간적 패턴을 시각화하는 (16 x 16 픽셀의 샘플 격자의 예는 80 X 80 μm의 영역을 커버). </li><li> 힘 곡선 데이터의 대량를 처리하기 위해 사용자 지정 알고리즘을 자동으로 3.2 3.3 (예 : Matlab)에 명시된 바와 같이 동일한 절차와 매개 변수를 사용하여 힘 - 변위 곡선, 추출 moduli 및 / 또는 플롯 elastographs에 맞게 기록될 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 (A) 구형 프로브를 (Dimitriadis E., 외. 2002 Biophys J 8 허가를 재현)를 사용하여 단단한 기판에 부드러운 시료의 AFM의 microindentation의 도식. (B) 대표 힘 - 변위 곡선은 캔틸레버 편향 감도를 결정하기 위해 PBS에 깨끗한 유리 슬라이드에서 수집했습니다. (C) 대표 힘 - 변위 곡선 (A)에서 해당 매개 변수를 보여주는 소프트 (파란색)과 치열한 (적색) 샘플에서 수집했습니다. 4. 대표 결과 : 그림 2A 직접 관심 지역의 위 장소에서 AFM 프로브와 PBS에서 폴리 - L - 라이신 코팅 coverslip에 부착하고 microindentation 매핑 준비 폐 실질 조직의 스트립을 보여줍니다. 그림 2B 제대로 자르고 스테인드 조직에서 폐 실질 조직의 폐포 마이크로 아키텍처는 물론 고정 또는 permeabilization없이 지하 막 구성 요소 laminin에 대한 immunofluorescent 얼룩에 의해 관찰, 보존는 것을 보여줍니다. 콜라겐 섬유증 10 유도 이전에 PBS (그림 2C)로 치료 생쥐에서 수확하거나, bleomycin (그림 2D)로 치료 신선한 떼어낸 폐 속에서 위해 그림 2 CD 쇼 immunofluorescent 얼룩. 그림 3A는 AFM의 microindentation에서 얻은 샘플 힘 - 변위 플롯을 보여줍니다. 동일한 응용 강제로 AFM 팁은 (stiffer 지역을위한 작은 들여쓰기와 "가파른"힘 - 변위 곡선 비교 상대적으로 "평면"힘 - 변위 곡선의 결과, 부드러운 영역 (파란색 선)에 큰 굴곡을 생성 레드 라인). 깨끗한 힘 곡선을 얻기 위해서는 각 들여쓰기 후 AFM 팁은 다음 들여쓰기하기 전에 샘플 표면과 접촉에서 무료로 완전히 철회해야합니다. 이 연락처 프리 스테이트는 끝 캔틸레버 편향없이 변환 그림 3A에서 곡선의 평평한 지역에 해당합니다. 그림 3B는 팁 완전히 샘플 표면에서 철회하지 않을 경우 (예 : 소프트 샘플 발생하는 평평한 지역이없는 전형적인 허위 곡선을 보여줍니다팁)는 불가능 접촉 지점을 결정하기 위해 만들기 위해 ttaches. 팁이 완전히 부드러운 샘플에 갇혀있다면, 곡선은 분명 편향하지만 작은 노이즈없이 그림 3C와 같이 보일 수 있습니다. 그림 4는 강성지도 (elastographs), 전단 계수와 컬러 비늘 같은 공간 표시 힘 - 변위 곡선에서 추출한 전단 계수 데이터를 보여줍니다. Elastographs 특히 fibrotic 폐 샘플 내에 인상적인 정상의 범위와 조직 전단 계수의 분포의 차이 (그림 4A)과 fibrotic (그림 4B) 폐 실질 조직 및 전단 계수에 큰 공간적 변화를 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 마우스 폐 실질 스트립 이상의 AFM 프로브를 보여주는 (A) 위상 콘트라스트 현미경. 스케일 바, 50 μm의. (B) 일반적인 마우스의 폐 조직에서 laminin의 Immunostaining 정상 폐 실질 조직의 폐포 마이크로 아키텍처를 보여주는. 화이트 박스는 전형적인 80 - 80μm의 탄성 매핑 영역을 나타냅니다. 스케일 바 : 20 μm의. 생리 (C) 및 bleomycin (D) 치료를 마우스 폐 실질 조직의 콜라겐 I을의 (C 및 D) Immunostaining. 스케일 바, 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. (A) 대표 interpretable 힘 - 변위 곡선은 각각 호수 (파란색)과 bleomycin - 대우 (적색) 마우스 폐 실질 조직에서 수집했습니다. 블랙 라인은 구면 헤르츠 모델에서 발생하는 가장 적합하고 해당 계산 영 moduli으로 표시됩니다. (B, C) 대표 취소 interpretable 힘 - 변위 곡선. <img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 호수 (A)와 bleomycin - 대우 (B) 마우스 폐 실질 조직에서 수집한 대표 elastographs. 색상 막대 kilopascals의 전단 계수를 나타냅니다. 축 라벨 micrometers의 공간적 스케일을 나타냅니다. 스케일 바 : 20 μm의

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

AFM의 microindentation를 사용하여 폐 조직의 기계적 특성은 조직 경직에 microscale 변화에 대한 독특한 시각을 제공 전례 공간 해상도 (그림 4) 제공합니다. 그 유틸리티의 예를 들어, 정상 및 fibrotic 폐 조직 스트립에서 이전 매크로 규모 측정 섬유증 11,12와 elastance에서 대략 2 - 3 - 배 증가 지적했다. 반대로, AFM의 microindentation는 조직 stiffening 일부 지역은 정상적인 폐 조직 10 관찰 평균 이상의 전단 계수에 ~ 30 배 증가 최대 전시와 함께, 매우화된입니다 보여줍니다. 매트릭스 강성 이제 비판적으로 세포 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으므로,이 지역의 측정은 폐암 세포의 세포 배양 연구의 biofidelity을 향상시킬 소중한 매개 변수를 제공합니다. 몇 가지 실질적인 문제는 폐 조직의 얇은 스트립를 사용하여 발생. 조직 프로필은 기본 폐포의 구조를 다음과 같이 스트립의 표면은 완벽하게 평평하지 않습니다. 샘플 표면 높이 변화가이 도전을 극복할 수 있도록 15 μm의보다 작은 경우 AFM 시스템은 자동으로 들여쓰기 동안 Z - 방향으로 끝 위치를 조정합니다. 측정은 실온이 아닌 37 ° C에서 만들어진, 그래서 그들은 사소한 것으로 예상 것입니다하지만 온도에 변화에 의한 기계적 특성의 편차는 평가할 수 없습니다. 관찰 기계적 성질에 대한 기본 폐포 벽 구조의 영향력은 현재의 광 현미경 설치와 확인하기 어렵습니다. 예를 들어, 그것은에 부합하거나 벽 비행기에 가로 방향으로 패인 때 폐포 벽은 이방성 및 다른 기계적 특성을 전시 있는지 확인하는 것이 바람직하다 것입니다. 그러나, 현재의 표본은 두꺼운되고 이미징 시스템은 그러므로 그것이 접촉의 각 지점에서 현지 폐포 벽을 방향을 결정하는 것은 불가능합니다, 3D 기능을 가지고 있지 않습니다. 마지막으로, 측정된 기계적 성질에 대한 세포 성분의 영향을 완전히 elucidated로 남아 있습니다. 여기에 설명된 방법에 어떤 노력을 구체적으로 조직의 세포 성분을 제거하기 위해 만든되지 않습니다. 그러나, 세포가 들여쓰기에 사용할 수있는 표면에서 현재는 조직 수확 및 폐포에 액세스할 수있는 조직을 절삭의 필요성 이후의 경과 시간이 주어 가능한 것으로 않을 수 있습니다. 세포를 제거하거나 실용적 세포와 매트릭스를 repopulate하고, 조직 강성의 결과 변화를 평가하기 위해 특정 실험 보증 나타납니다. 신선한 떼어낸 조직은 이러한 측정이 필요하기 때문에, 측정하기 위해 조직 수확의 경과 시간은 최소화되어야하며 샘플 ° C가 기계적 성질의 변화를 피하기 위해 4 저장해야합니다. 조직 스트립은 세척하거나 최소한 왜곡 또는 손상이 생성되도록 얼룩 때 컨테이너간에 전송됩니다 때마다 특별한 관심을 지불하여야한다. 액체의 AFM 응용 프로그램의 경우, 중요한 단계는 가능한 한 평평하게 조직을 잘라 지원 coverslip에 샘플을 고정하는 것입니다. 가능한 경우, vibratome 또는 조직 슬라이 같은 자동 sectioning 기계는 매우 균일한 두께의 조각 절단하는 데 사용할 수 있습니다. AFM 측정 직전 조직 스트립을 첨부하여 예제는 결국 coverslips에서 분리하므로 AFM 측정 경과 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 하나의 유용한 관찰 큰 스트립이 전표를 커버하고 작은 스트립보다 PBS에서 더 이상 기간이 위해 장소에 남아보다 안정적으로 부착하는 표시이다. AFM의 microindentation는 5 μm의 직경 구형 팁있는 표준 0.06 N / m의 캔틸레버를 사용하는 경우 100 파 50 kPa (전단 계수)에 광범위한 스패닝 샘플을 특징하실 수 있습니다. 0.01에서 0.58 N / m에 이르는 직경 봄 상수의 0.6-12 μm의에서 상용 (예 : Novascan) 및 일반적으로 3 사용 범위 구형 유리 팁을 AFM 프로브,이 범위가 다른 스프링 상수와 프로브를 사용하여 확장하실 수 있습니다. 5 μm의 구형 팁으로, 팁 및 조직 사이의 이론적인 접촉 면적은 400-700 나노미터 들여쓰기 (그림 1A)에 대한 5-9에 대한 μm의 2입니다. 작은 또는 큰 팁은 공간 해상도 작은 또는 큰 스케일을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 피라미드 팁 또한 작은 접촉 영역을 제공하기 때문에 데이터 피팅이 팁 도형에 대한 더 복잡하지만, 매핑의 공간 해상도를 증가 AFM의 microindentation 13-16에 사용되었습니다. 이 방법은 몇 가지 한계가 주목하여야한다. 폐는 전통적으로 기계 압력 볼륨 분석 17 전체 폐의 ​​펀치 - 들여쓰기 19,20를 사용하는 예를 들어, 비 invasively 특징되었습니다. 같은 공기 - 액체 INT의 상실을 통해 중요한 방법으로 폐 아키텍처를 변경 여기에서 설명한 것과 침입 방법일반적으로 공기 주입 폐 및 호흡기 근육의 이완에 따라 폐 부분 인플레이션을 유지 미리 스트레스의 손실 존재 erface. 이러한 제한은 폐 조직에 부착된 18 만든 모든 측정에 공통적으로하고 있습니다. 특히, 그러나, 평균 강성 쉬고 볼륨 19,20에서 그대로 폐의 펀치 - 들여쓰기를 기반으로 견적에서 크게 차이가없는 정상적인 폐 조직의 실질 (전단 계수가 ~ 0.5kPa)에서 측정. 폐 조직이 증가하는 변형과 비선형 stiffening을 전시하는 것으로 알려져 있지만,이 속성이 여기에 사용된 방법과 마이크로 규모로 지속 여부를 엄격한 방식으로 테스트하는 것은 불가능합니다. 헤르츠 모델은 샘플의 균질성을 가정합니다. 그러나, 폐 실질을 포함한 대부분의 생물 학적 물질, 공간 비늘 감소에 점점 더 이질 있습니다. 샘플의 이질는 IE deforming있는 레이어 또는 구성 요소에 따라 들여쓰기 깊이에 따라 영 계수의 변화와 같은 유물이 발생할 수 있습니다. XY - 비행기의 이질은 신중로 Dimitriadis EK 외 제안한 biomaterial의 미세에 따라 적절한 구면 팁 크기를 선택하여 제한될 수 있습니다. 8 그것은 소재로 인해 헤르츠 모델 오류를 예측하거나 해결하기 위해 훨씬 더 큰 어려움입니다 Z - 방향으로 이질. Azeloglu 외. 최근 이산 임베디드 흠도 21 이기종 기판의 탄성 특성을 특징으로 하이브리드 컴퓨팅 모델을 제안했습니다. 그들의 새로운 기술은 잠재력이 Hertzian 분석의 한계를 극복 이종 재료의 포함 속성을 계산하는 방법을 제공합니다. 생물 학적 물질은 일반적으로 시간에 의존 점탄성 동작을 표시하면서 헤르츠 모델도 절대 탄성 동작을 가정합니다. 조직 전체 점탄성 특성을 사용 들여쓰기 판매율 변화하여 얻을 수 있습니다. 중요한 것은, 정상 및 fibrotic 폐 조직의 이전 매크로 규모의 기계 테스트가 약한 주파수 폐 조직 기계적 성질의 의존성, 그리고 주파수에 걸쳐 정상과 fibrotic 조직 기계적 성질의 차이의 보존을 보여 11 테스트. 이러한 결과는 강력 AFM과 함께 하나의 들여쓰기 속도를 사용하여 기계적 성질의 측정 섬유증을 동반 조직 기계적 성질의 변화의 핵심 부분을 캡처하는 것이 좋습니다. 이 작품에 사용되는 폐 조직에 대한 0.4의 포이슨의 비율은 매크로 측정 9 시부터입니다. 불행히도, 포이슨의 마이크로 규모 비율과 질병 상태에 따라 어떤 변화가 문학에서 사용할 수 없습니다. E, E / (1 ​​- υ 2) 또는 (1 - υ 2) / πE에 대한 대안이 (탄성 상수 K를 표시됨)으로 22 AFM의 microindentation에서 계산하고 포이슨의 비율이 알 수없는 경우 신고하실 수 있습니다. 대부분의 biomaterials에 대한 포이슨의 비율은 높은 수분 함량으로 인해 0.4-0.5의 범위에 있습니다. 범위 0.3-0.5 내에서 요소 1 / (1 ​​- υ 2) 포이슨의 비율에 합리적인 변화가 보고된 계수에 대해서만 효과를 발휘 겸손한 이러한 단 1.10-1.33부터 다릅니다. 우리가 정상 조직에 fibrotic 조직 친척보고 그 전단 계수의 증가 포이슨의 비율 변화와 관련된 오류가 관찰 기계적 성질의 변화에​​ 사소한 상대한다는 뜻인, 진도 몇 배입니다. 힘 - 변위 데이터의 분석에 사용할 수있는 실제 알고리즘과 코드는 특정 응용 프로그램 상태와 힘 - 변위 곡선의 다양한 인구의 후속 특성에 따라 달라질 수 있습니다. 보다 정교한 분석 관심있다면, 하나는 린 외의 작품을 참조 수 있습니다. 23. 저자는 이전에 들여쓰기 데이터 헤르츠 모델의 피팅을 자동화하는 노력을 장애가있는 합병증 중 많은 것들을 극복 알고리즘에 시너지 전략 일련의 컴파일. 여러 다른 지역이 방법의 발전과 개발에 사용할 수 있습니다. 한 항체 라벨없이 폐포 벽을 시각화에 관심이있는 경우에는, 엘라스틴과 콜라겐 모두 녹색 스펙트럼에서 autofluorescent 신호로부터 시각하실 수 있습니다. 반면에, 얇은 조직 섹션, 3D 이미징 기술, 또는 둘 모두를 사용하여 더 나은 영상은, 기계적 특성을 기본과 조직 구조를 상호 연관시킬 수있는 능력을 향상시킬 수 있습니다. 현재 방법 등 콜라겐과 laminin과 같은 세포외 기질 구성 요소의 얼룩과 시각화 수 있지만, 추가적인 노력은 특정 세포 집단을 식별하고 이러한 인구의 주변에있는 기계 microenvironments을 특성화하기 위해 세포 표면 마커를 얼룩 목표로 수 있습니다. 알트ernatively, 조직이 동일한 목표를 추구하는 마커 또는 셀 특정 단백질 혈통 찬란 - 태그를 표현 생쥐에서 수확 수 있습니다. 마지막 방법은 여기에 잘 개조 등 천식의 리모델링 고혈압의 선박 및 항공로, 폐의 다른 해부 학적 기능을 특성화에 맞는 세부 나타납니다. 더욱 강화 개발 및 잠재 자사의 현재 상태를 기반으로, AFM의 microindentation은 폐에 질병의 진행과 함께 조직의 강성의 변화에​​ 귀중한 통찰력을 얻을 태세를 표시하지 않으며 아무의 공간 및 시간적 변화를 특성화에 가치가 의심됩니다 다른 부드러운 조직의 다양한 강성.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> AFM 팁 </td><td> Novascan </td><td> PT.GS </td><td> 5 미크론 Borosilicate 구슬, 0.06 N / m </td></tr><tr><td> 폴리 - L - 라이신의 coverslips </td><td> VWR </td><td> 354085 </td><td> BD BioCoat 12mm 라운드 제일 유리 </td></tr><tr><td> 아가로 오스, 낮은 겔링 온도 </td><td> 시그마 </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> 토끼 방지 콜라겐 I (RB PAB) 항체 </td><td> Abcam </td><td> ab34710 - 100 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 546 염소 안티 - 토끼 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> A11010 </td><td></td></tr><tr><td> 토끼 안티 - Laminin </td><td> 시그마 </td><td> L9393 </td><td></td></tr></tbody></table>

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

매트릭스 강성 강력 1-3 자기편 세포의 성장, 분화 및 기능에 영향을 미칩니다. 매크로 스케일에서 인체 내에서 조직과 장기의 강성이 크기 4 몇 가지 명령을 스팬. 훨씬 적게는 강성이 조직 내에 공간 다릅니다 방법에 대해 알려진, 그리고 범위와 강성의 변화 공간적 규모는 조직 리모델링에 발생하는 질병 과정에서 무엇입니까합니다. 매트릭스 강성의 변화는 건강과 질병에서 세포 생리학에 기여하는 방법을 더 잘 이해하기 위해서, 주민등록 세포와 관련된 공간적 규모 얻은 조직 강성의 측정이 필요합니다. 이것은 폐, 매트릭스 개조 이러한 천식, 폐기종, 고혈압 및 섬유증과 같은 질병의 눈에 잘 띄는 기능이있는 매우 준수하고 탄력있는 조직에 특히 사실이다. 상주 세포와 관련된 공간적 규모 폐 실질 조직의 로컬 기계 환경을 특징하기 위해, 우리는 바로 원자 힘 현미경 (AFM) microindentation를 사용하여 신선한 murine 폐 조직의 로컬 탄성 특성을 측정하는 방법을 개발했습니다. AFM 압자, 캔틸레버와 압입 깊이의 적절한 선택과 함께,이 방법은 위상 대조 및 관심 지역의 형광 이미징과 병행하여 지방 조직 전단 계수의 측정을 수 있습니다. 조직 스트립의 체계적인 샘플링 전단 계수 지역 공간적 변화를 밝히지 조직 기계적 성질의지도를 제공합니다. 기계적 특성 및 기본 해부 및 병리 학적 기능 사이의 상관 관계는 강성이 섬유증의 매트릭스 증착에 따라 다릅니다 방법을 보여줍니다. 이 방법은 지방 조직이 기계적 성질은 공간과 질병의 진행에 걸쳐 다양 방법을 나타내기 위해 다른 부드러운 조직과 질병 프로세스를 확장할 수 있습니다.

세포외 기질의 강성은 강하게 점착 성의 세포의 여러 행동에 영향을 미칩니다. 매트릭스 강성은​​ 조직 전반에 걸쳐 공간 다양하고, 다양한 질병 상태에서 수정을 겪습. 여기 원자 힘 현미경 microindentation를 사용하여 정상 및 fibrotic 마우스 폐 조직의 경직의 공간적 변화를 특징하는 방법을 개발할 수 있습니다.

기질 강도는 부착 세포의 성장, 분화 및 기능에 강력한 영향을 미칩니다1-3. 거시적 관점에서 조직과 장기의 강도는...

다음 실험의 전반적인 목표는 원자 힘 현미경(atomic force microscopy) 마이크로 인덴테이션을 사용하여 신선한 폐 조직의 국소 탄성 특성을 직접 측정함으로써, 상주 세포와 관련된 공간적 규모에서 폐 실질의 국소 기계적 환경을 특성화하는 것입니다. 이를 위해 아가로 팽창시킨 마우스 폐 조직을 면도날이나 메스로 절단하여 길이와 너비가 5 by 5 mm이고 두께가 400 µm인 폐 실질 스트립을 준비합니다. 다음으로 고정되지 않은 비투과 폐 조직 스트립을 면역 염색하여 AFM 마이크로 인덴테이션을 위한 관심 영역을 식별합니다.그 다음, 실온의 PBS 내에 있는 조직 스트립에 FM 미세 압입 시험을 수행합니다. 신선한 폐 조직의 국소 탄성 특성을 직접 측정하여 결과를 얻습니다. 해당 결과는 정상 폐 실질과 섬유화된 폐 실질의 조직 강성 범위 및 분포에서 뚜렷한 차이를 보이며, 특히 섬유화된 폐 샘플 내에서 강성의 큰 공간적 변동을 보여줍니다.FM 마이크로 인덴테이션을 사용하여 얻은 강제 변위 곡선에서 추출한 강성 맵을 기반으로 합니다. 조직 스트립 신장과 같은 기존 측정법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전례 없는 공간 해상도를 제공하여 조직 강성의 마이크로 규모 변화에 대한 독특한 관점을 제시한다는 것입니다. 이러한 측정은 조직 내에서 강성이 공간적으로 어떻게 변화하는지, 그리고 질병 상태에서 강성 변화의 범위와 공간적 규모가 어느 정도인지와 같은 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.조직 리모델링을 유도하는 과정입니다. 폐 조직 조각을 준비하기 위해, 먼저 분리된 마우스 폐를 팽창시켜 절단 시 폐 구조가 안정되도록 합니다. PBS로 조제된 2% 저젤점 agarose 용액을 체중 kg당 50 mL의 양으로 기관 내에 주입한 후, 기관을 묶고 4 °C의 PBS 배스에서 팽창된 폐를 60분 동안 냉각합니다. agarose가 공기 공간 내에서 겔화되어 굳어지면서 폐 구조가 부드럽게 고정됩니다. 이 시간 동안 면도날이나 메스를 사용하여 agarose로 고정된 마우스 폐 조직을 길이와 너비가 약 5 by 5 mm, 두께가 400 µm인 조각으로 절단합니다.그 후 37°C의 PBS에서 5분 동안 스트립을 세척하여 잔류 aros를 제거하고 큰 기도와 혈관을 제외합니다. 큰 기도나 혈관의 이미지를 촬영해야 하는 경우 주기관지에서 더 근접한 폐 조직에서 스트립을 절단하고, 그렇지 않은 경우 주기관지에서 떨어진 늑막하 부위에서 스트립을 절단하여 FM 미세 압입(micro indentation)을 위한 관심 영역을 분리합니다. 위상차 현미경으로 조직을 관찰하거나 면역 염색 후 형광 현미경으로 관찰합니다.절차에 관한 내용은 본 프로토콜의 서술 부분을 참조하십시오. FM 특성 분석 직전에, 부유 상태의 조직 아래에서 커버 슬립을 들어 올려 조직 스트립을 poly L lysine 코팅된 15 millimeter 커버 슬립에 부착하며, 이때 조직 스트립이 커버 슬립 표면에 고르게 펴지도록 합니다. 필요한 경우, 스트립 위에 깨끗한 무코팅 커버 슬립을 덮고 가볍게 압력을 가하여 조직이 poly L lysine 코팅 커버 슬립에 잘 부착되도록 돕습니다.각 회차의 미세 압입 실험 직전에 제조사의 지침에 따라 AFM 시스템을 보정하십시오. 이를 위해 두 가지 핵심 파라미터를 결정해야 합니다. 공기 중 열 요동법을 이용한 캔틸레버 용수철 상수와, 포토다이오드 출력 신호를 실제 캔틸레버 굴곡 거리로 변환하는 데 사용되는 파라미터인 캔틸레버 굴곡 감도입니다.깨끗한 유리 슬라이드 위의 PBS에서 표준 강제 변위 곡선을 얻어 굴곡 민감도를 보정합니다. 그런 다음, 강제 변위 곡선 측정 시 해당 곡선의 기울기를 계산합니다. AFM 팁을 단일 지점에서 시료 표면을 향해 확장 및 후퇴시키며, 팁 변위 delta Z의 함수로서 캔틸레버의 굴곡 delta D를 모니터링합니다. 스프링 상수가 0.06 N/m인 FM 프로브를 사용하여, 직경 5 µm의 실리케이트 구형 팁이 달린 질화 실리콘 삼각형 캔틸레버를 사용할 것을 권장합니다.우리는 100에서 50,000 pascals 범위의 전단 탄성률을 갖는 연성 재료의 기계적 특성을 분석하였습니다. 조직지로 샘플 커버 슬립의 바닥면을 닦아낸 후, 진공 그리스를 사용하여 이를 표준 유리 슬라이드에 고정하십시오. 유리 슬라이드를 AFM 샘플 스테이지에 장착하고 조직 위에 상온의 PBS 500 microliters를 덮으십시오.그 다음 샘플 위에 AFM 스캐닝 헤드를 배치합니다. 접안렌즈를 통해 관찰하여 AFM 팁이 시야 중심에 오도록 현미경 샘플 스테이지를 조정합니다. AFM 샘플 스테이지를 이동시켜 조직 내에서 관심 영역을 선택합니다.그 후 CCD 카메라 뷰로 전환하여 조직의 위상차 이미지 또는 원하는 형광 이미지를 기록합니다. AFM 팁을 천천히 아래로 이동시켜 샘플에 정확히 접촉하도록 합니다. 연성 샘플의 AFM 미세 압입 특성 분석 시에는 국소 변형이 크게 일어나는 것을 방지하기 위해 압입 깊이를 작게 설정해야 하며, 그렇지 않으면 탄성 계수 계산에 사용되는 Hertz 모델이 무효화될 수 있습니다. 큰 변형을 방지하기 위해 캔틸레버의 최대 굴곡(deflection)을 500 nanometers로 설정하여 트리거 모드에서 압입을 수행하십시오.이 편향 제한은 최대 압입력을 30 nano newtons 미만으로 억제합니다. 압입 속도는 연성 시료의 점탄성보다는 탄성 특성을 탐색할 수 있도록 충분히 느리게 선택해야 합니다. 관심 영역의 단일 측정을 위한 폐 조직의 경우, 2에서 20 micrometers per second의 속도 범위를 선택하십시오.A FM 프로브를 관심 지점으로 이동시키고 단일 압입을 수행하여 표준 힘-변위 곡선을 수집합니다. 프로브는 Z 방향으로만 이동합니다. 관심 영역의 자동 매핑을 위해 포스 맵 모드로 전환하고, 선택한 영역 내의 스캔 크기와 샘플링 지점을 선택하십시오.AFM 팁이 압입 동작 사이에 시료 표면을 가로질러 래스터 스캔하며, 정의된 시료 그리드 내의 각 지점에서 개별 힘-변위 곡선을 수집합니다. 20 $\mu\text{m/s}$의 압입 속도로 $80\mu\text{m} \times 80\mu\text{m}$ 영역을 매핑하는 데 $16 \times 16$ 시료 그리드를 사용하는 것이 실용적임을 확인했으며, 이는 약 10분 만에 완료될 수 있습니다. 영률을 계산하려면, 여기에서 보여주는 것과 같이 최소제곱 비선형 곡선 피팅을 사용하여 힘-변위 곡선을 Hertz 구형 압입 모델에 맞춥니다. 여기서 $F = K_c \cdot \Delta D$는 캔틸레버를 굽히는 힘입니다.K sub C는 캔틸레버 스프링 상수를 나타냅니다. R은 구형 팁의 반경이며, delta는 delta Z에서 delta D를 뺀 값으로 압입 깊이를 의미하며, new는 시료의 푸아송 비로 폐 조직의 경우 0.4입니다. 피팅의 품질을 평가하기 위해 비선형 곡선 피팅 과정 중 데이터와 피팅 값 사이의 차이의 제곱합인 SSR 값을 계산합니다.SSR 값이 큰 불량 곡선의 데이터를 폐기하여 신뢰할 수 없거나 해석 불가능한 측정값을 제거하십시오. 필요한 경우, 탄성 계수(elastic modulus) 또는 E를 전단 계수(shear modulus)로 변환하십시오. 이때 E = 2(1 + ν)G 관계식을 사용합니다. 포스 맵 모드에서 수집된 강성의 공간적 패턴을 시각화하려면, 예를 들어 80 µm x 80 µm 영역을 커버하는 16 x 16 그리드에 계수 데이터와 컨투어 맵을 플로팅하십시오.방대한 양의 힘 곡선 데이터를 처리하기 위해, 힘-변위 곡선을 자동으로 피팅하여 탄성 계수를 추출하거나 컨투어 맵 또는 ELA 그래프를 작성하는 맞춤형 알고리즘을 작성할 수 있습니다. 앞서 설명한 것과 동일한 절차와 파라미터를 사용하였을 때, 이 수치는 조직이 적절하게 절단되고 염색되었음을 보여줍니다. 고정이나 투과 과정 없이 기저막 성분인 laminin에 대한 면역형광 염색으로 관찰한 결과, 폐 실질의 폐포 미세구조가 잘 보존되어 있습니다.이 패널들은 콜라겐에 대한 면역형광 염색 결과를 보여주며, 하나는 PBS로 처리한 쥐에서, 다른 하나는 섬유화를 유도하기 위해 블레오마이신을 처리한 쥐에서 채취한 고정되지 않은 신선한 폐 조직입니다. 동일한 힘을 가했을 때 FM 미세 압입(micro indentation)을 통해 얻은 샘플-변위 곡선이 여기에 제시되어 있습니다. AFM 팁이 부드러운 영역에서는 큰 압입을 생성하여 파란색으로 표시된 상대적으로 완만한 힘-변위 곡선이 나타나는 반면, 더 단단한 영역에서는 작은 압입과 함께 빨간색으로 표시된 가파른 힘-변위 곡선이 나타납니다.각각의 압입 후에 깨끗한 힘 곡선을 얻으려면, 다음 압입 전에 AFM 팁을 시료 표면에서 완전히 후퇴시켜 접촉이 없는 상태로 만들어야 합니다. 이러한 무접촉 상태는 캔틸레버 변위 없이 팁이 이동하는 곡선의 평탄한 영역에 해당합니다. 이 그림은 평탄한 영역이 없는 전형적인 잘못된 곡선을 보여주는데, 이는 연성 시료가 팁에 달라붙는 경우처럼 팁이 시료 표면에서 완전히 후퇴하지 않았을 때 발생하며, 팁이 연성 시료에 완전히 갇힌 경우 접촉점을 결정하는 것이 불가능해집니다.곡선은 뚜렷한 굴곡 없이 약간의 노이즈만 있는 형태로 나타날 수 있습니다. 이 그림은 강성(stiffness)을 보여줍니다. 강제 변위 곡선에서 추출된 데이터가 강성 맵으로 공간적으로 표시되었으며, 이를 ELAs graft라고 합니다. 강성에 따라 색상이 변하는 ELAs graft는 정상 폐 실질과 섬유화된 폐 실질의 조직 강성 범위 및 분포에서 현저한 차이를 보이며, 특히 섬유화된 폐 샘플 내에서 강성의 큰 공간적 변동을 보여줍니다.이 영상을 시청한 후, 원자간력 현미경(Atomic Force microscopy)을 사용하여 신선한 폐 조직의 국소 탄성 특성을 직접 측정함으로써 폐 실질의 국소적 기계적 환경을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Canovic, E. P., et al. 원자력 현미경, 충격 압흔 및 유변 물성 측정을 사용하여 뇌 조직의 다중 스케일 기계적 특성을 특성화합니다. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 구형 프로브가 있는 캔틸레버가 조직과 상호 작용하고 가해진 힘에 의해 구부러지는 뇌 조직의 점탄성 특성을 측정하기 위해 원자력 현미경(AFM)을 사용하는 방법을 보여줍니다. 검출기로 편향된 레이저 빔은 캔틸레버를 추적하여 압흔 깊이와 힘 완화를 측정하여 조직의 기계적 특성을 특성화할 수 있습니다.

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이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

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여기에 제시된 Conpokal 기술의 프로토콜은 공초점 및 원자력 현미경 검사를 단일 계측기 플랫폼으로 결합합니다. Conpokal은 살아있는 생물학 견본의 동시 공초점 화상 진찰 및 기계적인 특성에 가까운 동일 세포, 동일 지구를 제공합니다.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

원자력 현미경(AFM) 프로브 팁이 샘플 표면에 가하는 접촉 면적과 힘을 정량화하면 나노 크기의 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 탄성 계수 또는 기타 나노기계적 특성을 측정하기 위해 연질 및 경질 샘플의 공기 또는 유체에서 AFM 캔틸레버 기반 나노인덴테이션을 구현하는 모범 사례에 대해 설명합니다.

원자력 현미경 캔틸레버 기반 나노인덴테이션: 공기 및 유체의 나노 스케일에서 기계적 특성 측정

우리는 비브라톰과 아가로스 포매된 폐 조직을 활용하여 폐 절편을 생성하는 조직 처리 기술을 개발하여 폐 구조의 고해상도 이미지를 획득할 수 있습니다. 특정 폐 구조 마커를 사용하여 공간 단백질 발현을 관찰하기 위해 면역형광 염색을 사용했습니다.

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

이 프로토콜은 쥐 폐 조직의 냉동 절편을 준비하고, 원자력 현미경 힘 매핑 실험을 수행하고, 데이터를 분석하여 천연 쥐 폐 기저막의 Young's modulus를 결정하는 방법을 시각화합니다.

원자력 현미경 도출된 힘 맵에서 토착 쥐 폐 기저막의 Young's Modulus 추출

배우세요 원자력 현미경 미세압입 기술을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성을 측정하는 방법을. 정상 및 섬유화 폐 조직 간 강성 차이를 고해상도로 분석하여 질병 기전을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

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