암시야 현미경을 사용한 항체 접합 나노입자 기반 정량화: 체액에서 특정 엑소좀을 캡처하고 정량화하는 절차

엑소좀은 세포에 의해 세포외 공간으로 분비되는 작은 막으로 둘러싸인 구조입니다. 엑소좀은 생체액에 풍부하게 존재합니다.

체액에서 특정 엑소좀을 식별하고 포획하려면 먼저 멀티웰 면역분석 슬라이드를 촬영하십시오. 이 슬라이드는 항원 역할을 하고 특정 항체에 결합하는 단백질로 기능화됩니다.

슬라이드에 원하는 1차 항체 용액을 보충하고 배양합니다. 이 항체는 슬라이드 표면의 사전 코팅된 항원에 결합합니다.

나머지 용액을 흡인하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 이제 유리 항원을 차단하는 차단 완충액을 추가하여 엑소좀의 비특이적 결합을 방지합니다.

그런 다음 차단 완충액을 제거하고 혈청 현탁액을 포함하는 엑소좀을 슬라이드에 로드하고 배양합니다. 이를 통해 표적 특이적 엑소좀이 포획된 1차 항체에 독점적으로 결합할 수 있습니다.

다음으로, 금 나노입자 접합 2차 항체의 현탁액을 슬라이드 표면에 로드합니다. 이 항체는 사전 결합된 엑소좀에 부착되어 검출 복합체를 형성합니다.

마지막으로 피펫을 사용하여 결합되지 않은 2차 항체를 폐기합니다. 암시야 현미경으로 슬라이드를 시각화합니다. 엑소좀 표면에 존재하는 금 나노입자는 빛을 산란시켜 어두운 배경에 밝은 점으로 나타납니다.

슬라이드 준비를 시작하려면 원하는 엑소좀 포획 항체를 PBS에서 밀리리터당 0.025밀리그램으로 희석합니다. 광학 등급 유리로 뒷받침된 단백질 A/G 처리 슬라이드의 각 웰에 용액 1마이크로리터를 피펫팅합니다. 그런 다음 슬라이드를 가습 상자로 옮겨 배양 중에 우물이 마르지 않도록 합니다.

슬라이드를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 포획 항체를 고정시킵니다. 그런 다음 나머지 용액을 흡인하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 1마이크로리터의 PBS를 3회 추가하고 흡인하여 웰을 세척합니다. 다음으로, 각 웰에 1마이크로리터의 PBS 기반 차단 완충액을 빠르게 로드하고 슬라이드를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.

약 15개의 샘플을 실행할 때 차단제의 증발을 방지하기 위해 단일 채널 피펫을 사용하여 5분 이내에 120개의 웰에 작업 완충액을 로드해야 합니다.

슬라이드 차단 중에 항체 접합 금 나노로드 용액 준비를 시작합니다. 차단이 끝나기 약 30분 전에 실온 수조에서 혈장 또는 혈청 샘플을 빠르게 해동합니다. 현탁액이 균질한지 확인하기 위해 해동된 샘플을 30초 동안 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 샘플을 500 x g에서 15분 동안 원심분