양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

이 방법의 전반적인 목표는 투과 전자 현미경의 초구조적 형태와 형광 면역세포화학적 정보를 단일 이미지에 결합하여 상관광 및 전자 현미경 또는 CLEM 데이터를 얻는 것입니다. 이 방법은 면역세포화학 및 병리학 분야의 주요 질문, 예를 들어 어떤 세포 내 구조가 관련된 특정 관심 단백질과 관련이 있는지와 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 양자점 나노 입자 프로브를 사용하여 표적 단백질의 실시간 현미경 신호와 전자 현미경 구조 국소화를 모두 얻는다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 인간 체성 스타티노마 종양 조직을 고정, 매립 및 절편화한 후, 2.0ml의 아세톤이 들어 있는 5ml 병에 20cm의 투명 접착 테이프를 넣고 10분 동안 그대로 두어 단면 접착 용액을 준비합니다. 테이프를 제거하고 니켈 그리드를 용액에 담근 다음 그리드를 제거하고 자연 건조시킵니다. 건조되면 그리드의 둔한 면을 사용하여 매우 얇은 부분을 선택합니다.

선택한 레진 제형에 대해 올바른 에칭 시간을 설정하는 것이 중요합니다. 이 제형에는 30분이 적합하지만 더 단단하거나 부드러운 제형의 경우 다시 계산해야 할 수 있습니다. 증류수에 1ml의 신선한 포화 메타주산나트륨 에칭 용액을 준비하고 깨끗한 실험실 필름 표면에 용액 방울을 놓습니다.

섹션이 있는 완전히 건조한 그리드를 액적 위에 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 그리드를 증류수 방울에 60초 동안 옮겨 씻어냅니다. 깨끗한 실험실 필름 표면에서 항체 및 양자점 또는 QD 라벨링을 수행하기 위해 0.05 몰 글리센 및 PBS를 피펫으로 떨어뜨립니다.

물방울에 그리드를 놓고 10분 동안 배양하여 섹션의 잔류 알데히드를 차단합니다. 알데히드 블록을 제거하려면 그리드의 가장자리를 짧게 닦아냅니다. 그런 다음 PBS에 있는 1%의 정상 염소 혈청(NGS)과 1%의 BSAC가 담긴 방울에 그리드를 10분 동안 놓습니다.

890마이크로리터의 PBS에 10마이크로리터의 NGS와 100마이크로리터의 BSAC를 첨가하여 1밀리리터의 차단 용액을 준비합니다. 그런 다음 10분 동안 항체 희석제 한 방울에 올려 절편을 컨디셔닝합니다. 다음으로, 항체 희석제를 사용하여 항-소마토스타틴 다클론 항체를 1에서 10으로 희석하고 용액의 방울에 그리드를 놓습니다.

실온의 습한 챔버에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 그리드의 가장자리를 블롯트로 만들어 항체 시약을 제거합니다. 그런 다음 항체 희석제를 사용하여 각 5분씩 두 번씩 섹션을 세척합니다.

2차 항체를 1에서 10으로 희석하고 방울을 준비한 후 방울의 그리드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 항체 용액을 제거하고 섹션을 두 번 씻습니다. streptavidin을 jugated QDs 1에서 10까지 희석하고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 용액 방울에 샘플을 배양합니다.

그런 다음 항체 희석제를 사용하여 그리드를 두 번, 매번 5분 동안 세척하고 그리드의 가장자리를 닦습니다. 다음으로, 가장자리를 블로트하여 건조시키기 전에 증류수로 그리드를 2분 동안 세척합니다. 면역 염색된 그리드 섹션을 유리 슬라이드의 물방울에 놓고 유리 커버 슬립을 사용하여 덮습니다.

형광 현미경 검사를 수행하려면 다음과 같은 특성을 가진 필터 큐브를 삽입하고 365나노미터 LED 조명을 사용하십시오. 면역 염색된 부분을 면역형광 현미경 스테이지에 놓습니다. 광학 현미경을 사용하여 라벨링 패턴, 비특이적 라벨링 수준을 평가하고 음성 대조군이 명확한지 확인합니다.

다음으로, 그리드 막대와 관련된 ROI를 식별합니다. 그런 다음 풀 컬러 디지털 카메라를 FL 자동 색상으로 설정하고 화이트 밸런스를 3, 200 K.Set 0.45와 1.00 사이의 감마 설정으로 자동 노출 모드로 카메라를 설정하여 이미지의 모양을 최적화하고 아날로그 게인을 1 X로 설정합니다.ZEN Two Light 소프트웨어 그래픽 인터페이스에서 카메라 아이콘을 클릭하여 라이브합니다. 그런 다음 이미지에 초점을 맞추고 ZEN Two Light 소프트웨어 그래픽 인터페이스에서 스냅을 클릭하여 이미지를 프레임 저장소에 캡처합니다.

압축 및 픽셀화를 방지하기 위해 이미지를 tf 파일로 저장하십시오. 그리드 막대 또는 기타 중요한 조직 랜드마크와 관련된 ROI의 위치를 보여주는 인쇄물을 준비합니다. 그런 다음 슬라이드에서 그리드를 제거하고 증류수로 씻고 가장자리를 부드럽게 닦아내어 말리십시오.

투과 전자 현미경을 수행하려면 100킬로볼트의 가속 전압을 사용하여 검사를 위해 그리드를 현미경으로 전송하십시오. 약 1, 400X의 저배율로 시작하여 그리드를 탐색하고 광학 현미경으로 발견된 ROI를 찾습니다. 70, 000X 배율 이상에서 개별 QD를 관찰합니다.

그들은 적당한 전자 밀도를 가진 불규칙한 결정 구조로 나타날 것입니다. 그런 다음, 이미징 소프트웨어의 그래픽 인터페이스에서 흑백 1, 392 x 1, 040 픽셀 센서와 디지털 카메라를 사용하여 카메라 아이콘을 클릭하여 이미지를 획득합니다. 카메라 아이콘을 꺼짐 위치로 이동하여 프레임 저장소에 이미지를 저장합니다.

CLEM 이미징을 수행하려면 광학 현미경 이미징의 인쇄물을 사용하여 TEM별로 해당 ROI를 찾습니다. 조직 아키텍처 기능은 단면 주위를 탐색하는 데 유용합니다. TEM에 의한 해당 ROI의 이미지를 캡처합니다.

다음으로, CLEM 이미지를 준비하려면 TEM 이미지의 방향이 올바르고 광학 현미경 이미지와 동일한 크기 및 해상도(이 경우 인치당 300픽셀)로 확대되었는지 확인합니다. 광학 현미경 이미지 캔버스의 크기를 두 배로 확장합니다. 그런 다음 TEM 이미지를 복사하여 형광 이미지 옆에 붙여넣습니다.

Photoshop CS2에서 형광 오버레이를 만들려면 직사각형 선택 윤곽 도구를 클릭하고 형광 이미지를 선택한 다음 복제 레이어를 만듭니다. 레이어 스타일 혼합 옵션을 30%에서 40% 투명도로 조정합니다. 그런 다음 이동 도구를 클릭하고 형광 오버레이 레이어를 해당 TEM 이미지 위로 드래그하고 이미지를 정렬합니다.

이미지를 정렬한 후 이미지를 평면화하여 최종 오버레이를 만듭니다. 그런 다음 직사각형 선택 윤곽 도구를 사용하여 새 오버레이 이미지를 선택하고 새 캔버스에 복사합니다. 마지막으로 이미지를 tf 파일로 저장합니다.

이 형광 현미경 이미지에서, 개별 소마토스타티노마 종양 세포는 풍부한 분비 과립을 포함하고 있으며, 소마토스타틴 호르몬에 대해 양성 표지되었습니다. 핵은 어두운 구멍으로 나타났고 저배율에서는 세포질에서 매우 강렬한 과립 주황색 QD 형광이 관찰되었습니다. 광학 현미경으로 선택한 ROI는 여기에 표시된 대로 20X 광학 현미경 이미지를 참조하여 TEM을 사용하여 인식되고 이미지화되었습니다.

더 높은 배율에서 세포는 세포질 과립에서 밝은 형광과 강렬한 QD 표지를 보여줍니다. 이 예에서와 같이 TEM 이미지에 형광 데이터를 오버레이하면 강력한 양성 표지가 소포 제한 멤브레인 내에 적당히 전자 밀도가 높은 물질을 포함하는 과립에 해당함을 시사합니다. 마지막으로, 여기에서 더 높은 배율에서 볼 수 있듯이 적당히 전자 밀도가 높은 과립은 강렬한 QD 나노결정 면역 표지를 보여주었습니다.

이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 8시간 안에 완료할 수 있습니다. 절차를 시도하는 동안 가장자리만 조심스럽게 그리드를 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그리드를 선택하는 동안 섹션을 터치하면 그리드에서 섹션이 분리될 수 있습니다.

이 절차에 따라 관심 단백질이 다른 단백질과 공동 국소화되는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 다중 면역 표지와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 병리학 분야의 연구자들이 전자 현미경을 위한 아카이브 인체 조직 과정에서 단백질 국소화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 형광 현미경의 면역세포화학 정보와 투과 전자 현미경의 초미세 구조를 결합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

사산화오스뮴으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 보호 장비 착용, 흄 후드 작업 및 적절한 폐기물 처리와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.