양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

이 방법의 전반적인 목표는 단일 이미지 내에서 형광 면역세포화학 정보와 투과 전자 현미경의 초미세 구조 형태학을 결합하여 상관 광학 및 전자 현미경, 즉 CLEM 데이터를 얻는 것입니다. 이 방법은 특정 관심 단백질이 어떤 세포 내 구조와 연관되어 있는지와 같이 면역세포화학 및 병리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 양자점 나노입자 프로브를 사용하여 표적 단백질의 생체 현미경 신호와 전자 현미경 구조 국소화 정보를 모두 얻을 수 있다는 점입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 인간 소마토스타티노마(somatostatinoma) 종양 조직을 고정, 포매 및 절편 제작한 후, 2.0 mL의 아세톤이 담긴 5 mL 병에 20 cm 길이의 투명 접착 테이프를 넣어 절편 접착 용액을 준비하고 10분 동안 그대로 둡니다. 테이프를 꺼내고 니켈 그리드를 용액에 담갔다가 꺼내어 공기 중에서 건조시킵니다. 건조가 완료되면 그리드의 뭉툭한 면을 사용하여 초박절편을 채취합니다.

선택한 수지 제형에 맞는 정확한 식각 시간을 설정하는 것이 매우 중요합니다. 본 제형의 경우 30분이 적당하지만, 더 단단하거나 부드러운 제형의 경우에는 시간을 다시 산출해야 할 수도 있습니다. 증류수로 신선한 포화 메타요오드산나트륨(sodium metaperiodate) 식각 용액 1 mL를 준비하고, 깨끗한 실험용 필름 표면에 이 용액을 한 방울씩 떨어뜨립니다.

섹션이 포함된 완전히 건조된 그리드를 액적 위에 놓고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 그리드를 증류수 액적에 60초 동안 옮겨 세척합니다. 깨끗한 실험용 필름 표면에서 항체 및 양자점(quantum dot, QD) 라벨링을 수행하려면, 0.05 molar glycene과 PBS를 피펫으로 분주합니다.

그리드를 액적 위에 놓고 10분 동안 배양하여 섹션에 남아 있는 알데하이드를 블로킹합니다. 알데하이드 블록을 제거하기 위해 그리드 가장자리를 짧게 블롯팅합니다. 그런 다음 그리드를 1% normal goat serum(NGS) 및 1% BSAC가 포함된 PBS 액적 위에 10분 동안 놓아 둡니다.

PBS 890 µL에 NGS 10 µL와 BSAC 100 µL를 첨가하여 블로킹 용액 1 mL를 준비합니다. 그다음, 절편을 항체 희석액 한 방울 위에 10분 동안 올려두어 컨디셔닝합니다. 이어서, 항체 희석액을 사용하여 anti-somatostatin 다클론 항체를 1:10 비율로 희석한 후, 그리드를 해당 용액 방울 위에 올립니다.

습윤 챔버에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 그리드의 가장자리를 블로팅하여 항체 시약을 제거합니다. 그다음 항체 희석액을 사용하여 섹션을 5분씩 2회 세척합니다.

2차 항체를 1:10으로 희석하고 방울을 준비한 후, 그리드를 방울 위에 올려 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 다음, 항체 용액을 제거하고 섹션을 2회 세척합니다. streptavidin이 접합된 QD를 1:10으로 희석하고, 샘플을 해당 용액 방울 위에서 암소, 실온 상태로 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 항체 희석액을 사용하여 그리드를 5분씩 2회 세척하고, 그리드의 가장자리를 블로팅합니다. 다음으로, 증류수로 그리드를 2분간 세척한 후 가장자리를 블로팅하여 건조시킵니다. 면역 염색된 그리드 섹션을 유리 슬라이드 위의 물 한 방울에 놓고, 유리 커버슬립으로 덮습니다.

형광 광학 현미경 관찰을 수행하려면 다음 특성을 가진 필터 큐브를 삽입하고 365 nanometer LED 조명을 사용하십시오. 면역 염색된 절편을 면역 형광 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 광학 현미경을 사용하여 라벨링 패턴과 비특이적 라벨링 수준을 평가하고, 음성 대조군이 깨끗한지 확인하십시오.

다음으로, 그리드 바와 관련하여 관심 영역(ROI)을 지정합니다. 그런 다음 풀 컬러 디지털 카메라를 FL 자동 색상으로 설정하고 화이트 밸런스를 3,200 K로 설정합니다. 이미지의 외관을 최적화하기 위해 카메라를 자동 노출 모드로 설정하고 감마 설정을 0.45에서 1.00 사이로 지정하며, 아날로그 게인은 1X로 설정합니다. ZEN Two Light 소프트웨어 그래픽 인터페이스에서 카메라 아이콘을 클릭하여 라이브 상태로 전환합니다. 그 후 이미지의 초점을 맞추고 ZEN Two Light 소프트웨어 그래픽 인터페이스에서 Snap을 클릭하여 이미지를 프레임 저장소에 캡처합니다.

압축과 픽셀화를 방지하기 위해 이미지를 tf 파일로 저장하십시오. 그리드 바 또는 기타 주요 조직 랜드마크와 관련하여 ROI의 위치를 보여주는 출력물을 준비하십시오. 그 다음 슬라이드에서 그리드를 제거하고, 증류수로 세척한 후 가장자리를 조심스럽게 닦아 건조시키십시오.

투과전자현미경 관찰을 수행하려면, 가속 전압 100 kilovolts를 사용하여 그리드를 현미경으로 옮겨 검사하십시오. 약 1,400X의 저배율로 시작하여 그리드를 탐색하고 광학 현미경으로 확인한 ROI를 찾으십시오. 70,000X 이상의 배율에서 개별 QD를 관찰하십시오.

이들은 중간 정도의 전자 밀도를 가진 불규칙한 결정 구조로 나타날 것입니다. 그다음, 이미징 소프트웨어의 그래픽 인터페이스에서 1,392 x 1,040 픽셀의 단색 센서가 장착된 디지털 카메라를 사용하여, 카메라 아이콘을 클릭해 켜고 이미지를 획득하십시오. 카메라 아이콘을 끔 위치로 이동하여 이미지를 프레임 저장소에 저장하십시오.

CLEM 이미징을 수행하려면, 광학 현미경 이미징 출력물을 사용하여 TEM으로 해당 ROI를 찾으십시오. 조직의 구조적 특징은 절편 내에서 위치를 찾는 데 유용합니다. TEM을 통해 해당 ROI의 이미지를 캡처하십시오.

다음으로 CLEM 이미지를 준비하려면, TEM 이미지의 방향을 올바르게 맞추고 광학 현미경 이미지와 동일한 크기 및 해상도(이 경우 300 pixels per inch)로 확대하십시오. 광학 현미경 이미지 캔버스의 크기를 두 배로 확장합니다. 그런 다음 TEM 이미지를 형광 이미지 옆에 복사하여 붙여넣으십시오.

Photoshop CS2에서 형광 오버레이를 생성하려면, 사각형 선택 도구를 클릭하고 형광 이미지를 선택한 다음, 해당 이미지의 복제 레이어를 생성합니다. 레이어 스타일의 혼합 옵션을 30~40% 투명도로 조정합니다. 그다음 이동 도구를 클릭하고 형광 오버레이 레이어를 해당 TEM 이미지 위로 드래그하여 이미지들을 정렬합니다.

이미지 정렬 후, 이미지를 평탄화하여 최종 오버레이를 생성합니다. 그런 다음 사각형 선택 도구(rectangular marquee tool)를 사용하여 새로운 오버레이 이미지를 선택하고 이를 새 캔버스로 복사합니다. 마지막으로, 이미지를 tf 파일로 저장합니다.

이 형광 현미경 이미지에서, 개별 소마토스타틴종(somatostatinoma) 종양 세포들은 풍부한 분비 과립을 포함하고 있으며 소마토스타틴 호르몬에 대해 양성으로 표지되었습니다. 핵은 어두운 구멍 형태로 나타났으며, 저배율에서 세포질 내에 강도가 다양하게 나타나는 과립형 오렌지색 QD 형광이 관찰되었습니다. 광학 현미경으로 선택한 ROI는 여기에 표시된 것처럼 20배 광학 현미경 이미지를 참조하여 인식되었으며 TEM을 통해 이미징되었습니다.

더 높은 배율에서, 세포는 세포질 과립에서 밝은 형광과 강한 QD 라벨링을 보여줍니다. 이 예시와 같이 TEM 이미지 위에 형광 데이터를 중첩시키면, 강한 양성 라벨링이 소포 제한막 내에 중간 정도의 전자 밀도를 가진 물질을 포함하는 과립에 해당함을 알 수 있습니다. 마지막으로, 여기의 고배율 사진에서 볼 수 있듯이, 중간 정도의 전자 밀도를 가진 과립들이 강한 QD 나노결정 면역 라벨링을 나타냈습니다.

이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 절차를 진행하는 동안 그리드의 가장자리 부분만 잡고 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 그리드를 집어 올릴 때 섹션을 건드리면 그리드에서 섹션이 떨어질 수 있습니다.

이 절차에 따라, 관심 단백질이 다른 단백질과 공동 국소화되는지 등 추가적인 질문에 답하기 위해 다중 면역 표지법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 병리학 분야의 연구자들은 전자 현미경용으로 처리된 보관 인간 조직에서 단백질 국소화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 형광 광학 현미경의 면역세포화학적 정보와 투과 전자 현미경의 초미세 구조를 결합하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

사산화오스뮴을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안 보호 장구 착용, 흄 후드 내 작업 및 적절한 폐기물 처리와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.