Name: 양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 학습하세요 양자점 나노입자를 활용한 상관광-전자현미경법으로 인간 종양 조직에서 단백질의 아세포내 위치를 정밀 분석하는 방법을. 이 기술은 형광 면역세포화학과 초미세구조 영상을 통합하여 병리학 연구에 활용됩니다.

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저자는 Xiao Juan Wu(면역조직화학 실험실)와 호주 뉴사우스웨일스주 리버풀에 위치한 NSW Health Pathology의 Sydney South West Pathology Service(SSWPS) 해부병리학과의 지원에 감사를 표합니다.

1. 조직 해부 및 고정 <ol><li> 조직의 해부 <ol><li> 외과 적 절제 종양 생검 검체 또는 조직에서 조직 조각을 해부. 참고 :이 연구에 사용 된 조직이 일상적으로 포르말린에 고정하지만 신선한 조직에도 적합하다. 우리 일상 조직 학적 염색 및 항 - 소마토스타틴 면역은 (미도시) 이후 소마토스타틴 종양을 포함하는 해부학 적 병리학 자에 의해 확인되고보고 영역을 선택 하였다. </li><li> 약 1.0 mm 3 이하 더 큰 조직 조각을 사용합니다. </li></ol></li><li> Cacodylate 버퍼 준비 <ol><li> 나트륨 cacodylate 21.4 g을 첨가하여 스톡 완충 용액 (1 M)을 준비한다 (자재 목록 참조) 및 90 ml의 증류수 후 100 ㎖의 최종 부피로 용액을 토핑 3.0 ml의 % 1 염화칼슘 용액. 솔루션을 저어 결정 시약이 완전히 용해되도록 밤새 정치를 둡니다. </li><l난&gt; 표시등 스트립 pH를 확인 후, 물 170 ml의 원액 20 ㎖를 첨가하여 솔루션을 작업 버퍼를 준비합니다. 3 % HCl 4 방울 - (3)을 첨가하여 7.4로 pH를 조정한다. 0.1 M. 최종 몰 농도로 200 ml의 최종 부피로 용액을 최고 </li></ol></li><li> 정착액 준비 및 사용 <ol><li> 나트륨 cacodylate 원액 (1 M) 20 ㎖에 50 % 글루 타르 알데히드 용액 한 10 ㎖의 앰플을 추가합니다. 190 ml의 증류수와 최고. pH를 확인하고 1 추가하여 7.4로 조정 - 3 % 염산 (HCL) 필요한 경우 4 방울을. </li><li> 200 ml의 최종 부피를 증류수와 상단. </li><li> 유리 샘플 튜브에서 4 ℃로 24 시간 동안 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 pH 7.4에서 2.5 % 글루 타르 알데히드를 함유하는 고정액으로 조직을 담근다. 일주 후 사용되지 않는 정착액을 폐기하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 조직 처리 및 포함 <ol><li> 오스뮴 테트xide 염색 <ol><li> 정착이 완료되면, 그 다음 20 분 동안 cacodylate 나트륨 완충액 (0.1 M)의 조직 몰입을 또 다른 20 분 동안 반복한다. </li><li> 최종 부피를 나트륨 cacodylate 버퍼 스톡 용액 (1 M)의 2.0 mL의 증류수 10.0 ml의 5 % OSO 4 원액 8.0 ㎖에 첨가하여 용액을 작업 2 % 수성 산화 오스뮴 (OSO 4)를 준비 20.0 ml의. </li><li> 버퍼는 그 다음 실온에서 4 시간 동안 pH 7.4의 4에 OSO 2 %의 조직 몰입 제거한다. 경사와 오소 네 솔루션을 준비 할 때주의! 항상 흄 후드에서 적절한 개인 보호 장비와 작업을 착용주의하십시오. </li></ol></li><li> 우라 닐 아세테이트 염색 <ol><li> 조직 osmication가 완료된 후 OSO 4 용액을 제거하고 10 분 동안 2 %의 아세트산 나트륨의 조직 몰입. 2 % 아세트산 나트륨 후 1 시간에 대해 2 % 우라 닐 아세테이트에서 몰입 삭제실온. </li></ol></li><li> 탈수 <ol><li> 등급 알코올을 통해 조직을 탈수. 10 분간 실온에서 20 분마다 100 %의 에탄올이 변화를 10 분, 95 % 에탄올을 10 분, 50 % 에탄올, 70 % 에탄올을 사용한다. </li><li> 30 분마다 100 % 아세톤이 변경을 수행합니다. </li></ol></li><li> 수지 함침 및 경화 <ol><li> 일회용 폴리에틸렌 컵에 저점도 에폭시 수지를 혼합한다. 비닐 사이클로 헥센 이산화탄소 (ERL 4221) 에폭시 모노머 10.0 g, 폴리 프로필렌 글리콜 디 글리시 딜 에테르 6g (DER 732) 및 노네 숙신산 무수물 (NSA)의 26.0 g을 추가합니다. 2 분 동안 나무 막대기를 사용하여 손으로 잘 저어. </li><li> 2- 디메틸 아미노 에탄올 (DMAE) 에폭시 가속기의 다섯 방울을 추가하고 2 분 동안 다시 저어. 완전히 DMAE 가속기를 추가하기 전에 ERL, DER 및 NSA 구성 요소를 혼합주의하십시오. </li><li> 수지 1 : 1과 100 % 아세톤으로 교체하여 조직의 수지 함침을 시작3 시간 동안 아세톤 1 수지 밤새 마지막으로 100 % 수지 : 아세톤 1 시간 후, (6)으로 대체. </li><li> 8mm의 micromoulds에 신선한 수지에 조직을 전송합니다. 70 O를 C 하룻밤에 치료. 수지는 강하고 경화 후 취성하지해야합니다. </li></ol></li></ol> 3. Ultramicrotomy <ol><li> 칼, 절단 매개 변수 및 섹션 두께 <ol><li> 을 Ultramicrotome에 semithin 다이아몬드 나이프를 놓고 500 nm의 두께로 조직에서 섹션을 잘라. </li><li> 나이프 에지 뒤에 물을 욕조에 섹션을 플로트. 유리 슬라이드에 섹션을 들고 C. O를 약 110 핫 플레이트를 사용하여 10 ~ 20 초 동안 그들을 건조 </li><li> 20 초 동안 나트륨에 톡 시드 용액으로 섹션을 에칭 한 후 100 % 에탄올 다음 증류수로 씻어 내십시오. 열판에 20 초 동안 1 %의 붕사 블루 2 % 메틸렌와 얼룩, 5 초 동안 핫 플레이트에 5 초 동안 수돗물을 실행하고 건조 씻어. 그리고 스테인레스n은 20 초 동안 열판에 다음 건조 5 초 동안 핫 플레이트에 1.5 %의 기본 푹신와. </li><li> 밝은 장광 현미경으로 검사하고, 종양 세포 및 ROI (region of interest)를 확인하여 단면에 존재한다. </li><li> 초박형 다이아몬드 나이프에 semithin 다이아몬드 칼을 변경하고 칼 제조업체에서 권장하는 올바른 칼 각도 및 절단 속도를 설정합니다. </li><li> 90 나노 미터 두께로 얇은 부분을 잘라. 수조에 떠있는 부분의 골드 착색을 준수하십시오. </li><li> 스트레치 섹션의 수 밀리미터 내의 여과지 1cm 2 조각에서 클로로포름 증기를 흔들어 섹션 평탄화. 수면에 접촉 클로로포름 적신 종이를 가지고 않도록주의. </li></ol></li><li> 얇은 섹션 그리드 실장 <ol><li> 섹션 adhesiv에 침지 된 300 메쉬 얇은 바 니켈 TEM 격자를 사용하여 물 표면에서 얇은 섹션을 들어 올려전자 솔루션입니다. 그리드의 무딘면에 섹션을 찾습니다. 그리드는 일측 및 타측에 연마 또는 광택면에 무딘 또는 무광택 표면을 갖는다. 더지지 필름이 필요하지 않습니다. 참고 :이 집게에 부착 그리드를 방지하기 위해 안티 - 자기 집게 이러한 그리드를 처리 할 필요가있다. </li><li> 아세톤 2.0 mL를 바이알 ㎖로 5에서 명확한 접착 테이프 20cm 배치하여 부 접착제를 준비한다. 캡과 병을 흔들어는, 접착제 솔루션을 떠나는 테이프를 제거 후 10 분 동안 서 보자. </li></ol></li></ol> 4. Immunolabeling <ol><li> 항원 폭로 <ol><li> 증류수 신선한 나트륨 포화 메타과 요오드 산 에칭 용액 1 ㎖를 제조하고 즉시 사용. 깨끗한 labfilm 표면에 에칭 용액의 장소 방울. </li><li> 실온에서 30 분 동안 내려 메타과 요오드 산 나트륨 용액 방울이 부분으로 완전히 건조 그리드를 놓는다. 증류수 데서에 그리드로 이동세탁 60 초 동안 plets. </li></ol></li><li> 항체 배양 및 QD 프로브 라벨링 <ol><li> 깨끗한 파라 필름 표면에 배치 솔루션의 방울의 모든 배양 및 라벨링을 수행합니다. </li><li> 섹션에 잔류 알데히드를 차단하는 10 분간 PBS에서 0.05 M 글리신의 물방울에 그리드를 배치합니다. 간단히 그리드의 가장자리를 모래 바닥하여 알데히드 블록을 제거합니다. </li><li> 10 분 동안 PBS에 1 % 정상 염소 혈청 (NGS) 및 1 % BSAC (10 %)의 방울에 그리드를 배치합니다. 1000 μL의 최종 용적을 수득 NGS 및 10 ㎕의 PBS 중 890 ㎕의 BSAC에 100 ㎕를 첨가하여 차단 용액을 제조 하였다. </li><li> 10 분 동안 항체 희석제의 물방울에 배치하여 섹션을 조건입니다. </li><li> 항체 희석은 3.47 g / L의 농도를주는 1시 10분 희석 된 항 - 소마토스타틴 폴리 클로 날 항체를 사용하여 immunolabeling 배양을 수행한다. 참고 : 항체 배양이 객실 temperat에서 1 시간 동안 방울에 그리드를 배치하여 수행됩니다촉촉한 챔버에 URE. </li><li> 다음 2 × 5 분 동안 희석제에 섹션을 씻어 그리드의 가장자리를 모래 바닥으로 단계 4.2.5에서 항체 시약을 제거합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 1:10 희석 된 이차 항체 (바이오틴 화 된 염소 항 - 토끼 폴리 클로 날) 부화. 이차 항체 용액을 제거합니다. 2 × 5 분 희석제에 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 1:10으로 희석 된 스트렙 타비 딘 컨쥬 게이트 양자점 (585 ㎚)에서 부화. 배양 중에 노광을 줄이기 위해 알루미늄 호일로 커버. </li><li> 2 분 동안 신선한 증류수에 그리드를 씻으십시오. 그리드 건조의 가장자리를시킨다. </li></ol></li></ol> 5. 형광 빛 현미경 <ol><li> 광원 및 필터 큐브 <ol><li> 넓은 필드 형광 빛 현미경에 대한 365 nm의 발광 다이오드 (LED) 조명을 사용합니다. 다음과 같은 특성을 가진 필터 큐브를 삽입합니다 (예 G 365 nm의, BS FT (395) 및 EM LP 420 ㎚). 참고 :이 필터 큐브 w병의 모든 양자점의 발광 스펙트럼은 동일한 여기 파장에 따라 동시에 가시화 될 수 있도록 크기. </li></ol></li><li> 보기 및 이미지 섹션 <ol><li> 물 한 방울에 다운 유리 슬라이드에 면역 염색 그리드 섹션을 놓고 유리 커버 슬립 (두께 번호 1.5)으로 커버. 표지 패턴, 비 특​​정 라벨의 수준을 평가하기 위해 광학 현미경을 사용하는 음성 대조군이 라벨링 명확 확립. </li><li> 그리드 바 관련 투자 수익 (ROI)을 확인합니다. 파인더 그리드 대상 구조물의 좌표를 확립하는데 도움이 될 수있다. </li><li> &quot;FL 자동 컬러&quot;를 3,200K로 설정 &quot;화이트 밸런스&quot;에서 카메라 설정으로 풀 컬러 디지털 카메라를 사용하여 섹션에 긍정적 인 라벨의 이미지를 획득. 1 배에서 설정 한 이미지의 모양과 &quot;아날로그 게인&quot;을 최적화하기 위해 0.45와 1.00 사이에 &quot;감마&quot;설정으로 &quot;자동 노출&quot;모드에서 카메라를 사용합니다.&quot;라이브&quot;다음 이미지를 초점 프레임 스토어에 이미지를 캡처 &quot;스냅&quot;를 클릭하여 선이 라이트 소프트웨어 그래픽 인터페이스에서 카메라 아이콘을 클릭합니다. </li><li> 이 .tif가 압축 및 픽셀 레이션이 분명 해지고 방지하기 위해 파일로 이미지를 저장합니다. </li><li> 그리드 바 또는 다른 중요한 조직의 랜드 마크와 관련하여 투자 수익 (ROI)의 위치를​​ 나타내는 인쇄를 준비합니다. 이러한 인쇄는 후속 섹션의 이동 및 재 찾는 투과 전자 현미경 (TEM)에서의 ROI를 위해 유용 할 것이다. </li><li> 슬라이드에서 그리드를 제거 증류수에 씻어 부드럽게 가장자리가 건조시킨다. 참고 : 형광 이미지를 얻기 위해 지나치게 강한 조명을 사용하지 마십시오. 양자점의 광 안정성 몇 초까지의 영상 시간을 허용하지만, QD 신호의 담금질 물에 약 1 분 후 발생할 수있는 노출을 연장하지 않도록주의. QD이 섹션은 톨루엔과 탈수 표시 할 때 확장 또는 영구적 광 안정성 만 얻어지고,제조업체의 사양에 따라 커버 슬립 아래에 내장. 그러나,이 프로세스는 TEM에 의해 동일 구간의 상호 진단의 가능성을 배제한다. </li></ol></li></ol> 6. 투과 전자 현미경 <ol><li> TEM 설정 위보기 <ol><li> 100 kV로의 가속 전압을 사용하여 검사를 위해 TEM에 그리드를 전송합니다. 그리드 주위를 탐색하고 광학 현미경의 전망과 상관 로아를 찾기 위해 약 1,400X의 낮은 배율을 사용합니다. 50,000 배 주위 배율에서 양자점의보기 클러스터. </li><li> 개별 양자점 70,000X 확대에 이상을 준수하십시오. 보통 전자 밀도와 불규칙한 결정 구조와 양자점을 준수하십시오. </li></ol></li><li> 영상 <ol><li> TEM 영상을위한 디지털 카메라를 사용합니다. 흑백 1,392 X 1,040 픽셀 센서가 적합합니다. </li><li> MICR에 &quot;온&quot;에 &quot;카메라&quot;아이콘을 클릭하여 이미지를 수집다음 &quot;Off&quot;로 프레임 스토어에 이미지를 저장하려면 이미징 소프트웨어의 그래픽 인터페이스를 oscope. 주의 : 이러한 조작은 사용되는 현미경 시스템에 따라 달라질 것이다. 1.00의 &quot;감마&quot;설정과 자동 노출 모드에서 카메라를 사용합니다. </li><li> .tif 파일로 이미지를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 7. 클레멘 타인 이미징 <ol><li> TEM에 의한 형광 ROI 찾기 <ol><li> TEM에 의해 ROI를 해당 찾으려면 광학 현미경 이미지에서 인쇄를 사용합니다. 이러한 혈관 내강 구조로 조직 아키텍처 기능은 TEM을 사용하여 섹션 주변 탐색에 유용하다. </li><li> TEM에 의해 해당 ROI의 이미지를 캡처합니다. </li></ol></li><li> 클레멘 타인의 이미지 오버레이 <ol><li> TEM에 이미지가 제대로 광학 현미경 이미지로 지향되어 있는지 확인하고 각 양상에서 볼 수있는 동일한 구조가 같은 크기가되도록 각의 확대를 수정합니다. </li><li> 동양빛 현미경과 TEM 이미지를 먹었고, 그들이 나란히 또는 immunolabeled 로아의 미세 기능을 강조하는 오버레이로 표시됩니다. </li><li> 포토샵 CS2를 사용하여 오버레이 이미지를 만듭니다. 먼저, 저전력 TEM 화상과 동일한 배율로 형광 이미지를 확대. 두 이미지의 방향을 다음 하나의 캔버스에 나란히 그들에게 측면을 붙여 넣습니다. </li><li> 이미지를 평평하게. </li><li> 이 합성 이미지에서 형광 오버레이를 만듭니다. 은 &quot;사각형 선택 윤곽 도구&quot;를 클릭 형광 이미지를 선택하고 그것에서 중복 된 레이어를 만들 수 있습니다. </li><li> 40 % 투명도 - 30 &quot;옵션을 혼합 / 레이어 스타일의&quot;를 조정합니다. </li><li> 은 &quot;이동 도구&quot;를 클릭하고 해당 TEM 이미지를 통해 형광 오버레이 레이어를 드래그합니다. 이미지를 맞 춥니 다. </li><li> 정렬을 달성 한 후, 최종 합성 이미지를 생성하기 위해 층을 &quot;결합&quot;. </li><li> 새로운 오버레이 이미지 a를 선택하기 위해 &quot;사각형 선택 윤곽 도구&quot;를 사용차 새로운 캔버스에 복사합니다. .TIFF 파일로이 저장합니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 연구는 클레멘 타인의 연구를위한 범용 프로브로 양자점의 잠재적 인 유틸리티를 보여 주었다. 위드 광학 현미경으로 볼 수 있고 쉽게 TEM으로 관찰 할 때 사용하는 585 나노 양자점 나노 입자는 밝고 안정된 형광을 보였다. 본 저자 중 한 명으로 이전의 연구는 또한 초 고해상도 광학 현미경 (7)에 적합하도록 양자점을 보여 주었다. 이들의 광 안정성 확장 시청 기간과 긴 영상 노출에 특히 유용했다. 양자점은 크기가 다른 프로브는 동시에 동일한 여기 파장에 따라 다른 컬러 발광 스펙트럼을 가진 다중 면역을 위해 사용될 수있다. 양자점 충분한 원자량이 TEM에 의해 가시화 할 수 있지만, 이는 사용되는 나노 입자의 크기에 따라 도전였다 갖는다. 광학 현미경을 위해, 우리는 525 nm의 양자점 (녹색)보다 큰 585 nm의 (오렌지) 및 655 nm의 (적색) 형태에 비해 적은 배경 라벨을 생산하는 것을 발견했다. 그러나, 우리는 TEM에 의한 라벨의보다 ...

라이트 - 상관 및 전자 현미경 (클레멘 타인)의 과도 동적 이벤트 한 희귀 이벤트 2, 3, 4 복잡한 시스템의 분석을위한 강력한 방법이다. 질문에 따라 5 사용할 수 많은 다른 기술 순열 요청을 받고 있습니다 그러나 일반적인 요구 사항은 단일 샘플 6 동일한 구조가 여러 현미경 양식에 의해 촬영되어 있다는 것입니다. 클레멘 타인에 대한 우리의 특정 접근 방식은 보관 인간의 병리 조직의 연구 잘 특징과 7 이전에 게시 된 여기에 사용되는 경우에 개발되었다. 목적은 초 미세 구조 레벨에서 나타나는 면역 세포 표지 패턴의 내용을 명확하게하는 데 도움 형광 광학 현미경을 사용하여, 두 번째 단일 또는 외과 생검 샘플로부터 분석 된 데이터를 최대화하기 위해, 우선이었다. 양자점 나노 입자 (양자점)이 범용 마커 시스템 ABL의 가능성을 제공한다E는 모두 볼 수 있도록, 형광 광학 현미경 및 전자 현미경 (8, 9), (10). 이들 결정질 코어 구조들은 발광 스펙트럼 (11)까지의 파장의 광에 의해 여기 될 때 다른 크기의 양자점 형광 발광 피크의 넓은 범위를 생성 할 수있다. 이들 원자량은 투과형 전자 현미경, 주사 투과 전자 현미경 (STEM) 또는 전계 방출 주사 전자 현미경으로 검출 가능한 전자 밀도를 수득하기에 충분하다. 심지어 하나의 양자점이 표적 분자 (12) 당 하나의 QD의 궁극적 인 감도를 제공 관찰 할 수 있으므로 그들은 특히 면역 세포 화학 연구에 적합하다. 또한, QD에 따라 그들이 매핑 적합한 개별 원소 서명을 가지고 사용될 수있다. 인간의 병리 샘플 번역 생물 의학 연구에 상당한 이점을 제공합니다. 수술 조직 및 생검 샘플을 정기적으로 biobanking과 approp로 제출riate 윤리 간극은 조사 연구에 액세스 할 수 있습니다. 인체 조직은 동물이나 질병의 체외 모델에서 발생할 수있는 관련성 또는 해석의 문제가 발생하지 않습니다. 그러나, 병리 샘플 시료 준비는 종종 최적이 아니다. 조직 지연 정착액에 배치되어있을 수 있습니다 부적절한 정착는 TEM 부적절한 샘플링 포르말린이 아닌 글루 타르 알데히드로 사용된다. 클레멘 타인 방법은 단일 샘플로부터 인간 가능한 진단 및 예후 정보를 최적화하기위한 가능성을 가지고있다. 그러나, 미니 중항 산소 발생기 (miniSOG)를 이용하는 것과 같은 몇몇 새로 개발 상호 접근 인해 태그 관심 유전자 (13)의 셀에 부호화해야 할 필요성에 병리에서 사용할 수 없다. 이러한 이유로 우리는 상호 면역 세포 화학 연구에 일상적으로 준비 TEM 조직의 QD 라벨의 유틸리티를 살펴 보았다. 양자점은 에칭 에폭시 또는 리에서 아크릴 수지 섹션에 적용ghtly 알데히드 고정 생검 조직 샘플은 하나의 샘플에서 상호 형광 광 현미경 TEM 데이터를 획득 할 가능성을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>나트륨 카코딜</td><td>레이트 Proscitech</td><td>C0205</td><td>유해 화학 오스</td></tr><tr><td>뮴 테트록사이드</td><td>Proscitech</td><td>C010</td><td>흄 후드에서만 사용</td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트</td><td>Univar-Ajax</td><td>569</td><td>유해 화학 물질</td></tr><tr><td>에탄올 100 %</td> <td>프로닌</td><td>JJ008</td><td></td></tr><tr><td>아세톤 100 %</td> <td>프로 닌</td><td>JJ006</td><td></td></tr><tr><td>ERL 4221</td><td>Proscitech</td><td>C056</td><td></td></tr><tr><td>DER 732</td><td>Proscitech</td><td>C047</td><td></td></tr><tr><td>NSA</td><td>Proscitech</td><td>C059</td><td></td></tr><tr><td>DMAE</td><td>Proscitech</td><td>C050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium metaperiodate</td><td>Analar BDH</td><td>10259</td><td></td></tr><tr><td>anti-somatostatin 항체</td><td>Dako</td><td>A0566</td><td></td></tr><tr><td>항체 희석제</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 585 스트렙타비딘 접합체&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10113MP</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated 염소 항-토끼 IgG 항체 Sigma</td><td></td><td>B7389-1ML</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 50%</td><td>EMS</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>PBS "Dulbecco A"</td><td>Oxoid&nbsp;</td><td></td><td></td>BR0014G</tr><tr><td>BSAc (10%)</td><td>Aurion</td><td>900.022</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney PP</td><td>M</td><td></td></tr><tr><td>pH 지시약 스트립 (pH 2.0 - 9.0)</td><td>Merck</td><td>1.09584.0001</td><td></td></tr><tr><td>Micromoulds</td><td>Proscitech</td><td>RL063</td><td></td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프</td><td>Diatome</td><td>Ultra 45</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>FEI</td><td>Morgagni 268D</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axioscope A1</td><td></td></tr><tr><td>그리드 300 메쉬 니켈(얇은 막대)</td><td>Agar Scientific</td><td>G2740N</td><td></td></tr><tr><td>초박절판</td><td>RMC</td><td>Powertome</td><td></td></tr><tr><td>TEM 카메라 제어 소프트웨어</td><td>소프트 이미징 시스템</td><td>AnalySIS</td><td>버전 3.0</td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어</td><td>Adobe Systems 통합</td><td>된 포토샵 CS2</td><td></td></tr></tbody></table>

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

양자점 (QD) 나노 입자가 위드 형광 광 현미경 및 투과 전자 현미경 (TEM)을 이용하여 인간의 병리 조직의 면역 세포 화학적 상호 연구에 사용될 수있다하는 방법을 설명한다. 스트렙 타비 딘 결합 585 nm의 카드뮴 - 셀레늄 (의 CdSe) 양자점 (양자점)과 바이오틴 차 항체 및 시각화 다음에 우리가 소마토스타틴 (somatostatin)에 대한 일차 항체를 사용하여 인간의 소마토스타틴 종양의 초박 에폭시 섹션을 immunolabeled 한 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 섹션 위드 형광 빛 현미경으로 관찰 유리 슬라이드 상에 배치 된 시료 TEM 그리드 상에 장착된다. 광학 현미경은 종양 세포 내의 세포질 과립 패턴을 형성 밝은 오렌지 형광으로서 585 나노 QD 라벨링을 보여준다. 광학 현미경에 의한 중간 범위에서 낮은 배율 표지 패턴을 쉽게 인식 할 수 있으며, 비특이적 또는 배경 라벨링의 수준을 평가. 이것은 중요하다형태 학적 맥락의 후속 TEM에 의해 immunolabeling 패턴의 해석과 평가 단계. 같은 부분은 건조 도말 및 TEM으로 볼 수 있습니다. QD 프로브는 개별 분비 과립에 포함되는 비정질 재료에 부착하는 것으로한다. 이미지는 상관 분석을위한 광학 현미경으로 볼 수이자 (ROI)의 같은 지역에서 취득. 각 양상에서 이미지를 대응하는 다음 해당 지역의 TEM의 미세 구조에 형광 데이터를 오버레이 배합 할 수있다.

본 연구에 사용 된 소마토스타틴 종양 표본 stomal 콜라겐 조직과 혼합 도관 구조를 형성하는 종양 세포를 포함. 형광 빛 현미경으로 풍부한 분비 과립을 함유 개별 종양 세포는 호르몬 소마토스타틴 양성 표지를 나타내었다. 핵은 최소한의 비 특정 라벨 검출 (그림 1)과 어두운 구멍을 보였다. 낮은 배율 가변적 강렬한 과립 오렌지 형광이 아니라 특징으로하는 종양 세포의 세포질에서 나타났다. 형광 오렌지 색상이 사용 QD의 크기에 의해 결정 하였다. 이 연구에서 우리는 365 nm의 빛으로 흥분 할 때 오렌지 신호를 방출하는 585 나노 양자점을 사용했다. 동일한 셀의 클레멘 타인 분석 (그림 2) 수 있었다. TEM 시험 허용 ROI를위한 광학 현미경으로 볼 때 같은 격자를 사용하여 인식 메신저합니다...

양자점(QD) 나노입자를 에폭시 포매 인간 병리학 조직의 상관 면역세포화학적 연구에 사용할 수 있는 방법을 설명합니다. 당사는 광시야 형광 현미경 및 투과 전자 현미경으로 시각화되는 상용 항체 단편 접합 QD를 사용합니다.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

이 방법의 전반적인 목표는 단일 이미지 내에서 형광 면역세포화학 정보와 투과 전자 현미경의 초미세 구조 형태학을 결합하여 상관 광학 및 전자 현미경, 즉 CLEM 데이터를 얻는 것입니다. 이 방법은 특정 관심 단백질이 어떤 세포 내 구조와 연관되어 있는지와 같이 면역세포화학 및 병리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 양자점 나노입자 프로브를 사용하여 표적 단백질의 생체 현미경 신호와 전자 현미경 구조 국소화 정보를 모두 얻을 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 인간 소마토스타티노마(somatostatinoma) 종양 조직을 고정, 포매 및 절편 제작한 후, 2.0 mL의 아세톤이 담긴 5 mL 병에 20 cm 길이의 투명 접착 테이프를 넣어 절편 접착 용액을 준비하고 10분 동안 그대로 둡니다. 테이프를 꺼내고 니켈 그리드를 용액에 담갔다가 꺼내어 공기 중에서 건조시킵니다. 건조가 완료되면 그리드의 뭉툭한 면을 사용하여 초박절편을 채취합니다.선택한 수지 제형에 맞는 정확한 식각 시간을 설정하는 것이 매우 중요합니다. 본 제형의 경우 30분이 적당하지만, 더 단단하거나 부드러운 제형의 경우에는 시간을 다시 산출해야 할 수도 있습니다. 증류수로 신선한 포화 메타요오드산나트륨(sodium metaperiodate) 식각 용액 1 mL를 준비하고, 깨끗한 실험용 필름 표면에 이 용액을 한 방울씩 떨어뜨립니다.섹션이 포함된 완전히 건조된 그리드를 액적 위에 놓고 상온에서 30분 동안 배양합니다. 그 다음, 그리드를 증류수 액적에 60초 동안 옮겨 세척합니다. 깨끗한 실험용 필름 표면에서 항체 및 양자점(quantum dot, QD) 라벨링을 수행하려면, 0.05 molar glycene과 PBS를 피펫으로 분주합니다.그리드를 액적 위에 놓고 10분 동안 배양하여 섹션에 남아 있는 알데하이드를 블로킹합니다. 알데하이드 블록을 제거하기 위해 그리드 가장자리를 짧게 블롯팅합니다. 그런 다음 그리드를 1% normal goat serum(NGS) 및 1% BSAC가 포함된 PBS 액적 위에 10분 동안 놓아 둡니다.PBS 890 µL에 NGS 10 µL와 BSAC 100 µL를 첨가하여 블로킹 용액 1 mL를 준비합니다. 그다음, 절편을 항체 희석액 한 방울 위에 10분 동안 올려두어 컨디셔닝합니다. 이어서, 항체 희석액을 사용하여 anti-somatostatin 다클론 항체를 1:10 비율로 희석한 후, 그리드를 해당 용액 방울 위에 올립니다.습윤 챔버에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 그리드의 가장자리를 블로팅하여 항체 시약을 제거합니다. 그다음 항체 희석액을 사용하여 섹션을 5분씩 2회 세척합니다.2차 항체를 1:10으로 희석하고 방울을 준비한 후, 그리드를 방울 위에 올려 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 다음, 항체 용액을 제거하고 섹션을 2회 세척합니다. streptavidin이 접합된 QD를 1:10으로 희석하고, 샘플을 해당 용액 방울 위에서 암소, 실온 상태로 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 항체 희석액을 사용하여 그리드를 5분씩 2회 세척하고, 그리드의 가장자리를 블로팅합니다. 다음으로, 증류수로 그리드를 2분간 세척한 후 가장자리를 블로팅하여 건조시킵니다. 면역 염색된 그리드 섹션을 유리 슬라이드 위의 물 한 방울에 놓고, 유리 커버슬립으로 덮습니다.형광 광학 현미경 관찰을 수행하려면 다음 특성을 가진 필터 큐브를 삽입하고 365 nanometer LED 조명을 사용하십시오. 면역 염색된 절편을 면역 형광 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 광학 현미경을 사용하여 라벨링 패턴과 비특이적 라벨링 수준을 평가하고, 음성 대조군이 깨끗한지 확인하십시오.다음으로, 그리드 바와 관련하여 관심 영역(ROI)을 지정합니다. 그런 다음 풀 컬러 디지털 카메라를 FL 자동 색상으로 설정하고 화이트 밸런스를 3,200 K로 설정합니다. 이미지의 외관을 최적화하기 위해 카메라를 자동 노출 모드로 설정하고 감마 설정을 0.45에서 1.00 사이로 지정하며, 아날로그 게인은 1X로 설정합니다. ZEN Two Light 소프트웨어 그래픽 인터페이스에서 카메라 아이콘을 클릭하여 라이브 상태로 전환합니다. 그 후 이미지의 초점을 맞추고 ZEN Two Light 소프트웨어 그래픽 인터페이스에서 Snap을 클릭하여 이미지를 프레임 저장소에 캡처합니다.압축과 픽셀화를 방지하기 위해 이미지를 tf 파일로 저장하십시오. 그리드 바 또는 기타 주요 조직 랜드마크와 관련하여 ROI의 위치를 보여주는 출력물을 준비하십시오. 그 다음 슬라이드에서 그리드를 제거하고, 증류수로 세척한 후 가장자리를 조심스럽게 닦아 건조시키십시오.투과전자현미경 관찰을 수행하려면, 가속 전압 100 kilovolts를 사용하여 그리드를 현미경으로 옮겨 검사하십시오. 약 1,400X의 저배율로 시작하여 그리드를 탐색하고 광학 현미경으로 확인한 ROI를 찾으십시오. 70,000X 이상의 배율에서 개별 QD를 관찰하십시오.이들은 중간 정도의 전자 밀도를 가진 불규칙한 결정 구조로 나타날 것입니다. 그다음, 이미징 소프트웨어의 그래픽 인터페이스에서 1,392 x 1,040 픽셀의 단색 센서가 장착된 디지털 카메라를 사용하여, 카메라 아이콘을 클릭해 켜고 이미지를 획득하십시오. 카메라 아이콘을 끔 위치로 이동하여 이미지를 프레임 저장소에 저장하십시오.CLEM 이미징을 수행하려면, 광학 현미경 이미징 출력물을 사용하여 TEM으로 해당 ROI를 찾으십시오. 조직의 구조적 특징은 절편 내에서 위치를 찾는 데 유용합니다. TEM을 통해 해당 ROI의 이미지를 캡처하십시오.다음으로 CLEM 이미지를 준비하려면, TEM 이미지의 방향을 올바르게 맞추고 광학 현미경 이미지와 동일한 크기 및 해상도(이 경우 300 pixels per inch)로 확대하십시오. 광학 현미경 이미지 캔버스의 크기를 두 배로 확장합니다. 그런 다음 TEM 이미지를 형광 이미지 옆에 복사하여 붙여넣으십시오.Photoshop CS2에서 형광 오버레이를 생성하려면, 사각형 선택 도구를 클릭하고 형광 이미지를 선택한 다음, 해당 이미지의 복제 레이어를 생성합니다. 레이어 스타일의 혼합 옵션을 30~40% 투명도로 조정합니다. 그다음 이동 도구를 클릭하고 형광 오버레이 레이어를 해당 TEM 이미지 위로 드래그하여 이미지들을 정렬합니다.이미지 정렬 후, 이미지를 평탄화하여 최종 오버레이를 생성합니다. 그런 다음 사각형 선택 도구(rectangular marquee tool)를 사용하여 새로운 오버레이 이미지를 선택하고 이를 새 캔버스로 복사합니다. 마지막으로, 이미지를 tf 파일로 저장합니다.이 형광 현미경 이미지에서, 개별 소마토스타틴종(somatostatinoma) 종양 세포들은 풍부한 분비 과립을 포함하고 있으며 소마토스타틴 호르몬에 대해 양성으로 표지되었습니다. 핵은 어두운 구멍 형태로 나타났으며, 저배율에서 세포질 내에 강도가 다양하게 나타나는 과립형 오렌지색 QD 형광이 관찰되었습니다. 광학 현미경으로 선택한 ROI는 여기에 표시된 것처럼 20배 광학 현미경 이미지를 참조하여 인식되었으며 TEM을 통해 이미징되었습니다.더 높은 배율에서, 세포는 세포질 과립에서 밝은 형광과 강한 QD 라벨링을 보여줍니다. 이 예시와 같이 TEM 이미지 위에 형광 데이터를 중첩시키면, 강한 양성 라벨링이 소포 제한막 내에 중간 정도의 전자 밀도를 가진 물질을 포함하는 과립에 해당함을 알 수 있습니다. 마지막으로, 여기의 고배율 사진에서 볼 수 있듯이, 중간 정도의 전자 밀도를 가진 과립들이 강한 QD 나노결정 면역 라벨링을 나타냈습니다.이 기술을 완전히 익히면, 적절하게 수행했을 때 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 절차를 진행하는 동안 그리드의 가장자리 부분만 잡고 조심스럽게 다루는 것이 중요합니다. 그리드를 집어 올릴 때 섹션을 건드리면 그리드에서 섹션이 떨어질 수 있습니다.이 절차에 따라, 관심 단백질이 다른 단백질과 공동 국소화되는지 등 추가적인 질문에 답하기 위해 다중 면역 표지법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 병리학 분야의 연구자들은 전자 현미경용으로 처리된 보관 인간 조직에서 단백질 국소화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 형광 광학 현미경의 면역세포화학적 정보와 투과 전자 현미경의 초미세 구조를 결합하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.사산화오스뮴을 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안 보호 장구 착용, 흄 후드 내 작업 및 적절한 폐기물 처리와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법

우리는 전자 micrographs에 휘황 태그 단백질을 지역화하는 방법을 설명합니다. 형광 먼저 ultrathin 섹션에 사진 활성 현지화 현미경을 사용하여 지역화되어 있습니다. 이러한 이미지는 다음 같은 섹션의 전자 micrographs으로 정렬되어 있습니다.

나노 FEM : 사진 활성화 된 현지화 현미경과 전자 현미경을 사용하여 단백질 현지화

우리는 단일 분자 형광 이미징을위한 최소화 유체 역학적 크기 콜로이드 양자 점의 준비에 대해 설명합니다. 기존의 양자 점에 비해,이 나노 입자는 구형 단백질의 크기와 비슷합니다 및 단일 분자 밝기, photodegradation에 대한 안정성 및 단백질과 세포에 특이 현상 바인딩에 대한 저항에 최적화되어 있습니다.

단일 분자 이미징을위한 소형 양자 점

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

단일 형광체는 피오나를 사용하여 나노 미터 정밀도로 지역화 할 수 있습니다. 여기에 FIONA 기술의 요약보고, 어떻게 FIONA 실험을 수행하는 기술이다.

하나 나노 미터의 정확도와 형광 이미징 (피오나)

여기에서는 스웰 캡슐화를 통해 나노 입자가 고분자 호스트 매트릭스에 혼입되는 것을 모니터링하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 우리는 카드뮴 셀레나이드 양자점의 표면 농도가 단면 형광 이미징을 통해 정확하게 시각화될 수 있음을 보여줍니다.

직접 형광 이미징을 사용하여 나노 입자 - 고분자 복합 재료의 고급 성분 분석

이 프로토콜에서, 재조합 SARS-CoV-2 스파이크에 접합된 양자점은 세포-기반 분석을 가능하게 하여 원형질막에서 hACE2에 대한 스파이크 결합 및 세포질 내로의 결합된 단백질의 후속 엔도사이토시스를 모니터링한다.

HEK293T 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징

본 프로토콜은 양자점을 사용하여 심장 조직 절편에서 단백질을 면역표지하는 방법을 기술한다. 이 기술은 미세 구조 수준에서 모든 단백질의 세포 내 국소화 및 발현을 시각화하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

양자점 매개 면역 표지를 사용한 후 투과 전자 현미경을 사용하여 심장에서 단백질의 세포내 국소화를 시각화

여기서는 세포 초미세 구조와 관련된 희귀 단백질의 국소화를 조사하기 위한 도구로서 내인성 형광 표지를 기반으로 하는 최적화된 절편 상관 광전자 현미경을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법의 힘은 바필로마이신 처리 없이 굶주린 세포에서 내인성 LC3의 초구조적 국소화에 의해 입증되었습니다.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

우리는 mScarlet이라는 형광 단백질을 사용하여 Epon post-embedding correlative light and electron microscopy에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 형광과 미세구조를 동시에 유지할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 생물학적 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

이 프로토콜은 상관광과 전자 현미경을 사용하여 각각 mEosEM 및 APEX2로 표지된 미토콘드리아와 리소좀의 상호 작용을 시각화하는 메커니즘을 설명합니다.

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interaction between Mitochondria and Lysosomes (미토콘드리아와 리소좀) 사이의 상호작용 시각화를 위한 Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy

학습하세요 양자점 나노입자를 활용한 상관광-전자현미경법으로 인간 종양 조직에서 단백질의 아세포내 위치를 정밀 분석하는 방법을. 이 기술은 형광 면역세포화학과 초미세구조 영상을 통합하여 병리학 연구에 활용됩니다.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

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