엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법

이 절차의 목표는 엑소좀을 크기별로 분석하고, 나노입자 추적 분석 또는 NTA 기기를 이용하여 반자동 방식으로 정량화하는 것입니다. 이는 차등 중심화 단계를 사용하여 인간의 혈액에서 엑소좀 펠릿을 얻음으로써 이루어집니다. 엑소좀은 적절한 산란 강도를 얻기 위해 시작 혈장의 양에 대해 미리 결정된 농도로 재현탁됩니다.

NTA 중에는 현탁액을 여과하여 더 큰 입자에서 엑소좀을 분리합니다. 다음으로, 200나노미터 크기의 폴리스티렌 입자를 포함하는 제어 현탁액을 사용하여 NTA 기기의 보정을 수행합니다. 그런 다음 엑소좀 용액을 NTA 기기에 주입하고 최종 테스트를 수행하기 전에 사전 테스트를 수행하여 NTA의 이상적인 설정을 선택합니다.

궁극적으로 측정된 모든 입자의 정량화와 크기별 입자 목록을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 최상의 결과를 얻기 위해서는 준비된 각 엑소좀 용액의 용액과 설정을 개별적으로 수행해야 하기 때문에 이 방법의 시연은 매우 중요합니다. 측정된 엑소좀은 라이브 뷰 모드가 화면당 약 600개의 입자를 표시하도록 I 농도여야 합니다.

또한 측정을 위한 최적의 감도 범위를 찾기 위해 사전 테스트를 수행해야 합니다. 감도를 높게 설정하면 더 많은 작은 입자를 시각화할 수 있으며 배경 소음과 관련된 문제도 증가합니다. 이 절차는 우리 연구실의 대학원생인 Anto May에 의해 시연될 것입니다.엑소좀 준비를 시작하려면 정맥 천자를 통해 3개의 구연산염 튜브에 총 9ml의 전혈을 수집합니다.

그런 다음 혈액을 15 밀리리터 팔콘 튜브에 붓고 섭씨 4도에서 20 분 동안 1, 500G에서 샘플을 원심 분리하여 플라즈마에서 세포 분리를 시작합니다. S 초기를 새로운 15mm Falcon 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 20분 동안 2, 800G에서 다시 원심분리하여 혈장에서 모든 세포를 제거합니다.

cell-free 플라즈마 또는 CFP를 튜브당 1ml의 속도로 초원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로 CFP를 100, 000G에서 섭씨 4도에서 90분 동안 원심분리하여 엑소좀을 고갈시킵니다. 900마이크로리터의 상등액을 제거하고 초원심분리 튜브의 나머지 100마이크로리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

PBS 분리기의 900 마이크로리터를 추가한 후에, 당신은 100, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 000 G에 얻는다. 이전과 마찬가지로 900 마이크로 리터의 앙와위 제제를 제거하고 나머지 100 마이크로 리터로 펠릿을 재현탁합니다. 5-20마이크로리터의 Resus 현탁액을 40ml의 증류수로 옮깁니다.

450나노미터 필터를 통해 현탁액을 필터링하여 더 큰 입자에서 엑소좀을 분리합니다. 입자 측정에 이 최종 현탁액을 사용하여 입자 추적 기기를 사용합니다. 먼저 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 프로그램을 시작합니다.

다양한 소프트웨어 탭을 클릭하여 프로토콜 전체에서 탭 사이를 전환합니다. 화면의 지시를 따릅니다. 시작 절차의 자동화된 구현을 위해 셀 품질 검사와 자동 정렬에 대한 상자를 모두 선택합니다.

이러한 단계 중 하나는 필요한 경우 셀 검사 탭에서 버튼 A 또는 B를 눌러 별도로 반복할 수 있습니다. 아웃룩 포트 아래에 비커를 놓아 폐기물 용액을 수집하고 시스템에 기포를 주입하지 마십시오. 나노입자 추적 분석 또는 NTA 기기의 입구 및 전망 포트를 열고 주사기로 증류수 10ml를 주입 포트를 통해 세포 채널에 주입합니다.

마지막 양의 물이 주입되는 즉시 입구와 출구 포트를 닫으십시오. 측정 셀에 기포가 없는지 확인하십시오. 를 클릭하여 셀 품질 검사를 수행합니다. 그래.

소프트웨어는 몇 초 후에 셀 품질 결과를 표시하며, 입자가 소프트웨어의 라이브 뷰 화면에 여전히 시각화되어 있거나 품질 검사 결과가 좋거나 나쁨인 경우 측정 셀에서 나머지 입자가 제거될 때까지 원위 물 주입을 반복합니다. 입자가 축적되지 않도록 각 측정 후에 이 단계를 반복하십시오. 다음으로, 200나노미터 크기의 균일한 폴리스티렌 입자를 포함하는 제어 현탁액을 준비합니다. 레이저와 현미경의 초점을 정렬하기 위해 기기 제조업체에서 제공한 현탁액 농축액 한 방울을 500ml의 증류수에 추가하면 라이브 뷰에서 화면당 600개 이상의 입자가 표시되거나 마이너스 100개의 입자가 표시되도록 필요한 농도가 됩니다.

증류수 프레스에 대해 수행한 것처럼 정렬 현탁액을 NTA 기기에 주입합니다. 시스템이 두 초점의 최적 위치를 자동으로 찾는 자동화된 루틴인 정렬도 시작하는 것이 좋습니다. 시스템이 이제 실험을 할 준비가 되었다는 메시지가 나타나면 확인을 클릭하여 측정을 시작합니다.

때때로 30%의 에탄올 용액으로 세포를 세척하여 실험 사이에 세포 채널을 수동으로 청소합니다. 소프트웨어가 자동 오류 보고서를 표시할 때마다 채널을 청소합니다. 시스템 측정을 수행합니다.

먼저, 각 샘플 측정 전에 증류수로 채널을 세척하십시오. 그런 다음 엑소좀 현탁액을 채널에 주입합니다. 다음 단계는 소프트웨어의 주요 매개변수를 조정하여 감도를 조정하는 것입니다.

입자 수와 감도를 클릭하여 최적의 감도 범위를 찾아 다양한 감도 수준에 대해 화면당 측정된 입자에 대한 곡선을 표시합니다. 곡선의 최대 기울기 전에 민감도 수준을 선택합니다. 감도 수준이 높을수록 더 많은 작은 입자를 시각화할 수 있지만 배경 노이즈와 관련된 문제도 증가합니다.

최소 밝기를 조정하려면 엑소좀 측정을 위해 시작 밝기 20을 선택합니다. 이 기능을 필터로 사용하려면 이 매개변수를 조절하여 강한 광 산란 입자를 비우십시오. 매주 산란하는 아티팩트를 증폭하도록 조절하며, 실험 전반에 걸쳐 필요에 따라 매우 밝게 조절합니다.

다음으로, 디지털 필터를 설정하여 픽셀 노이즈와 원치 않는 산란 대형 입자를 제거합니다. 최소 및 최대 크기를 조절하여 10에서 500픽셀의 범위를 사용하여 엑소좀을 측정합니다. 셔터를 300밀리초인 3.3밀리초로 설정하여 카메라가 열려 있는 시간을 변경하여 셔터를 조정합니다.

실시간 판독 매개변수를 조정하려면 실시간 이미지 버튼을 클릭하여 언제든지 디지털 및 아날로그 보기 모드 간에 전환할 수 있습니다. 실험 내내 말이죠. 산란 강도 막대를 모니터링하면 샘플의 채도 상태가 색상으로 구분된 지표로 표시됩니다.

산란 막대가 빨간색인 경우 엑소좀을 분석하지 마십시오. 측정을 시작하려면 측정 탭을 클릭하십시오. 실행 옵션 배열에서 설정을 선택합니다.

각 획득 전에 움직임 확인, 반복 입자 드리프트 검사 테스트를 선택하고 실험 수와 실험 사이의 시간 지연을 선택합니다. 필요한 경우 샘플 검사를 수행합니다. 마지막으로 비디오 획득 실행 버튼을 클릭합니다.

새 창에서 사이클 수와 측정 위치 수를 정의합니다. 최소 기간을 확인합니다. 입자는 하나의 개별 입자로 계산되는 것으로 추적됩니다.

비디오 해상도를 설정하면 해상도가 낮을수록 추적 시간이 짧아집니다. 마지막으로 파일 이름을 선택하고 확인을 클릭하여 측정을 시작합니다. Number of Particles(입자 수 대 감도) 곡선은 한 순간에 한 위치에 있는 입자를 표시합니다.

자동 감도 스캔 중에는 그래프의 최대 기울기보다 먼저 감도 값이 선택됩니다. 아티팩트는 이 테스트 실험에서 제거되지 않으며 그래프에 영향을 줄 수 있습니다. 라이브 뷰 화면에서 입자를 시각화하면 올바른 감도 값을 설정하는 데 도움이 됩니다.

값이 너무 낮으면 몇 개의 입자가 감지됩니다. 값이 너무 높으면 이미지가 좋지 않은 것을 나타내지만 고품질 입자는 최적의 감도 수준에서 서로 잘 격리된 단일 점으로 나타납니다. 측정 후 결과 탭을 통해 총 입자 수, 추적된 평균 입자 수, 위치당 평균 입자 수 및 입자 농도, 입자 수 백분율에 대한 입자 크기의 수치 비율을 포함한 매개변수를 판독할 수 있습니다.

측정 후 계산된 그래프는 크기별 입자 분포를 보여줍니다. 디스플레이 모드의 아이콘을 사용하여 그래프 설정을 변경할 수 있습니다. 또한 엑소좀을 분석하는 방법에는 여러 가지가 있습니다.

이 방법은 빠른 프로세스에서 유사한 분석법 분석을 수행하여 짧은 시간에 결과를 생성하는 매우 간단하고 우아한 방법을 보여줍니다. 여러 샘플을 비교하려면 모든 샘플에 대해 동일한 희석 수준을 유지하는 것이 좋습니다. 모든 설정은 감도를 허용하며 비디오 해상도는 몇 가지 분석 소프트웨어 세트를 사용하여 나중에 변경할 수 있습니다.

이러한 방식으로 엑소좀 양과 크기에 대한 다양한 실험에서 얻은 데이터를 반자동 방식으로 비교할 수 있습니다.