Name: 엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 배우세요 인간 혈액에서 엑소좀을 분리하고 NTA를 사용하여 크기와 농도를 정량화하는 방법을. 이 반자동화 기술은 신경과학 및 생물학 연구에서 세포 간 통신을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 원고를 비판적으로 읽고 탁월한 편집 도움을 준 Christina Ballázs, Hug Aubin, Jörn Hülsmann에게 감사를 표합니다. 또한 저자는 기술 지원에 대해 Gisela Mueller에게 감사를 표합니다. 저자들은 출판 비용을 충당할 수 있는 자금을 제공한 Particle Metrix GmbH에 감사를 표합니다.

참고 :이 작업에 제시된 실험 뒤셀도르프 대학의 기관 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 엑소 준비 <ol><li> (9 ml의 총) 정맥 천자를 통해 3 구연산 튜브에 전혈을 수집합니다. 15 ㎖의 팔콘 튜브에 혈액을 붓고. </li><li> 플라즈마에서 세포의 분리를 시작하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 1,500 XG에서 샘플을 원심 분리기. 새로운 15 ㎖의 팔콘 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 플라즈마에서 (; CFP 무 세포 플라즈마를) 모든 세포를 제거하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 2,800 XG에서 샘플을 원심 분리기. 초 원심 튜브, 튜브 당 1 ml의 CFP를 전송합니다. </li><li> 4 ° C에서 90 분 동안 10 만 XG에 원심 분리기 엑소 좀을 소모합니다. 상층 액 900 μl를 제거합니다. 초 원심 분리 튜브에 남아있는 100 μL에 펠릿을 다시 일시. 900 μl의 PBS를 추가합니다. </li><li> 원심 분리기 다시 4 ℃에서 30 분 동안 10 만 XG에. SU 900 μl를 제거pernatant. 나머지 100 μL로 펠렛을 다시 일시. </li><li> 전송 증류수 40㎖의 재 현탁액의 5 내지 20 μL. 큰 입자에서 엑소 좀을 분리하는 450 nm의 필터를 통해 서스펜션을 필터링합니다. 입자 측정을위한 마지막 정지를 사용합니다. </li></ol> 입자 추적 장비 2. 시작 절차 <ol><li> 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 프로그램을 시작합니다. 다양한 소프트웨어 탭을 클릭 ( &quot;셀 확인&quot;, &quot;측정&quot;, &quot;분석&quot;) 프로토콜을 통해 그들 사이를 전환합니다. </li><li> 시작 절차의 자동화 구현을 위해 화면의 지시 사항을 따르십시오. 셀 품질 검사 및 자동 정렬 모두에 대한 상자를 선택합니다. 참고 :이 단계 중 하나가 &quot;셀 검사 &#39;탭 버튼 (A) 또는 (B)를 눌러 별도로 필요하다면 반복 될 수있다. </li><li> NTA 악기의 입구와 출구 포트를 열고 10m를 주입L은 유입구를 통해 채널 내로 세포 주사기로 증류수. 물의 양은 마지막 주입됨에 따라 출구 포트를 닫고. 폐액을 수집 출구에서 비커를 놓습니다. 측정 셀은 기포가 없는지 확인하고 시스템에 공기 방울을 주사기하지 않습니다. 바로 입구 포트를 닫습니다. </li><li> &quot;OK&quot;를 클릭하여 셀 품질 검사를 수행합니다. 소프트웨어는 몇 초 후에 셀 품질의 결과를 표시한다. </li><li> 모든 입자는 여전히 소프트웨어의 라이브 뷰 화면에 시각화 또는 품질 검사의 결과 만 좋거나 나쁜 경우, 나머지 입자까지 반복 스텝 2.3은 측정 셀로부터 제거하는 경우. 또한 입자의 축적을 방지하기 위해 각 측정 후 단계 2.3를 반복합니다. 증류수 주입을 반복하고 세포 검사하는 &quot;좋은&quot;결과를 얻을 수없는 경우에는, 2.9로 진행. </li><li> 균일 한 200 nm의 크기를 포함하는 POL 제어 현탁액을 제조ystyrene 입자를 레이저 현미경의 초점을 정렬하는 데 사용된다. 600 ± 100 입자가 라이브 뷰 화면 당 표시되도록 필요한 농도를 얻기 위해, 500㎖의 증류수에, 기기 제조업체에서 제공 현탁액 농축 한 방울을 추가. </li><li> 단계 2.3에 기재된 바와 같이 NTA 구에 정렬 현탁액을 주입한다. &quot;OK&quot;를 누르면 자동 정렬 시스템이 자동으로 두 초점의 최적 위치를 찾을 통해 자동화 된 루틴을 시작합니다. </li><li> 프롬프트는 시스템을 알리는 표시되면 측정을 시작하려면 확인을 클릭 이제 실험 준비가 된 것입니다. </li><li> 때때로, 에탄올 30 % 용액으로 세포를 세척하여 실험간에 수동으로 셀 채널을 청소. 소프트웨어가 자동으로 오류 보고서를 표시 할 때마다 채널을 청소합니다. </li></ol> 샘플 3. 측정 <ol><li> EA 전에 증류수 채널 플러시(단계 2.3에 기재된 바와 같이) CH 시료 측정. </li><li> 단계 2.3에 설명 된대로 채널에 (섹션 1에서 제조 된) 엑소 현탁액을 주입한다. </li><li> 필요에 따라 소프트웨어의 다음과 같은 주요 매개 변수를 조정합니다 <ol><li> 감도. 최적의 감도 범위를 찾기 위해, 서로 다른 감도 레벨 화면마다 측정 입자의 곡선을 표시하려면이 단추 &quot;감도 대 입자의 수​​&quot;를 클릭합니다. 곡선의 최대 기울기 전에 감도 레벨을 선택했다. 감도가 높을수록 레벨이 더 작은 입자의 시각화 할 수 있습니다뿐만 아니라 배경 잡음 관련된 문제를 증가시킨다. </li><li> 최소 밝기. 엑소 측정 필터로서이 기능을 사용하기위한 (20)의 출발 밝기를 선택했다. 밖으로 빈 강하게 광산란 입자까지이 매개 변수를 조절한다. 유물을 산란 약하게 증폭 아래로 조절한다. 실험을하는 동안 필요에 따라 밝기가 달라집니다. 참고 : 라이트 - 입자너무 강하게 중첩 캐터 실수로 분석에서 제외 될 수있다. </li><li> 최소 및 최대 크기입니다. 최소 및 최대 크기를 조절함으로써, 대형 입자 화소 불필요한 잡음을 제거하기 캐터 디지털 필터를 설정한다. 엑소 좀의 측정 10~500 화소의 범위를 사용한다. </li><li> 셔터. 카메라가 1/300 초에 열려있는 기간을 조정합니다. </li></ol></li><li> 읽어 매개 변수를 라이브 : <ol><li> &quot;라이브 이미지&quot;버튼을 클릭하여 임의의 지점에서 디지털 및 아날로그보기 잠정 사이를 전환합니다. </li><li> 전체 실험에​​서, 색상 코드 지표로 시료의 포화 상태를 표시 산란 강도 막대를 모니터링. 산란 줄이 빨간색 인 경우 엑소 좀을 분석하지 마십시오. 이러한 경우에 더욱 이러한 현상을 피하기 위해 샘플을 희석. 실험 조건 시험 용액의 조작을 금지하는 경우, 감도를 하향 조절 또는 소프트웨어 (S)의 휘도를 조절-ettings는 측정 결과를 향상시킬 수있다. 참고 : 입자의 매우 높은 농도의 시료를 분석 할 때 분산은 개개의 입자를 융합하고 그들은 하나의 단일 입자로 계산됩니다. </li><li> 디스플레이에서 시야에서 계산 된 입자의 개수를 참고. </li></ol></li><li> &quot;측정&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> &quot;실행 옵션&quot;배열의 설정을 선택합니다. <ol><li> 각 인수하기 전에 반복 체크 입자 드리프트 테스트 &quot;체크 운동 &#39;을 선택합니다. 전체 분석을 시작하기 전에 한 번 이상 테스트를 수행합니다. 드리프트가 20㎛보다 높은 / 초이면, 샘플은 흐르지 않게되도록 측정을 계속하기 전에 대기. </li><li> 실험 번호 (5)과 이들 사이의 시간 지연 (0)를 선택한다. </li><li> &quot;샘플 검사 &#39;(필요한 경우)를 수행합니다. 이 시험은 시동 절차의 자동 정렬의 일부이며 나중에 필요에 따라 반복 될 수있다. </리&gt; </ol></li><li> 마지막으로 &quot;실행 영상 획득&quot;버튼을 클릭합니다. 새로운 윈도우에서, 사이클의 수 (15) 및 측정 위치의 수 (11)을 정의한다. 주 : 레이저 헤드와 현미경이 상이한 위치 (11) 입자 수를 분석하기 위해 이동 될 수있다. 실험 수요에 따라, 실험에 하나의 단일 위치 또는 다른 위치에서 수행되어야하는지 여부를 결정한다. <ol><li> 입자 비디오 해상도 (저)를 설정하여 하나의 개별 입자로 간주 될 찾아 갈 필요가있다 최소 지속 시간을 확인한다. 더 짧은 지속 시간 트래킹 저해상도 결과. </li><li> 파일 이름을 선택하고 측정을 시작하려면 &quot;OK&quot;를 클릭합니다. </li></ol></li></ol> 결과 4. 해석 <ol><li> &quot;결과&quot;탭을 측정 한 후 표시하면 다음과 같은 결과와 매개 변수를보기 : 추적 입자의 (1) 총 번호, 부품 (2) 평균 수위치, 및 (3) 입자 농도 당 icles. <ol><li> 입자 수의 비율로 입자 크기 (직경, 표면 및 체적)의 비율에 대한 수치 결과 평균 테이블을 볼뿐만 아니라 평균 및 표준 분화의 값. </li><li> 하나 이상의 피크가 그래픽 분석에있는 경우 피크 분석 테이블을 사용합니다. 이 표는 각각 제 2 피크 또는보다 작은 입자의 분포를 나타낸다. </li></ol></li><li> 크기에 따라 입자의 분포를 확인하기 위해 측정 한 후 계산 된 그래프를 볼 수 있습니다. 설정을 변경하는 표시 모드와 그래프 위의 아이콘을 사용. </li></ol>

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</ol>

이 작업은 HHU 의과대학 심혈관외과의 기관 기금으로 지원되었습니다. 이 연구의 출판 비용은 Particle MetrixGmbH에서 제공했습니다.

우리는 생물학적 유체 엑소 크기와 농도를 측정 할 수있는 새롭고 혁신적인 방법으로 혈액와 현재의 나노 입자 추적에서 엑소 분리에 대한 자세한 프로토콜을 보여줍니다. 제시된 실험에서는 인간 말초 혈액 엑소 좀의 원점으로 하였다. 그러나 등과 소변, 객담, 세포 배양 상등액, 다른 기원, 또한 시험 물질로서 사용될 수있다. 인간에서 엑소 농도의 생물학적 다양성에 기초하여, 다른 개인의 분석은 엑소 좀의 다양한 농도를 현저하게 마련되어있다. 그러나 생물학적 검사 프로브 입자의 농도는 결과에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 프로브의 희석 신뢰성 있고 표준화 된 접근 방식이 필요하다. 제시된 방법은 엑소 포함하는 플라즈마는 주변 전체 혈액의 9 ml의에서 생성되었습니다. 차등 원심 분리를 사용하여 엑소 좀 펠렛으로부터 분리 된 단계1 ml의 혈장과는 현탁 엑소 좀의 작업 샘플을 파생한다고 증류수 5ml에 재현 탁. 이 사전 정의 된 설정은 입자의 적절한 농도, NTA 동안 즉, 적절한 분산 강도와 함께 우리를 제공하고 있습니다. 볼륨 및 희석 양태 게다가, 사용되는 용액의 조성은 또한 중요하다. 우리는 엑소 좀의 최종 다시 서스펜션 증류수를 사용했다. 물론, 최종 희석 단계에 대해 다른 매체는 실험 장치의 요구 사항에 따라 이용 될 수있다. 그러나, 완충 능력을 시험 샘플과 함께, 특히 이온 용액의 제타 전위 측정의 경우, 난류없는 조건 신중한 희석 유용하다. 여러 샘플의 직접 비교를 위해 우리는 모든 샘플에 대해 동일한 희석 수준을 유지하는 것이 좋습니다. 감도 및 해상도의 영상을 제외한 모든 설정 ZetaView 분석 소프트웨어를 사용하여 나중에 변경 될 수있다. (10)와 함께 다른 이동기구 설계를 제공하는 다른 시스템을 채용했다. 우리는 결과의 시료 처리 및 재현성에 관한 실용적인 측면이 엑소 평가를위한 방법 론적 순서를 선택하는 중앙 중요하다 있다고 생각합니다. 또한 이상 검출 시스템이 측정의 결과를 방해 할 수 따라 사용자 요인을 제거해야한다고 판단된다. 여기에 제시되는 엑소 좀 분석 접근법은 고도로 취급 용이성 기준을 충족. 또 다른 장점으로, 샘플의 분석 반자동 단시간에 결과를 생성하는 과정에서 빠르게 수행된다. 엑소 좀의 온라인 시각화 조지아에 분석기를 돕는다엑소 특성, 예를 들면, 총 농도의 인스턴트 아이디어. 여기에 제시된 측정 기법에 매우 단순하지만 우아한 첨가 항체 표지 엑소 좀의 용도 및 검출기의 앞에 선행하는 필터를 이용하여 레이저 광 산란의 캡쳐이다. 이러한 방식의 엑소 소집단은 선택적 형광 염색법 기술적 접근 그들의 표면 항원 및 다른 중요한 생물학적 특성에 따라 구분 될 수있다. 우리 입자 추적 장비의 현재 버전의 하나의 단점은 매우 높은 민감도 수준에서 배경의 노이즈 아티팩트는 셀의 채널 벽에 기초하는, 본 될 수 있다는 사실이다. 현재의 시스템에 대한 기술적 인 해결책과 개선은 곧 제공 될 수있다. 채널 벽에 레이저 빛을 산란이 방법의 반사에 의해함으로써 증가, 감소 될 것이다<html> 측정 된 신호 및 데이터 획득 및 검출 한계를 낮추는 정도. 엑소 격리를위한 현재 사용되는 프로토콜은 잘 설립인가 입자 추적기구 30 nm의 낮은 크기 분포와 매우 정밀한 해상도를 가지고 있지만, 검출 된 입자가 실제로 완전히 사실 엑소 좀 있다는 보장이 없다. 이러한 죽은 세포 조각 또는 큰 단백질 복합체와 같은 다른 입자는 또한 엑소 서스펜션에 존재하는 거짓 긍정적 인 신호가 발생할 수 있습니다. 이러한 &quot;오염&quot;을 전자 현미경 (EM)의 송신 또는 EM 주사 EM 이어도 배제 할 수있는 하나의 신뢰할 수있는 방법. 이전에 제안 된 표면 마커의 수는 tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9 등 (11)를 포함하여 관심의 증가 금액을 얻고있다하지만 불행하게도, 엑소 좀에 대한 일반 및 특정 마커는 지금까지 확인되지 않았다. &quot;&gt; 무관 엑소 생물학, 특히 엑소 특정 마커에 관한 연구의 미래의 진보, 여기에 제시되는 프로토콜 단리 엑소 좀의 검출을위한 강력한 방법을 제공하는 것이다. 농도와 크기가 용이하게 소프트웨어 보조 식으로 결정될 수있다 간단한 패션. 선택적 형광 마커 또는 형광 결합 항체의 추가 가능성이 더 NTA의 제시 방법의 응용 가능성을 향상시킬 것입니다.

순환하는 엑소 좀의 정확한 기능은 장기간 동안 알려지지 남았다. 지금도 엑소 좀의 전체 경로 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 엑소 좀을 가지고 있기 때문에 항원 단백질과 원산지 그들의 부모 세포, 세포 - 세포 신호 송신기로 그 기능에 관한 RNA (mRNA와 miRNA의)를 중심으로 우선 순위를 부여하고있다. 많은 다른 방법은 분리 및 1,2- 엑소 좀의 정량적 검출을 위해, 문헌에 기술되어있다. 그러나, &#39;황금 표준&#39;에 대한 합의에 도달 없습니다. 한편 엑소의 연구 분야에서 활동 과학자의 대부분은 격리의 일관된 방법은 매우 다른 보고서와 연구 사이의 비교의 높은 수준을 달성하기 위해 보증에 동의합니다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 엑소 분석 3 가장 일반적이고 널리 도구이다. FACS는 벤있다형광 라벨을 통해, 상이한 기원의 세포가 하나의 단계에서 비교 될 수있다을 더할. FACS의 주요 단점은 더 적은 크기를 측정하기 위해, 엑소 좀은 직경 5 30 ~ 120 nm의 사이에 일반적으로 반면이 방법은, 입자보다 작은 0.5 μm의 4를 식별 할 수있을만큼 민감하지 점이다. 주사 전자 현미경 (SEM) 및 투과형 전자 현미경 (TEM)은 입자 크기 및 형태의 엑소 좀의 다른 분석을위한 도구이다. 그러나, SEM 및 TEM 모두 샘플의 준비 시간이 많이 소요, 두 방법 모두 노동 집약적 인 단계를 포함 할 수있는 단점을 가지고 각각의 이슈 생성 될 위험이있다. 어느 방법은 높은 시료 처리 한 시료의 단일 입자의 수​​천의 특성에 적합하다. 더욱이, 샘플이 종종 임상 일상 용 정량 분석​​은 매우 짧은 기간에 동시에 또는 적어도된다 분석 할수행하기 어렵다. 차세대 기술은 지금 우리가 이전에 집중적 인 준비 작업 (예를 들어, 환경 SEM)없이 엑소 좀을 분석 할 수 있습니다. 이러한 최신 기술은 여전히 평균 개수 및 크기 분포를 결정하기 위해 6 엑소 좀을 대량 함유 현탁액을 분석 오히려 불편하다. 시각화 및 엑소 좀 분석을위한 또 다른 매우 중요한 방법은 나노 입자 추적 분석 (NTA)입니다. 이 방법은 물리학의 두 가지 원칙을 활용합니다. 먼저, 입자들이 레이저 빔이 조사 될 때 빛 산란에 의해 검출된다. 두 번째 현상은되는 따른 액체 현탁액 중의 입자들의 상이한 확산의 크기에 반비례하는, 브라운 운동으로 알려져있다. 후자의 경우, 이동도의 온도 및 액체의 점성에 의존한다. 그러나, 이러한 속도는 직접 입자 크기와 관련이 NTA에 의해 사용된다. 부드러운 사용웨어 기반의 분석은 단일 입자 산란광의 디지털 이미지가 기록됩니다. 산란 광 스폿의 플롯과 그들의 모션의 속도는 입자의 총 개수 및 크기 분포의 결정을 용이하게 데이터를 제공한다. 이 기술은 100nm 이하의 평균 입자 직경을 분석하는데 특히 강력하다. 크기와 농도 측정은 ZetaView 브라운과 전기 영동 모션 비디오 분석 현미경으로 수행됩니다. 이것은 (이하, 입자 추적기구 라 함), 액체 시료 반자동 탁상 나노 분석 도구이다. 이는 입자 분석기 추적뿐만 아니라, 데이터 분석에 사용되는 소프트웨어 노트북 이루어져있다. 이기종 생물학적 시료는 무기 입자의 더 균일 한 현탁액으로이 방법으로 적합하다. 비디오 카메라와 레이저 산란 현미경은 입자의 검출 및 obse에 사용그들의 운동의 rvation. 현미경 축이 수평 및 엑소 좀을 함유하는 현탁액으로 채워진 셀 채널에 초점을 맞추고 있지만, 레이저 빔은 수직 배향된다. 현미경 (도 1)를 통해 디지털 비디오 카메라에 의해 90 ° 아래에 기록되어, 레이저 광의 산란에 의해 조사 된 입자. 산란광 강도는 60 나노 미터보다 큰 입자 지름의 관찰을 허용한다. 이러한 설정에서 입자의 밝기 입경 용임 아니다. 어떠한 전계가인가되지 않는 경우, 입자 운동은 브라운 운동을 다음과 입경을 산출 지표로서 역할을 할 수있다. 그러나, 장비는 또한 셀의 채널을 가로 질러 전기장을인가 할 수있다. 이 필드를 실시 할 때, 전위, 극성 및 현탁 엑소 좀의 이온 전하의 레벨은 이동 방향의 상기 결정된다. 전기 영동 개월의 속도와 방향 결과내구 히스토그램. 고립 된 엑소 좀을 분석 할 수있는 최적의 방법을 찾는 것이 하나의 문제이지만, 또 다른 하나는 혈액, 복수, 소변, 우유, 양수 또는 세포 미디어 등 다양한 매체에서 엑소 좀의 효과적인 분리에있다. 다른 방법은 초 원심 (1)에 기초하는, 지금까지 설명되었다 (예 Exoquick 등) 산업 분리 시약 (7), (8)의 분리 또는 한외 여과를 이용한 항원 자성 비드 9 단계. 이 프로토콜에서는 초 원심 분리를 통하여 엑소의 전체 과정을 설명하고, 입자 트래킹기구를 통해 현탁액을 함유하는 생성 된 엑소 좀을 분석하는 방법을 보여준다. 인간 혈장 또는 세포 배양 배지 유래 엑소 좀의 분석에 대한 구체적인 고려 사항이 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>구연산염 튜브</td><td>BD</td><td>364305</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>증류수</td><td>Braun</td><td></td><td>3880087 Aqua ad iniectabilia</td></tr><tr><td>Falcon 튜브</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td>PP 튜브, 멸균 15ml</td></tr><tr><td>초원심분리 튜브</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td>Microfuge 튜브 폴리알로머 1.5ml</td></tr><tr><td>Polybead</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>07304</td><td>2.6% 고형물-라텍스 정렬 용액</td></tr><tr><td>주사기(필터)</td><td>브라운</td><td>4617053V</td><td>5ml</td></tr><tr><td>주사기(ZetaView)</td><td>브라운</td><td>4606051V</td><td>5ml</td></tr><tr><td>바늘</td><td>BD</td><td>305180</td><td>BD 블런트 필 바늘</td></tr><tr><td>필터</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16555</td><td>주사기 필터, 친수성, 450 &마이크로; m</td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman</td><td>L8-M</td><td>로터: 70Ti Ser. 번호 E21078</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>PMX 100, Type 101</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>로터: A-4-44</td></tr></tbody></table>

엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

최근 엑소좀의 생물학적 중요성이 과학적, 임상적으로 점점 더 주목을 받고 있지만, 엑소좀의 복잡한 경로, 생체 이용률, 건강 및 질병에 대한 다양한 기능에 대해서는 아직 많은 것이 알려지지 않았습니다. 현재 연구는 다양한 인간 질환, 특히 종양학, 부인과학, 심장학 분야에서 엑소좀의 존재와 행동(체외 및 생체 내)의 존재와 행동에 초점을 맞추고 있습니다.
안타깝게도 엑소좀 분리에 대한 황금 표준에 대한 합의는 존재하지 않으며, 정량 분석을 위한 그러한 방법에 대한 합의도 없습니다. 엑소좀을 정제하는 방법은 다양하고 정량적 및 정성적 분석의 가능성도 많기 때문에 이상적인 접근법을 위한 방법의 조합을 결정하기는 어렵습니다. 
여기에서는 초원심분리법으로 인간 혈장에서 분리한 엑소좀의 특성을 분석하는 반자동 방법인 나노입자 추적 분석(NTA)을 시연합니다. 제시된 결과는 엑소좀의 평균 수와 크기를 측정하는 것뿐만 아니라 분리를 위한 이러한 접근 방식이 주사전자현미경(SEM)과 같은 다른 방법으로 확인된 바와 같이 재현 가능하고 유효한 데이터를 제공한다는 것을 보여줍니다.

이 데모에 사용 된 샘플은 85 %의 민감도, 감도 곡선의 최대 기울기 전에 (그림 2)와 측정을위한 최적의 설정을 보여줍니다. 프로토콜에서 권장하는대로 밝기, 분 / 최대 값이 선택되었다. 5.3 입자의 농도 / ㎖ X 입자의 평균 크기는 대부분이 0.137 μM의, 0.149 ㎛, 10 (6) 동안 측정 하였다. 측정 이후에 접수 된 값은 .pdf 인 파일 형식 또는 데이터베이스로 내보내기위한이 .txt로 보고서에 저장할 수 있습니다. 바람직한로서 프로토콜 (섹션 4)에서 기술 된 바와 같이 그래프가 조정될 수있다. 비디오 시퀀스는 저장되고 나중에 오프 - 라인 분석을 위해 다시 사용될 수있다. 하지만, 이러한 오프 - 라인 분석에서, 카메라의 사전 설정 취득 향적 변경할 수 없다. 측정을위한 최적의 파라미터 설정을 찾기 위해, 여기 설명 토륨100 nm의 폴리스티렌 표준 크기의 예에 장비 설정의 예를 최적화. 두 파라미터, 영상​​ 및 입자 크기 분포에 감도 및 최소 / 최대 크기의 영향을 상세하게 설명한다. 다른 모든 파라미터는 표 1에 요약되어있다. 아날로그 및 디지털 이미지에서 (50-94 범위)의 감도의 영향을 시각적 인상도 3에 가시화된다. 이미지로부터 유도 된 정량 정보는 표 1의 설정에 따라,도 4에 제시되어, 최소 사이즈 = 도 5 및 최대 크기 = 200 감도 대 검출 입자 수의 전형적인 관계는도 4a에 도시된다. 50과 90 사이에 감지 입자의 수​​는 감도 증가 90&gt; 민감도에 대한 극적으로 상승했다. 감도의 최적 범위는 66, 86 (A) 사이에서 발견되었다. 입도 분포는 DIF 얻어ferent 감도 설정도 4b에 표시됩니다. 입도 분포는 세 개의 개별 측정의 평균을 나타낸다. 오히려 가난한 통계 결과 몇 입자를 분석 하였다 너무 낮은 감도 (감도 = 62, 빨간색 곡선)를 참조하십시오. 분석 입자의 수​​는 민감도 증가 70 (노란색 곡선)과 86 (황갈색 곡선) 사이의 최적에 도달했습니다. 또한 작은 크기 (감도 = 94, 파란색 곡선)을 향해 이동 적하 입자 크기 분포의 개수 입도 분포의 열화 감도 이루어져.도 4c의 수를 기반 X50 직경의 추이 (50 %를 나타낸다 입자는 감도 함수로서)이 직경보다 작다. 적색 영역이 불량 통계 (감도가 너무 낮음) 또는 넓은 DISTRI의 결과&gt; 8 % RSD 나타내는 베이지 간격에서, 입자 크기의 RSD는 8 % 이하이고 A.에서 최적 간격에 해당작은 크기 (감도 너무 높은)에 시프트 시킴. 최소 크기, 최대 크기의 설정은 최소 크기보다 작고 최대 크기보다 큰 스폿 크기를 갖는 입자를 제거하기 위해 디지털 영상에 적용되는 필터이다. 빛을 산란 할 수있는 기능으로 인해 입자는 디지털 이미지에 특정 크기의 자리를 만듭니다. 스폿의 크기는 다수의 화소 (PX)로 측정된다. 입자가 아주 잘 (예를 들면, 입자&gt; 200 nm의 또는 집계를) 빛을 산란 할 때, 그 자리 크기는 예를 들어,&gt; 500 픽셀, 아주 큽니다. 스폿 크기는 입자 물질에 따라 작은 입자 (예를 들면, &lt;20 ㎚)에 대한 (예를 들면, &lt;10 PX) 확실히 작다. 그들이 동일하지 않은 이들 두 변수 사이에 직접적인 관계가 없기 때문에 스폿 사이즈 (PX)의 입자 크기 (㎚)로 상호 교환 될 수 없다. 최소 및 최대 크기의 최적화는 사용자가 응집체 (최대 크기) 또는 원하지 않는 작은 물체를 필터링 할 수 있도록이러한 배경 잡음 (최소 사​​이즈) 등의 개체. 100 nm의 표준 크기의 입자 크기 분포의 최대 / 최소 크기의 영향도 4d (감도 = 82)에 도시된다. 간격이 작은 스폿 크기로 설정되어있는 경우 (예를 들면, 분 = 1, 최대 = 52 주황색 곡선), 분석 된 입자의 수가 감소하고 개수를 기반 X50 직경이 약간 작은 크기쪽으로 시프트된다. 큰 반점의 설정 (분 = 40, 최대 = 1000; 붉은 곡선) 넓은 입자 크기 분포의 결과는 큰 크기를 향해 이동했다. 입자의 총 동일한 번호를 얻기 위해서, 오렌지 및 레드 모두 분포 구간 경계는 입자 (80)과 일치하도록 조정 하였다. 최적의 설정으로 분포 (분 = 5, 최대 = 200; 황갈색 곡선은) 360 입자로 구성되어 있습니다. 성공적인 일련의 실험 엑소 좀 초 원심 분리에 의해 단리하고 제시 NTA 시스템을 사용하여 측정하여 수행 하였다. 결과 데이터는 고도로 있었다일관성과 재현성의 높은 수준을 확인했다. 다른 분리 방법은 비슷한 결과를 보여 주어야한다. 그러나, 희석 단계는 특히 중요한 단계로서 식별하고, 산출 된 입자의 총 수에 미치는 영향을 재평가 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> NTA의 설정 그림 1. 도식. 현미경 / 비디오 축과 레이저 빔은 셀 채널 단면에서 횡단 서로 직교하도록 배향된다. 입자에 의해 산란 빛이 소프트웨어의 &quot;라이브 뷰&quot;창에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <stron감도 곡선 대 입자의 g&gt; 그림 2. 번호. 감도 곡선 대 입자의 수는 자동 감도 스캔하는 동안 한 순간에 하나의 위치에있는 입자를 표시합니다. 이 그래픽으로는 초기 측정을위한 최선의 환경 설정을 결정하는 데 사용된다. 감도 값이 그래프의 최대 기울기에 앞서 선택된다. 이 유물이 테스트 실험에서 제거되지 않고 그래프에 영향을 미칠 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요하다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> 라이브 뷰 화면에서 입자의 아날로그 및 디지털 이미지. 시각화에 감도 그림 3. 영향은 모두 아날로그 (맨 윗줄) 50과 94 사이의 감도 표시됩니다D 디지털 (아랫 줄) 전망. 감도가 너무 낮 으면, 단 몇 입자 (왼쪽) 검출된다. 최적의 감도에서 입자는 서로 잘 (가운데)로부터 격리로 하나의 점을 나타납니다. 비교적 높은 감도 입자가 함께 이미지 품질 (오른쪽)로 이어지는 병합에. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> 제어 100 nm의 폴리스티렌 입자 샘플에 대한 민감도 최소 및 최대 크기 설정 그림 4. 영향 (A) 입자의 검출 수 대비 감도의 플롯.; 최적의 간격은 66-86 곡선의 최대 기울기에 앞서있다. (B) 입자 크기 분포는 여러 감도 설정 (62 94에 얻을); (62)이 너무 낮거나 너무 높은 대한 그래프 (94) 감도는 100 nm의 폴리스티렌 대조 시료에 대한 입도 분포를 포착하지 않는다. (C) 감도 대 번호 X50 기반 직경; 베이지 간격 X50의 오차는 8 % 이하가 최적의 간격 (66)에서 입자 크기 분포에 대한 최소 및 최대 크기 (86)의 (D)에 영향이다; 최적의 매개 변수 (분 = 5, 최대 = 200) 제어 샘플에 대한 정확한 분포를 캡처합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 사전 획득 매개 변수 </td></tr><tr><td> 감광도 </td><td> 변수 </td></tr><tr><td> 셔터 </td><td> (40) </td></tr><tr><td> 프레임 속도 </td><td> 30 프레임 </td></tr><tr><td> 해결 </td><td> 안녕GH </td></tr><tr><td> 사이클 </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 여러 인수 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 위치 </td><td> (1) </td></tr><tr><td colspan="2"> 인수 후 매개 변수 </td></tr><tr><td> 최소 밝기 </td><td> (30) </td></tr><tr><td> 최대 크기 </td><td> 변수 </td></tr><tr><td> 최소 크기 </td><td> 변수 </td></tr></tbody></table> 입자 추적 장비의 설정에 대한 사전 및 사후 인수 매개 변수 표 1. 개요.

이 기사에서는 전혈에서 엑소좀을 분리하고 반자동 기기를 사용한 나노 입자 추적에 의한 추가 분석 방법을 제시합니다. 제시된 기술은 액체 현탁액의 입자를 시각화하고 분석하기 위한 매우 민감한 방법을 제공합니다.

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

본 절차의 목적은 나노입자 추적 분석(nanoparticle tracking analysis, NTA) 장비를 이용한 반자동화 방법을 통해 엑소좀의 크기를 분석하고 그 양을 정량화하는 것입니다. 이는 차등 원심분리 단계를 사용하여 인간 혈액에서 엑소좀 펠렛(pellet)을 얻음으로써 수행됩니다. 엑소좀은 적절한 산란 강도를 얻기 위해 초기 혈장 양에 따라 미리 결정된 농도로 재현탁됩니다.NTA 과정 동안, 엑소좀을 더 큰 입자로부터 분리하기 위해 현탁액을 필터링합니다. 그다음, 200 nm 크기의 폴리스티렌 입자가 포함된 대조군 현탁액을 사용하여 NTA 장비의 보정을 수행합니다. 이후 엑소좀 용액을 NTA 장비에 주입하고, 최종 테스트를 실시하기 전 사전 테스트를 통해 NTA의 최적 설정을 선택합니다.궁극적으로, 측정된 모든 입자의 정량화와 입자 크기별 목록을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 각 준비된 엑소좀 용액의 용매와 설정은 최적의 결과를 얻기 위해 개별적으로 수행되어야 하므로, 이 방법의 시연이 매우 중요합니다. 측정되는 엑소좀은 라이브 뷰 모드에서 화면당 약 600개의 입자가 표시될 정도의 농도로 유지되어야 합니다.또한, 측정에 최적의 민감도 범위를 찾기 위해 사전 테스트를 수행해야 합니다. 민감도를 높게 설정하면 더 많은 미세 입자를 시각화할 수 있지만, 배경 소음과 관련된 문제도 함께 증가합니다. 이 절차는 본 연구실의 대학원생인 Anto May가 시연하겠습니다. 엑소좀 준비를 시작하려면, 정맥 천자를 통해 3개의 시트레이트 튜브에 총 9mL의 전혈을 수집하십시오.그런 다음 혈액을 15 mL Falcon 튜브에 붓고, 4 °C에서 1,500 G로 20분 동안 원심분리하여 세포와 혈장 분리를 시작합니다. 상층액을 새로운 15 mL Falcon 튜브로 옮깁니다. 이어서 혈장에서 모든 세포를 제거하기 위해 4 °C에서 2,800 G로 20분 동안 다시 원심분리합니다.세포 제거 혈장(cell-free plasma, CFP)을 초원심분리 튜브에 튜브당 1 mL씩 옮깁니다. 다음으로, 엑소좀을 제거하기 위해 CFP를 4 °C에서 100,000 G로 90분 동안 원심분리합니다. 상층액 900 µL를 제거하고, 초원심분리 튜브에 남은 100 µL의 용액으로 펠렛을 재현탁합니다.900 µL의 PBS를 첨가한 후, 4°C에서 100,000 G로 30분 동안 원심분리합니다. 이전과 마찬가지로 상층액 900 µL를 제거하고, 남은 100 µL로 펠릿을 재현탁합니다. 재현탁액 5~20 µL를 40 mL의 증류수에 옮깁니다.엑소좀을 더 큰 입자로부터 분리하기 위해 현탁액을 450 nanometer 필터로 여과합니다. 입자 추적 장치를 사용하여 입자 크기를 측정하기 위해 이 최종 현탁액을 사용하십시오. 먼저, 소프트웨어 아이콘을 더블 클릭하여 프로그램을 시작합니다.프로토콜 진행 동안 다양한 소프트웨어 탭을 클릭하여 탭 간에 전환하십시오. 화면상의 지침을 따르십시오. 시작 절차를 자동화하려면 세포 품질 확인과 자동 정렬 항목의 확인란을 모두 선택하십시오.필요한 경우 셀 확인 탭의 버튼 A 또는 B를 눌러 이 단계들 중 어느 것이든 개별적으로 반복할 수 있습니다. 폐액을 수집하기 위해 배출구 포트 아래에 비커를 배치하고, 시스템 내에 공기 방울이 유입되지 않도록 주의하십시오. 나노입자 추적 분석(nanoparticle tracking analysis) 또는 NTA 장비의 유입구와 배출구 포트를 열고, 시린지를 사용하여 유입구 포트를 통해 셀 채널로 증류수 10 milliliters를 주입합니다.마지막 양의 물이 주입되는 즉시 입구와 출구 포트를 닫으십시오. 측정 셀에 기포가 없는지 확인하십시오. 'Okay'를 클릭하여 셀 품질 검사를 수행하십시오.소프트웨어는 몇 초 후에 세포 품질 결과를 표시합니다. 소프트웨어의 라이브 뷰 화면에 입자가 여전히 보이거나 품질 검사 결과가 'good' 또는 'poor'인 경우, 측정 셀 L에서 남은 입자가 제거될 때까지 원위부 수분 주입을 반복하십시오. 또한, 입자의 축적을 방지하기 위해 매 측정 후 이 단계를 반복하십시오. 다음으로, 균일한 200 nanometer 크기의 polystyrene 입자가 포함된 대조군 현탁액을 준비합니다. 레이저와 현미경의 초점을 맞추기 위해, 기기 제조사에서 제공한 현탁액 농축액 한 방울을 500 milliliters의 증류수에 첨가하여 라이브 뷰 화면당 600 ± 100개의 입자가 표시되는 필요한 농도로 조제하십시오.증류수 테스트 때와 동일하게 정렬용 현탁액을 NTA 장비에 주입합니다. 이어서 정렬을 시작하는데, 이는 시스템이 두 초점의 최적 위치를 자동으로 찾는 자동화된 루틴입니다. 시스템이 이제 실험 준비가 되었다는 프롬프트가 나타나면, 확인을 클릭하여 측정을 시작합니다.실험 사이에 30% 에탄올 용액으로 셀을 세척하여 셀 채널을 수동으로 주기적으로 청소하십시오. 소프트웨어에 자동 오류 보고서가 표시될 때마다 채널을 세척하십시오. 시스템 측정을 수행하기 위해.먼저, 각 시료 측정 전에 증류수로 채널을 세척하십시오. 그런 다음 엑소좀 현탁액을 채널에 주입하십시오. 다음 단계는 소프트웨어에서 주요 파라미터를 조정하여 감도를 조절하는 것입니다.입자 수 대 감도 그래프를 클릭하여 각 감도 수준별 화면당 측정 입자 수 곡선을 표시함으로써 최적의 감도 범위를 찾으십시오. 곡선의 기울기가 최대가 되기 전의 감도 수준을 선택하십시오. 감도 수준이 높을수록 더 많은 작은 입자를 시각화할 수 있지만, 배경 노이즈와 관련된 문제도 증가합니다.최소 밝기를 조정하려면, 엑소좀 측정 시 시작 밝기를 20으로 설정하십시오. 이 기능을 필터로 사용하려면, 이 매개변수를 조절하여 강한 빛 산란 입자를 제거하십시오. 실험 과정에서 필요에 따라 이 값을 낮추어 약한 산란 아티팩트를 증폭시키고 밝기를 조정하십시오.다음으로, 픽셀 노이즈와 원치 않는 산란 및 과도하게 큰 입자를 제거하기 위해 디지털 필터를 설정합니다. 최소 및 최대 크기를 조절하여, 엑소좀 측정을 위해 10에서 500 픽셀 범위의 값을 사용합니다. 셔터를 300으로 설정하여 카메라가 열려 있는 시간을 3.3 밀리초로 조정합니다.실시간 판독 매개변수를 조정하려면 실험 중 어느 시점에서나 실시간 이미지 버튼을 클릭하여 디지털 뷰 모드와 아날로그 뷰 모드 간에 전환하십시오. 샘플의 포화 상태가 색상 코드로 표시되는 산란 강도 바를 모니터링하십시오.산란 바(scattering bar)가 빨간색인 경우 엑소좀을 분석하지 마십시오. 측정을 시작하려면 측정 탭을 클릭하십시오. 실행 옵션 배열에서 설정을 선택하십시오.각 획득 단계 전에 check movement를 선택하고, 반복적인 check particle drift 테스트를 수행하며, 실험 횟수와 각 실험 사이의 시간 지연을 설정하십시오. 필요한 경우 샘플 확인을 수행하십시오. 마지막으로, run video acquisition 버튼을 클릭하십시오.새 창에서 사이클 횟수와 측정 위치 수를 정의하십시오. 최소 시간 지속 시간을 확인하십시오. 하나의 개별 입자로 계산하기 위해 입자를 추적합니다.비디오 해상도를 설정할 때, 해상도를 낮게 설정하면 추적 지속 시간이 짧아집니다. 마지막으로, 파일 이름을 선택하고 확인을 클릭하여 측정을 시작하십시오. 입자 수 대 민감도 곡선은 특정 순간의 한 위치에 있는 입자들을 보여줍니다.자동 감도 스캔 중에, 그래프의 최대 기울기에 도달하기 전의 감도 값이 선택됩니다. 이 테스트 실험에서는 아티팩트가 제거되지 않으며 이는 그래프에 영향을 줄 수 있습니다. 적절한 감도 값을 설정하기 위해서는 라이브 뷰 화면에서 입자를 시각적으로 확인하는 것이 도움이 됩니다.값이 너무 낮으면 검출되는 입자 수가 적어집니다. 반면 값이 너무 높으면 이미지 품질이 저하되며, 최적의 감도 수준에서는 품질 좋은 입자들이 서로 잘 분리된 단일 점으로 나타납니다. 측정 후 결과 탭에서는 추적된 총 입자 수, 위치당 평균 입자 수 및 입자 농도를 포함한 파라미터와 입자 크기 대비 입자 수의 백분율 수치 비율을 확인할 수 있습니다.측정 후 계산된 그래프는 입자 크기별 분포를 보여줍니다. 디스플레이 모드의 아이콘을 사용하여 그래프 설정을 변경할 수 있습니다. 또한, 엑소좀을 분석하는 다양한 방법이 있습니다.이 방법은 짧은 시간 내에 결과를 생성할 수 있도록 신속한 프로세스로 유사한 방법 분석을 수행하는 매우 간단하고 효율적인 방법을 보여줍니다. 여러 샘플을 비교하기 위해서는 모든 샘플에 대해 동일한 희석 수준을 유지하는 것을 권장합니다. 모든 설정은 감도를 수용하며, 이후 몇 가지 분석 소프트웨어 세트를 사용하여 비디오 해상도를 변경할 수 있습니다.이렇게 하면 엑소좀의 수량과 크기에 대해 서로 다른 실험에서 얻은 데이터를 반자동 방식으로 비교 분석할 수 있습니다.

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연구

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