Protein Aggregate Formation Assay: 프로테아솜 억제제에 의한 유도 시 배양된 세포에서 단백질 응집을 검출하고 정량화하는 방법

세포에서 잘못 접힌 단백질의 제거는 주로 세포 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 조절되며, 여기서 단백질은 작은 조절 단백질인 유비퀴틴에 의해 먼저 인식되고 태그가 지정되며, 가수분해 및 제거를 위해 다중 단백질 복합체인 프로테아좀으로 트래피킹됩니다.

신경퇴행성 질환에서 흔히 발생하는 유비퀴틴-프로테오좀 시스템 활성 장애는 잘못 접힌 단백질이 세포 내에 축적되어 세포 독성 효과가 있는 불용성 단백질 응집체를 형성할 수 있습니다.

시험관 내에서 단백질 응집을 시각화하고 정량화하기 위해, 형질도입된 포유류 세포의 현탁액(노출된 소수성 잔기와 함께 잘못 접힌 형태를 채택하는 형광 표지 돌연변이 단백질을 발현함)을 적절한 배지에서 얻습니다.

이미징 중 배경 형광을 최소화하기 위해 검은색 멀티웰 플레이트의 웰에 프로테아좀 억제제의 농도를 증가시키는 피펫을 사용합니다. 포유류 세포 현탁액을 우물에 시드합니다. 세포가 플레이트 바닥에 부착되어 증식할 수 있도록 배양합니다.

일단 내부로 들어가면 프로테아좀 억제제는 프로테아좀의 단백질 분해 부위에 결합하여 그 활성을 차단하여 발현된 돌연변이 단백질이 축적된 다음 노출된 소수성 잔기를 통해 상호 작용하여 세포질 응집체를 형성하여 결국 세포 사멸로 이어집니다.

형광 DNA 결합 염료를 첨가하여 세포핵을 염색합니다. 플레이트를 이미지화합니다. 형광 돌연변이 단백질 응집체는 염색되지 않은 세포질 내에 분산되어 나타납니다.

프로테아좀 억제제 농도가 높은 웰은 프로테아좀 억제제 농도가 낮은 웰보다 세포 수 대비 단백질 응집체 수가 더 높습니다.

화합물 이송의 경우 384웰 저장 폴리프로필렌 플레이트에 표준 1-3 희석 시리즈로 화합물의 연속 희석액을 추가합니다. 그런 다음 384 모세관 헤드가 장착된 액체 처리기를 사용하여 0.25마이크로리터의 프로테아좀 억제제를 빈 평평한 바닥 검은색 384웰 분석 플레이트에 분배합니다. 그런 다음 이 접시에 1.5 x 10⁴개의 세포를 시드합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다.

프로테아좀 억제제로 처리된 세포주를 이미징하기 전에 염색 용액과 함께 예열된 DMEM 10마이크로리터를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

염색 후 "현미경" 탭을 선택하여 자동 현미경 운영 소프트웨어를 시작합니다. 먼저 "구성" 탭을 선택한 다음 20X 대물렌즈와 올바른 플레이트 유형을 선택합니다.

다양한 플레이트 유형에 적절한 초점을 맞추려면 "칼라"가 대물렌즈의 올바른 값으로 설정되어 있는지 확인하십시오.

그런 다음 '노출 1'을 선택하고 초점 높이를 '0마이크로미터'로 설정한 다음 "초점"을 선택합니다. 초점이 맞춰지면 카메라 1을 노출시킵니다.

노출 평면을 최적화하려면 초점 높이를 조정하고 "Take Height"를 클릭하십시오. 최대 픽셀 강도 약 3,000으로 레이저 출력의 노출 시간을 변경하고 노출 매개변수를 저장합니다.

"실험 정의" 탭을 선택합니다. 레이아웃 및 하위 레이아웃을 만듭니다. 그런 다음 관련 레이아웃, 노출, 참조 이미지, 기울기 자르기 파일 및 하위 레이아웃을 끌어다 놓습니다. 그런 다음 실험을 저장합니다.

마지막으로 "자동 실험" 탭을 선택하고 이미지를 획득합니다. 2채널 이미지의 경우 먼저 소프트웨어 알고리즘을 선택하여 핵, 세포질 및 응집체와 같은 기본 개체를 분할합니다.