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생물학적 기술
0 조회수 • 4:12 분 • July 8th, 2025
세포에서 잘못 접힌 단백질의 제거는 주로 세포 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 조절되며, 여기서 단백질은 작은 조절 단백질인 유비퀴틴에 의해 먼저 인식되고 태그가 지정되며, 가수분해 및 제거를 위해 다중 단백질 복합체인 프로테아좀으로 트래피킹됩니다.
신경퇴행성 질환에서 흔히 발생하는 유비퀴틴-프로테오좀 시스템 활성 장애는 잘못 접힌 단백질이 세포 내에 축적되어 세포 독성 효과가 있는 불용성 단백질 응집체를 형성할 수 있습니다.
시험관 내에서 단백질 응집을 시각화하고 정량화하기 위해, 형질도입된 포유류 세포의 현탁액(노출된 소수성 잔기와 함께 잘못 접힌 형태를 채택하는 형광 표지 돌연변이 단백질을 발현함)을 적절한 배지에서 얻습니다.
이미징 중 배경 형광을 최소화하기 위해 검은색 멀티웰 플레이트의 웰에 프로테아좀 억제제의 농도를 증가시키는 피펫을 사용합니다. 포유류 세포 현탁액을 우물에 시드합니다. 세포가 플레이트 바닥에 부착되어 증식할 수 있도록 배양합니다.
일단 내부로 들어가면 프로테아좀 억제제는 프로테아좀의 단백질 분해 부위에 결합하여 그 활성을 차단하여 발현된 돌연변이 단백질이 축적된 다음 노출된 소수성 잔기를 통해 상호 작용하여 세포질 응집체를 형성하여 결국 세포 사멸로 이어집니다.
형광 DNA 결합 염료를 첨가하여 세포핵을 염색합니다. 플레이트를 이미지화합니다. 형광 돌연변이 단백질 응집체는 염색되지 않은 세포질 내에 분산되어 나타납니다.
프로테아좀 억제제 농도가 높은 웰은 프로테아좀 억제제 농도가 낮은 웰보다 세포 수 대비 단백질 응집체 수가 더 높습니다.
화합물 이송의 경우 384웰 저장 폴리프로필렌 플레이트에 표준 1-3 희석 시리즈로 화합물의 연속 희석액을 추가합니다. 그런 다음 384 모세관 헤드가 장착된 액체 처리기를 사용하여 0.25마이크로리터의 프로테아좀 억제제를 빈 평평한 바닥 검은색 384웰 분석 플레이트에 분배합니다. 그런 다음 이 접시에 1.5 x 104개의 세포를 시드합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다.
프로테아좀 억제제로 처리된 세포주를 이미징하기 전에 염색 용액과 함께 예열된 DMEM 10마이크로리터를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
염색 후 "현미경" 탭을 선택하여 자동 현미경 운영 소프트웨어를 시작합니다. 먼저 "구성" 탭을 선택한 다음 20X 대물렌즈와 올바른 플레이트 유형을 선택합니다.
다양한 플레이트 유형에 적절한 초점을
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