Name: 이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: 학습하세요 HEK-293T 세포를 이용한 형광 현미경법으로 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용을 측정하는 방법을. 이 기술은 돌연변이가 결합 능력에 미치는 영향을 탐구하여 신경발달 및 중독 장애의 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 국립 정신 건강 연구소 (R00MH103531 및 R01MH1116901 에서 J.A.), 국립 일반 의학 연구소 (T32GM0007635에서 S.R.R.)의 박사 전 교육 보조금, 고급 연구를위한 리다 힐리엄 펠로우십 (GT1101.R.1)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 현미경에 도움을 케빈 울프리 박사, 그의 전형 현미경의 사용에 대한 박사 K 울리히 바이엘, 그리고 토마스 수호프 (스탠포드 대학) LRRTM2 플라스미드에 대한 도움을 감사드립니다.

1. 세포 배양 및 형질
<ol><li>DMEM, 1x (덜벡코의 독수리 매체 수정)로 HEK 세포 미디어를 4.5 g/L 포도당, L 글루타민 및 나트륨 피루바테 및 10% FBS로 보충합니다. 멸균 필터.</li>
	<li>집계 분석에 적합한 리간드 및 수용체를 미리 결정합니다. 참고: Neurexin3α SS4+/-와 알려진 리간드 중 하나인 LRRTM2가 이 연구에서 사용되었습니다. 리간드 및 관심 수용체는 pcDNA3.1에서 cDNA로부터 발현되었다. 깁슨 어셈블리는 neurexin3α를 pcDNA3.112에삽입하는 데 사용되었다. 노이렉신3α F/R: TTTAAACTTAAGTAGTACCTACCGAGCTCGGATCCCACCATGAGCTCTACCCTCCACTCACTC/ GAGCGGCCGCCACTGTGTGTTGATATCTGCAATTCTTACAATAATAATAATAATACTCCTTGTTTCCTTTT.</li>
	<li>HEK293T 셀을 준비합니다.<ol>
<li>HEK293T 세포를 하나의 T-75 플라스크에 합류하게 성장시다.</li>
		<li>일단 컨서블, 트립신의 2 mL을 사용하고 2 분 동안 37 ° C 인큐베이터에 배치합니다. 6mL의 HEK 미디어를 플라스크에 추가하여 세포를 재일시 중단하고 8mL를 모두 15mL 원추형 튜브로 옮기습니다.</li>
		<li>500 x g에서 펠릿5 분 및 총 8 mLHEK 세포 매체에서 재중단.</li>
		<li>세포를 계산하고 6 웰 플레이트의 각 우물에 735,000 세포를 추가합니다. HEK 셀 미디어를 사용하여 각 웰에 대해 최종 볼륨을 2mL로 조정합니다.</li>
		<li>37°C 인큐베이터에 배치하고 세포가 하룻밤 사이에 또는 50-60 % 합류에 도달 할 때까지 성장 할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>칼슘인산법(13)을이용한 트랜스펙트 HEK293T 세포.<ol>
<li>형광 단백질 1 μg (pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- 및 mCherry 1 μg의 3 μg)를 가진 관심 및 공동 트랜스펙트의 단백질 3 μg를 가진 Transfect well-1.</li>
		<li>1.4.1 단계에서와 같이 Transfect 잘 -2. 그러나 관심의 돌연변이 단백질 (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>다른 형광 단백질의 1 μg (pcDNA3.1 LRRTM2 및 GFP의 1 μg)의 1 μg와 관심 및 공동 트랜스 펙트의 3 μg와 트랜스펙트 웰 -3.</li>
		<li>트랜스펙트 웰-4와 잘-5 부정적인 컨트롤 역할을: 잘-4 GFP의 1 μg와 잘-5 mCherry의 1 μg.</li>
		<li>추가 조건 이나 컨트롤을 필요로 하는 경우 다른 플레이트를 준비 (단계 1.4.1-1.4.4) 추가 조건 또는 컨트롤을 필요로하는 경우 (Neurexin3αWT / A687T SS4+). 참고: 형광 효율은 상형광 현미경으로 형광 현미경으로 24시간 경과한 후 분석되고, 형광 단백질을 발현하는 세포의 수로 정량화된다. 보다 유선형적인 접근법은 형광 단백질과 관심의 리간드에 대한 비거스트로닉 벡터 코딩을 가진 HEK 세포의 전환을 포함하고 공동 형질 보다 높게 권장됩니다. 이 연구의 경우, 알파 뉴렉신은 ~4.3 kb이며 형광 강도가 낮으며, 동회용을 필요로 하는 이두근시스템을 사용하여 관찰되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>이식 후 48시간, 집합을 위해 세포를 수확합니다.<ol>
<li>PBS로 두 번 잘 씻으시면 됩니다.</li>
		<li>PBS에 1mM EDTA1mL을 각 웰에 추가하여 세포 간 상호 작용을 부드럽게 분리하고 37°C에서 5분 동안 배양판을 배양합니다. 참고: 트립신은 연구에서 접착 분자의 잠재적인 단백질 분석 분열로 인해 1.5.2 단계에 권장되지 않습니다. 또한 EDTA 추가 후 세포가 주변 조건에 노출되기 때문에 완료될 때까지 프로토콜이 중지되지 않을 수 있습니다.</li>
		<li>부드럽게 세포를 분리하기 위해 접시를 누르고, 별도의 15 mL 원추형 튜브로 각각을 잘 수확.</li>
		<li>원심분리기 원심분리관은 500 x g, 실온은 5분 동안 드실 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포가 펠릿화하는 동안 각 상태의 각 미세 원심 분리기 튜브의 상단을 표시하여 6 개의 배양 튜브를 준비하십시오. 참고: GFP 및 mCherry 조건의 각 순열은 모든 실험 조건과 적절한 제어를 포괄하는 데 사용되어야합니다. 예: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/노이렉신3αWT SS4--mCherry, 4. GFP/뉴렉신3αA687T SS4- -mCherry, 5. 뉴렉신3αWT SS4--mCherry/LRRTM2-GFP, 6. 뉴렉신3αA687T SS4- -mCherry/LRRTM2-GFP. 추가 조건 및 제어를 수용할 수 있도록 튜브를 추가로 만듭니다.</li>
	<li>10mM CaCl2 및 10mM MgCl2로 37°C로 따뜻해진 HEK 매체의 500 μL에서 상체 및 재중단 세포를 제거합니다. 참고: CaCl2 및 MgCl2를 추가하면 접착 분자가 결합을 재확립할 수 있으며 문제의 세포간 상호 작용 파트너가 접착을 위해 이원양이온을 필요로 하는 경우에만 필요합니다.</li>
	<li>각 15mL 원문관의 세포를 혈류계와 알리쿼트 200,000개의 세포를 1.6.1 단계부터 적절한 튜브로 사용하여 500 μL의 총 부피에서 1:1 혼합을 계산한다. 참고: 조건당 5분만 계산하고 알리쿼트 금액이 소요됩니다.</li>
	<li>느린 튜브 회전기에서 실온에서 튜브를 배양합니다.</li>
</ol>2. 이미지 수집
<ol><li>특정 샘플에 대한 현미경 획득 매개 변수를 최적화합니다. 이 예에서는, 심상은 넓은 필드 현미경에서 촬영되었습니다. 5배 공기 목표 사용(NA: 0.15; WD: 20000 μm) 분석을 위한 충분한 필드를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>1.8 단계에서 HEK 세포의 두 조건을 혼합한 직후 기준집계를 평가한다. 이제 '시간 제로' 이미지입니다.<ol>
<li>488 및 561 채널 모두에서 형광 하에서 충전 된 현미경 슬라이드 및 이미지에 각 샘플 혼합물의 Pipette 40 μL.</li>
		<li>샘플 드롭당 하나의 포커스 평면에서 세 가지 보기 필드를 획득합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>'시간 60' 이미지로 60분 만에 최종 이미지를 획득합니다.<ol>
<li>60분 배양 후 혼합물의 '시간 60' 이미지를 얻으려면 각 샘플을 회전 튜브및 파이펫에서 각 피펫에서 각 조건의 40 μL 샘플을 충전된 슬라이드로 가져 가십시오. 2.2.2 단계와 같은 이미지. 참고: 포화가 발생할 때까지 세포 집계는 15분마다 검사해야 합니다. 집계의 타이밍은 테스트되는 단백질에 따라 달라집니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 이미지 J/피지 분석
<ol><li>피지/ImageJ를 사용하여 집계 범위를 정량화하려면 분석 파일을 저장합니다.<ol>
<li>제공된 보충 코딩 파일을 컴퓨터의 imageJ 매크로 폴더에 저장합니다.</li>
		<li>제공된 집계 매크로를 설치합니다(플러그인, 매크로, 설치 및 "집계분석.txt" 파일을 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>임계값을 결정합니다.<ol>
<li>'시간 제로' .tif 파일을 이미지J로 로드하고 채널을분할(이미지 | 색상 | 분할 채널). 참고: '시간 제로' 이미지는 전체 실험에 대한 임계값과 가장 작은 말장난 크기를 결정하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>각채널(플러그인 | 매크로 | AggregationAssay_MakeMask). 이미지 창에서 마스크를 만들면 표시됩니다. 이미지에 대한 임계값 결정 옆에 있는 확인란을 확인하고 히스토그램에서 클러스터 Params를 결정하고 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>슬라이드 막대를 사용하여 이미지의 임계값을 결정하고 슬라이드 막대오른쪽에 숫자를 기록하고 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>클러스터 크기의 히스토그램이 나타납니다. 실험에 맞는 히스토그램에서 클러스터 크기를 선택하고, 이 숫자를 최소 클러스터 크기: 상자에 입력하고 확인을 클릭합니다. 이 크기 이하의 클러스터는 분석되지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석을 실행합니다.<ol>
<li>이미지J에서 조건 1의 '시간 60' 이미지를 열고 3.2.1 단계와 같이 채널을 분할합니다.</li>
		<li>각 채널(플러그인, 매크로, AggregationAssay_MakeMask)을 마스크합니다. 3.2.3 단계 및 3.2.4 단계에서 결정된 동일한 임계값 및 크기를 사용합니다. 이미지에 대한 임계값 결정 옆에 있는 상자를 선택 취소하고 히스토그램에서 클러스터 Params를 결정하고 크기와 임계값을 해당 필드에 수동으로 입력한 다음 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>집계 지수(플러그인 | 계산 매크로 | AggregationAssay_CalculateOverlap). 비교할 마스크채널과 결과 파일이 저장되는 디렉토리를 선택합니다.</li>
		<li>모든 조건에서 '시간 60' 이미지당 3.3.1-3.3단계를 반복합니다. 참고: 집계 인덱스는 100을 곱한 중첩 영역을 뺀 두 채널 영역의 합으로 나눈 총 중첩 영역으로 정의됩니다(집계 인덱스 = 중첩 영역/[채널 1 + 채널 2의 영역 ] 중첩 영역] x 100). 이 정규화는 두 마스크 채널 간의 'OR' 동작으로 두 마스크의 총 픽셀을 나타냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
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<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
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<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
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<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
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<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
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<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
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</ol>

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세포 접착 중에 트랜스에서 발생하는 단백질 단백질 상호 작용을 해부하면 성숙 및 리모델링 중에 시냅스의 형성, 기능 및 유지 관리를 포함한 기본 세포 과정의 근본적인 분자 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 세포 대 세포 상호 작용의 의미는 신경 생물학을 넘어 확장하고 신호 전달, 세포 이동 및 조직 발달에 있는 더 넓은 역할을14. 세포 유착의 수차는 적절한 세포 기능에 필수적인 세포 과정을 방해할 수 있으며 암, 관절염, 중독, 자폐증 및 정신 분열증1,15,16과같은 다양한 식각을 저해할 수 있다. 여기서, 우리는 트랜스에서 세포 접착 상호 작용을 테스트 할 수 있도록 HEK 세포 집계와 관련된 최적화 된 상세한 프로토콜을제공합니다.
이 HEK 세...

시냅스 접착 분자에 의해 촉진되는 시냅스 상호 작용은 시냅스의 개발, 조직, 사양, 유지 보수 및 기능 및 신경망 의 생성을 위한 기초입니다. 이러한 신혈 세포 접착 분자의 식별은 급속히 증가하고 있습니다. 따라서, 결합 파트너를 식별하고 이러한 새로운 접착 분자가 서로 상호 작용하는 방법을 이해하는 것이 근본적으로 중요합니다. 추가적으로, 게놈 순서는 일반적으로 신경 발달, 신경 정신병및 중독무질서1의 다수에 연결되는 이 접착 분자의 많은에서 돌연변이를 확인했습니다. 시냅스 세포 접착 분자에 대 한 코드 유전자에 돌연변이 는 해로운 트랜스 상호 작용을 변경 하 고 시 냅 스 형성 및 유지 보수에 병 리 학적 변경에 기여할 수 있습니다.
여러 분석법은 이소성 열량, 원형 이윤술, 표면 플라스몬 공명2와 같은 단백질 단백질 상호 작용을 정량적으로 평가하기 위해 존재하며 자연에서 정량적이지만 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 그들은 재조합 단백질을 필요로, 때로는 길고 지루한 정제 단계를 요구. 둘째, 정교한 특수 장비와 기술 전문 지식이 필요합니다. 셋째, 생체 내 막에 자연적으로 테더드되는 단백질 간의 시스 및 트랜스 상호 작용을 모두 허용하므로 결합의 정도를 과대 평가할 수 있습니다. 여기에서 우리는 트랜스 상호 작용을 독점적으로 테스트하는 간단하고 비교적 빠른 분석서를 제안합니다.
정제된 단백질 분석과 관련된 많은 합병증을 우회하기 위해, 우리는 감소된 이종 세포 시스템에서 트랜스 상호 작용을 재구성하는 세포 기지를 둔 단백질 상호 작용 분석서를 최적화했습니다. 이 분석은 이전에 세포 간 상호 작용을 연구하기 위해 다양한 형태로 사용되었습니다. 이 접근법에서, 후보 세포 접착 분자는 HEK293T 세포로 전형된다. 생리학적 조건에서 HEK293T 세포는 자가 응집을 나타내지 않아 이 분석에 대한 모범적인 모델을 만듭니다. 그러나, 수용체와 리간드를 발현하는 HEK 세포의 개별 집단이 결합될 때, 수용체의 결합과 HEK 세포의 리간드 힘 응집이 발생한다. 이 집계는 트랜스 상호 작용에 의해 독점적으로 중재되며 일반적으로 수십 분 안에 관찰 할 수 있습니다. 이 방법에서는 단백질 정화 단계가 필요하지 않으며, 이 방법의 효율은 cognate 접착 분자를 발현하는 HEK 세포의 인구가 결합되고 수십 분 후에 만 이미지되는 패러다임에 의존한다. 또한, 이 방법은 항체나 비용이 많이 드는 장비가 필요하지 않습니다. 데이터 수집에 필요한 유일한 장비는 표준 형광 현미경입니다. 이 세포 기지를 둔 분석기의 추가 이점은 트랜스 상호 작용에 질병 관련 점 돌연변이의 효력을 빨리 검열하는 기능입니다. 이는 관심 있는 단백질의 돌연변이 변이체의 cDNA를 가진 HEK 세포를 배분하여 수행될 수 있다.
이 프로토콜에서, 우리는 우리가 심각한 지적 장애 및 간질로 진단된 환자에서 확인된 Neurexin3α (Neurexin3αA687T)에있는 잘못된 감각 돌연변이가, 류신이 풍부한 반복 막 단백질 2 (LRRTM2)와 트랜스에서 상호 작용을 변경하는지 여부를 조사하는 예를 제시합니다. Neurexin3α는 사전 시냅스 세포 접착 분자의 진화적으로 보존된 가족의 일원이며, 최근 연구는 시냅스3,4,5,6,7,이 분자및 뉴렉신 가족의 모든 구성원에 대한 당사의 시냅스 이해에서 여러 역할을 확인했지만 불완전하다. LRRTM2는 시냅스 형성 및 유지 보수8,9,10에참여하는 흥분포스트 냅틱 세포 접착 단백질이다. 중요 한 것은, LRRTM2 독점적으로 스플라이스 사이트 4 대체 엑슨 (SS4-) 부족 하지만 스플라이스 사이트 4 대체 엑슨을 포함 하는 뉴렉신 등소와 상호 작용 4 대체 엑슨 (SS4+). Neurexin3α에서 확인된 인간 잘못된 감각 돌연변이(A687T)는 진화적으로 보존되고 모든 알파 뉴렉신7사이에 보존되는 연구되지 않은 세포외 지역에 위치한다. 이 두 분자 간의 상호 작용이 확립됨에 따라8,9,11,우리는 질문을 제기 : Neurexin3α SS4- LRRTM2의 결합 능력은 A687T 포인트 돌연변이에 의해 변경? 이 분석서에 따르면 A687T 점 돌연변이는 예기치 않게 Neurexin3α에서 LRRTM2로의 응집을 강화하여 점 돌연변이가 있는 세포외 영역이 신내 상호 작용을 중재하는 역할을 한다는 것을 시사합니다.

<table><tbody><tr><td>스냅 캡이 있는 1.5mL 일회용 마이크로튜브</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>HEK 세포의 혼합 집단</td></tr><tr><td>배양 1000mL Rapid&mdash; 플로우 필터 장치, 0.2 um aPES 멤브레인</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>HEK 매체 15</td></tr><tr><td>mL SpectraTube 원심분리기 튜브</td><td>살균 Ward' s Science</td><td>470224-998</td><td>HEK 세포 6</td></tr><tr><td>웰 멸균 조직 배양 플레이트</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>HEK 세포 배양</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마</td><td>223506-500G</td><td>인산칼슘 형질주입, HEK 세포 재현탁</td></tr>액 <tr><td>원심분리기- Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Laboratory 제품</td><td>75004377</td><td>HEK 세포</td></tr><tr><td>CO2 세포 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>성장 중 HEK 세포 배양</td></tr><tr><td>DMEM, 1x(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>HEK 세포 유지</td></tr><tr><td>관리 Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>계류 / 수확 HEK 세포</td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산</td><td>시그마</td><td>ED-500G</td><td>수확 HEK 세포</td></tr><tr><td>Falcon 배기 배양 플라스크, 75cm2 성장 면적</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>HEK 세포 배양</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마</td><td>17L184</td><td>HEK 세포 유지 보수</td></tr><tr><td>HEK293T 세포</td><td>ATCC</td><td></td><td>모델 시스템</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>이미지 분석</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>시그마</td><td>M9272-500G</td><td>HEK 세포 재현탁</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 무수</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>인산칼슘 형질주입</td></tr><tr><td>트립신 0.25%(1X) 용액</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>Passaging HEK 세포</td></tr><tr><td>튜브 로테이터</td><td></td><td></td><td>HEK 세포 혼합 집단의 배양</td></tr><tr><td>UltraClear 현미경 슬라이드. 화이트 프로스트, 양전하</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>이미지 획득</td></tr><tr><td>광시야 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>이미지 획득</td></tr></tbody></table>

이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

세포 인터페이스에서 단백질 상호 작용은 조직 발달과 암 진행에서 시냅스 형성 및 유지 보수에 이르기까지 다양한 생물학적 결과를 지시합니다. 이러한 근본적인 상호 작용의 대부분은 트랜스에서 발생하고 일반적으로 막 고정 결합 쌍을 표현하는 세포 사이의 이기성 또는 동종 작용에 의해 유도된다. 질병 관련 돌연변이가 어떻게 이러한 근본적인 단백질 상호 작용을 방해하는지 설명하면 무수한 세포 생물학 분야에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 많은 단백질 단백질 상호 작용 소법은 전형적으로 시스와 트랜스 상호 작용 사이에 비약적이지 않으며, 이는 잠재적으로 생체 내에서 발생하는 결합의 정도의 과대 평가로 이어지고 단백질 및 /또는 전문 모니터링 장비의 노동 집약적 정제를 포함합니다. 여기서, 우리는 긴 단백질 정제 또는 특수 장비없이 트랜스 상호 작용의 관찰 및 정량화를 허용하는 최적화 된 간단한 프로토콜을 제시한다. HEK 세포 집계 분석법은 HEK 세포의 2개의 독립적인 인구의 혼합을 관련시킵니다, 각각 막 결합 된 cognate 리간드를 표현합니다. 짧은 잠복기 후에 는 샘플이 이미지화되고 결과 골재가 정량화됩니다.

A687T 돌연변이는 LRRTM2 7에 결합하는 Neurexin3α SS4-결합을 증가시킵니다. 두 개의 알려진 시냅스 단백질의 세포 간 상호 작용이 지적 장애 및 간질을 가진 환자에서 발견되는 포인트 돌연변이의 도입에 의해 어떻게 영향을 받는지 조사하기 위해 위의 HEK 세포 집계분석(도 1)을사용했습니다. 세포는 섹션 1에 따라 전과되었고 프로토콜의 섹션 1 과 2에 따라 이미징을 준비하였다. 셀은 예상대로 집계가 관찰되지 않은 기준선에서 이미지화되었습니다(도시되지 않음). 60분에서 획득한 이미지는 프로토콜의 섹션 3과 같이 분석되었다. 선택 편향을 최소화하기 위해 실험자가 시각을 멀게 하기 위해 조건은 무작위로 생성되었습니다. 비슷한 이유로 모든 이미지의 전체 시야가 ROI로 선택되었습니다.
세포가 임의의 시냅스 리간드(GFP/mCherry)를 발현하지 않은 조건은...

여기서, 우리는 형광 현미경을 사용하여 이종 세포 시스템에서 트랜스에서 리간드 수용체 상호 작용을 신속하고 반정적으로 측정하는 최적화된 프로토콜을 제시한다.

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

세포 기반 분석을 통해 장시간의 단백질 정제 또는 특수 장비 없이 트랜스 접착 상호 작용을 관찰하고 정량화할 수 있습니다. 여기에서 테스트된 단백질 상호 작용은 신경생물학과 관련이 있지만, 이 방법은 단백질 접착이 세포 간에 발생하는 모든 연구 분야에 적용될 수 있습니다. HEK-293T 세포를 transfection한 후 48시간 후에 응집을 위해 6웰 플레이트에서 세포를 수확합니다.먼저 PBS로 각 우물을 두 번씩 씻습니다. 다음으로, 세포를 부드럽게 분리하기 위해 각 웰에 10밀리몰 EDTA 1밀리리터를 첨가한 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양 5분 후, 플레이트를 부드럽게 두드려 세포를 분리하고 각 웰을 별도의 15ml 원뿔형 튜브로 채취합니다.튜브를 500 x g의 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포가 펠릿화되는 동안 실험 조건으로 미세 원심분리기 튜브의 상단에 라벨을 부착하여 6개의 배양 튜브를 준비합니다. GFP 및 mCherry의 모든 순열을 사용해야 합니다.15 밀리리터 원뿔형 튜브에서 상층액을 제거하고 500 마이크로리터의 배지에 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 각 원뿔형 튜브의 세포를 세십시오. 그런 다음 각 조건에서 200, 000 개의 세포를 적절한 배양 튜브로 분주시켜 총 500 마이크로 리터 용량의 일대일 혼합을 수행합니다.다음 섹션에 설명된 기준선 응집을 평가한 후 배양 튜브를 실온의 느린 튜브 회전기에 넣습니다. 응집을 평가하기 위해 기준선에서 그리고 60분 후에 다시 배양 튜브에서 40마이크로리터를 충전된 현미경 슬라이드에 피펫팅합니다. baseline acquisition은 microcentrifuge tube에 세포를 추가한 후 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.녹색 채널과 빨간색 채널 모두에서 형광 아래의 슬라이드를 이미지화합니다. 각 슬라이드에 대해 하나의 초점면에서 세 가지 다른 시야의 이미지를 캡처합니다. HEK-293T 세포를 관심 단백질, 돌연변이 관심 단백질 또는 관심 리간드로 transfection하고 형광 단백질과 함께 transfection했습니다.관심있는 단백질을 발현하는 세포 집단을 관심의 리간드를 발현하는 세포 집단과 혼합하고 60분 후에 응집을 위해 평가했습니다. 녹색 및 빨간색 채널에서 캡처된 이미지의 오버레이에서 집계는 노란색 반점으로 나타납니다. 세포가 시냅스 리간드를 발현하지 않는 조건은 최소한의 응집을 보여주었습니다.또한, 두 집단 중 하나만 시냅스 리간드를 발현하는 경우 최소한의 응집이 나타났습니다. 두 세포 집단이 호환되지 않는 접착 분자를 발현할 때 응집이 나타나지 않았습니다. 호환 가능한 접착 분자를 가진 조건은 60분 배양 후 상당한 응집을 나타냈습니다.놀랍게도, 돌연변이된 관심 단백질은 야생형 단백질보다 훨씬 더 많은 응집을 보였는데, 이는 점 돌연변이가 단백질 결합 능력을 향상시킨다는 것을 시사합니다. 많은 접착 분자의 돌연변이는 일반적으로 신경 발달 장애, 신경 정신 질환 및 중독 장애와 관련이 있습니다. 이 기술을 사용하면 트랜스 상호 작용에 대한 질병 관련 점 돌연변이의 영향을 스크리닝할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 프로테아좀 억제제를 사용하여 프로테아좀 활성을 차단하여 형광 표지에 융합된 잘못 접힌 돌연변이 단백질이 유비퀴틴 의존성 프로테아솜 분해를 겪어 세포 세포질 내에 축적되는 것을 방지하는 세포 기반 단백질 응집 분석을 시연합니다. 그런 다음 단백질 응집체를 시각화하고 형광 현미경으로 정량화합니다.

Protein Aggregate Formation Assay: 프로테아솜 억제제에 의한 유도 시 배양된 세포에서 단백질 응집을 검출하고 정량화하는 방법

이 비디오에서는 HEK 세포 응집 분석을 통해 시냅스 세포 접착 분자 간의 세포 간 상호 작용을 측정하는 기술을 보여줍니다. 이 분석에서는 원하는 시냅스전 세포 접착 분자와 형광 단백질을 발현하는 동일한 수의 HEK 세포를 시냅스후 세포 접착 분자 및 다른 형광 단백질을 발현하는 HEK 세포와 혼합합니다. 세포 접착 분자 간의 상호 작용은 세포를 응집시키며, 이는 형광 현미경으로 측정할 수 있습니다.

Cell Adhesion Molecules 간의 Trans Interaction을 검출하기 위한 Cell Aggregation Assay

이 비디오에서는 표지되지 않은 과발현 단백질과 소분자 사이의 단백질-리간드 상호 작용을 연구하기 위한 세포 내 핵 자기 공명 분광법 기술을 시연합니다. 성공적인 리간드-단백질 상호 작용은 원래 피크를 점차적으로 대체하는 관심 스펙트럼 영역에 추가 피크 세트의 출현으로 시각적으로 확인됩니다.

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세포 생존 능력은 단백질 misfolding의 적시에 효율적 관리에 따라 달라집니다. 흠의 refolding, 열화, 또는 격리 : 우리는 여기 misfolded 단백질의 다른 잠재적 인 운명을 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 Ubc9, 접이식 센서의 사용을...

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여기에서는 추정 세포 접착 분자의 고유 접착 특성을 특성화하기 위한 간단하고 빠른 방법을 제시합니다.  세포 접착 분자의 분비된 에피토프 태그가 붙은 엑토도메인(ectodomain)은 작고 균일한 기능화된 비드의 배양 배지에서 캡처됩니다.  그런 다음 이러한 beads를 간단한 bead aggregation assay에 즉시 사용할 수 있습니다.

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세포 내 저장소에서 Ca2+ 방출을 매개하는 호모-테트라머 이온 채널인 리아노딘 수용체의 올리고머화는 골격근 및 심장 근육 수축에 중요합니다. 여기에서는 단백질 자가 결합을 감지하고 호모올리고머 화학량론을 결정하기 위한 상호 보완적인 in vivo 및 in vitro 방법을 제시합니다.

대한 유전 및 생화학 적 접근<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 단백질 올리고머의 평가 다음 Ryanodine 수용체 사례 연구

이 프로토콜 중재-셀 상호 작용, 즉 단백질 세포 접합, 살아있는 세포에 직접에 단백질 간의 상호 작용을 조사 하는 형광 변동 분광학 기반 방식을 설명 합니다. 우리 악기 교정, 데이터 수집 및 분석, 보정 가능한 인 위 소스에 자세한 지침을 제공 합니다.

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

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Caenorhabditis elegans에서 자동 포함 계수를 사용하여 생체 내에서 단백질 응집 동역학 모니터링

여기에서는 일련의 호환 가능한 벡터를 사용하여 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명한 다음 시험관 내에서 조립할 수 없는 단백질 복합체를 연구하기 위한 기존의 풀다운 기술을 설명합니다.

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

학습하세요 HEK-293T 세포를 이용한 형광 현미경법으로 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용을 측정하는 방법을. 이 기술은 돌연변이가 결합 능력에 미치는 영향을 탐구하여 신경발달 및 중독 장애의 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

이종 세포 시스템에서 단백질 응집을 통한 세포 간 상호 작용 측정

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