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간섭 반사 현미경을 사용하면 동적으로 성장 및 수축하는 미세소관을 이미징할 수 있습니다.
하나의 커버슬립에 파라핀 스트립을 고정하고 그 위에 약간 작은 커버슬립을 놓습니다. 가열하여 파라핀을 녹여 밀봉된 채널을 형성합니다. 채널을 통해 항체 함유 용액을 피펫팅합니다. 항체는 커버슬립 표면에 부착됩니다. 차단 용액을 추가하여 항체가 결합되지 않은 영역을 차단하고 비특이적 단백질 결합을 방지합니다.
커버슬립을 현미경 스테이지에 놓습니다. 시료 히터를 미세소관 성장을 촉진하는 온도로 설정합니다.
비가수분해성 구아노신 삼인산, GTP, 유사체로 안정화된 피펫 미세소관 종자. 종자는 항체로 코팅된 커버슬립에 결합합니다. 표지되지 않은 튜불린, GTP 및 환원제를 포함하는 완충액을 추가합니다.
최적의 온도 및 완충 조건에서 종자는 핵 형성 부위 역할을 하여 표지되지 않은 튜불린 결합 및 미세소관 성장을 허용합니다.
이미징을 시작합니다. 입사광은 조리개 다이어프램을 통해 빔 스플리터 (beam splitter) 에 초점을 맞추어 빛을 부분적으로 대물렌즈에 반사하여 샘플을 비춥니다. 커버슬립의 유리 완충 인터페이스는 입사광을 부분적으로 반사합니다. 나머지 입사광은 버퍼-미세소관 계면을 통과하여 반사됩니다.
미세소관-커버슬립 거리를 기준으로 두 인터페이스에서 반사된 빔이 간섭하여 건설적 간섭(밝은 신호를 생성하기 위해 결합된 빔) 또는 파괴적 간섭(빔이 상쇄되어 어두운 신호를 생성합니다).
미세소관을 고대비 이미지로 시각화합니다. 타임랩스 이미지를 캡처하여 미세소관의 성장 및 수축을 감지합니다.
시작하려면 적절한 필터 큐브를 사용하여 형광 현미경의 필터 휠에 50/50 거울을 삽입합니다. 거울에는 반사 방지 코팅이 되어 있으므로 주의해서 다루십시오. 높은 개구수를 가진 고배율 대물렌즈로 전환하십시오. 여기에 표시된 것은 개구수가 1.3인 100x 오일 대물렌즈입니다.
그런 다음 면도날과 현미경 슬라이드를 직선으로 사용하여 3mm 너비의 플라스틱 파라핀 필름 스트립을 절단합니다. 깨끗한 22 x 22mm 커버슬립에 플라스틱 파라핀 필름 스트립 2개를 3mm 간격으로 놓습니다. 그런 다음 스트립 위에 18 x 18mm 크기의 커버슬립을 놓아 채널을 형성합니다.
커버슬립을 섭씨 100도의 열 블록에 10-30초 동안 옮겨 파라핀 필름이 밀봉된 채널을 형성하도록 합니다. 피펫을 사용하여 관류에 의해 항로다민 항체의 밀리리터당 50마이크로그램을 흐르게 하고 슬라이드를 10분 동안 배양합니다.
배양 후, 여과된 BRB80을 사용하여 채널을 5회 세척합니다. 그런 다음 여과된 BRB80에 1% 폴록사머 407을 흘려 비특이적 결합에 대해 표면을 차단하고 슬라이드를 10분 동안 배양합니다. 다시 여과된 BRB80을 사용하여 채널을 5번 세척합니다.
샘플이 건조되는 것을 방지하려면 채널 끝에 여과된 BRB80의 두 방울을 추가하고 필요에 따라 버퍼를 더 추가합니다. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 epi-illumination 광원을 켭니다. 파라핀 필름 가장자리에 초점을 맞춰 샘플 표면을 찾은 다음 필드를 이동하여 시야를 챔버 중앙으로 설정합니다. 광학 경로 내에서 광학 장치의 빛의 역반사로 인해 대물렌즈가 위아래로 움직일 때 여러 표면을 관찰하게 됩니다.
그런 다음 필드 다이어프램을 반쯤 닫고 조정 나사를 사용하여 시야의 중앙에 위치시킵니다. 다이어프램이 제대로 정렬되면 다시 엽니다. 그런 다음 Bertrand 렌즈를 밀어 대물렌즈의 출구 동공이라고도 하는 후방 초점면을 봅니다.
출구 동공의 가장자리 너머로 조리개 다이어프램을 닫고 조정 나사를 사용하여 출구 동공을 기준으로 조리개 다이어프램을 중앙에 놓습니다. 조리개 다이어프램을 열고 가장자리를 출구 동공의 가장자리와 일치시켜 다시 확인하십시오. 그런 다음 조리개 조리개를 대물렌즈 개구수의 약 2/3로 설정합니다.
뇌 튜불린을 사용하여 미세소관 역학을 이미지화하려면 먼저 샘플 히터 온도를 섭씨 37도로 설정합니다. 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 GMPCPP 안정화 미세소관 종자를 흐르고 표면을 실시간으로 이미징하여 표면에 결합하는 것을 모니터링합니다. 10-20개의 시자가 시야 내에 결합되면 예열 및 여과된 BRB80의 채널 부피의 두 배를 사용하여 샘플을 세척합니다.
다음으로, 중합 혼합물 10마이크로리터를 흐릅니다.
미세소관 성장을 측정하려면 획득 소프트웨어를 사용하여 15분 동안 5초마다 이미지를 획득하는 타임랩스를 설정합니다. 각 시점에서 평균 10의 이미지를 획득하여 대비를 향상시킵니다. 이전 섹션과 같이 배경 이미지를 가져옵니다. 이미지로 이동하여 스택, Z 프로젝트, 중앙값을 차례로 선택하여 중앙값을 계산합니다. 프로세스로 이동하여 이미지 계산기로 이동한 다음 드롭다운 메뉴에서 빼기를 선택하여 해당 배경을 뺍니다. 32비트 부동 소수점 결과 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다.
미세소관 수축의 경우 시간 지연을 0으로 설정하고 노출 시간을 10밀리초로 유지하여 초당 100프레임으로 이미지를 획득합니다.
