중심 미엘린의 튜불린 의존성 결함 연구를 위한 무표지 비선형 광학

생물학적 샘플의 2차 고조파 생성 이미징은 태그나 염료 없이 비중심대칭 분자와 그 어셈블리를 시각화할 수 있는 광학 기술입니다. 이 방법으로 생성 된 이미지는 조화력으로 작용할 수있는 생물학적 분자가 거의 없기 때문에 배경이 낮습니다. 이 프로토콜은 taiep 동물 모델에서 Tubulin beta-4A의 진단 영상화를위한 기술의 적용을 설명합니다.

세뇨관 병증은 최근에 설명 된 질병입니다. 이러한 이유로 세포 수준에서 병태생리학의 기초가 되는 기본 메커니즘에 대해 제한된 양의 정보를 사용할 수 있습니다. 시작하려면 펄스 레이저를 켜서 최적의 안정적인 전력 수준으로 레이싱할 준비가 되었는지 확인하십시오.

적정 미세 소관을 연구하기 위해 사용 가능한 레이저 출력의 10-20 %가 사용되며, 설명 된 시스템에서는 대물 렌즈의 후면 초점면에서 측정 된 13-26 밀리 와트에 해당합니다. 이미징하기 전에 레이저를 810나노미터로 돌립니다. 그런 다음 현미경이 2차 고조파 생성 또는 SHG 이미징에 사용되는 대물렌즈와 Koehler와 정렬되어 있는지 확인합니다.

광학 감지 경로에서 원치 않는 필터를 제거하고 콘덴서 다이어프램이 완전히 열리고 조명이 불필요하게 멈추지 않는지 확인하십시오. 렌즈에 약간의 이멀젼 오일 방울을 사용하여 25x x 0.8 숫자 구경 오일 이멀젼 대물렌즈를 준비합니다. 옥수수 전분의 경우 5% 미만인 레이저 출력을 제외하고 여기 표에 보고된 단계를 따릅니다.

이미지 건조 옥수수 전분은 유리 슬라이드 사이에 끼워져 있습니다. SHG 이미지를 생성하는 SHG 매개 변수를 사용하면 레이저 편광 방향을 나타냅니다. 희박한 옥수수 전분 입자의 이미지 하나를 캡처하고 레이저 편광 방향에 해당하는 XY 평면에서 SHG 소엽의 방향을 표시합니다.

제어를 위해 레이저의 진동 방향을 변경하기 위해 반파장 플레이트를 광학 경로에 삽입하는 동일한 샘플의 다른 이미지를 가져옵니다. 결과 이미지는 회전된 SHG 신호 소엽을 표시합니다. SHG에 다른 대역 통과 필터를 사용하는 경우 스캔 라인을 따라 이미지와 신호 강도를 픽셀 단위로 비교하여 최적의 전송 특성을 갖는지 확인하십시오.

따뜻한 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 또는 HBSS로 채워진 비브라톰 버퍼 트레이를 준비하십시오. 마스킹 테이프 조각을 통해 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 뇌를 표본 플레이트에 고정시킵니다. 가장 꼬리 부분이 접착제와 접촉하여 반대쪽 부분에서 사용 가능한 관상 동맥 부분을자를 수 있습니다.

시편 플레이트를 버퍼 트레이 내부의 자기 지지대로 옮깁니다. 슬라이스가 전체 뇌 표면을 포함 할 때까지 300-500 미크론 섹션을 자르기 시작하십시오. 그런 다음 단면의 두께를 160 미크론으로 줄이십시오.

뇌량 수준에서 160 미크론 섹션이 절단되면 큰 플랜지 오리피스가있는 수정 된 유리 파스퇴르 피펫으로 복구하십시오. 섹션을 새로운 따뜻한 HBSS가 있는 깨끗한 페트리 접시에 옮기거나 현미경 검사를 위해 커버 슬립 또는 유리 바닥 접시에 직접 옮깁니다. 샘플을 현미경 아래에 놓고 투과광으로 접안렌즈를 통해 직접 관찰하여 대물렌즈 아래에 적절하게 배치합니다.

얇은 액체 필름이 전체 샘플을 덮을 수 있도록 과도한 HBSS를 제거합니다. 샘플의 과도한 증발 및 건조를 피하기 위해 몇 분마다 액체 필름을 육안으로 확인하십시오. 어두운 배양 챔버의 모든 도어를 닫거나 검은색 나일론 폴리우레탄 코팅 직물로 배양 챔버를 덮는 것을 포함하는 비스캔 이미징을 위한 현미경 스테이지를 준비합니다.

전송 경로를 따라 스캔되지 않은 이미징 모드를 선택합니다. 이렇게하면 튜 불린의 약한 SH 신호 캡처가 최적화됩니다. 그런 다음 목표를 선택합니다.

다음으로, 픽셀 체류 시간이 12.6마이크로초인 레이저 출력을 설정합니다. 512 x 512 픽셀 이하의 이미지를 속도 5, 평균 2로 촬영하여 평균 획득 시간은 15초입니다. 먼저 485나노미터 단축 필터를 사용하여 이미지를 캡처하고 두 번째 단계에서는 선명한 405나노미터 대역통과 필터를 추가합니다.

메스로 소뇌를 두 개의 반구로 자르고 중간 부분의 비브라톰 지지대에 고정하십시오. 뇌에 대해 설명된 것과 동일한 비브라톰, 블레이드 및 현미경 설정을 사용하여 소뇌를 절편화하고 이미지화합니다. 뇌량의 섬유가 이미지화되면 taiep 뇌에서 섬유와 같은 짧은 구조와 둥근 요소가 관찰됩니다.

대조적으로, 대조 뇌의 뇌량은 뇌 영역 전체에 걸쳐 훨씬 더 이질적이고 등방성 신호를 보여줍니다. 차동 신호의 기원은 특히 2차 고조파 생성 현상에 있는데, 이는 좁은 대역통과 필터를 추가하면 제어 이미지에서 비특이적 신호 강도만 감소하는 반면, 항상 강렬한 SH 빛을 생성하는 taiep 이미지에서 소마와 유사하고 짧고 길쭉한 구조 주변에서 이 낮은 확산 신호를 선택적으로 제거하기 때문입니다. 소뇌 백질 대조군 조직에서, SH 신호의 완전한 부재가 관찰되었다.

Purkinje 세포는 단거리 통과 필터를 사용할 때 거의 보이지 않으며 길고 둥근 구조는 taiep 조직의 SH 이미지에서 지속됩니다. 최상의 이미지를 얻기 위한 중요한 단계는 조직 섹션을 가능한 한 얇게 자르는 것입니다. 또한 급성 조직 절편으로 작업하려면 조직 악화를 방지하기 위한 빠른 프로토콜이 필요합니다.

따라서 사전에 광학 시스템을 설정하고 점검하는 것이 중요합니다. 미세소관의 2차 고조파 신호는 전분의 2차 고조파 신호보다 약합니다. 따라서 미세 소관을 이미징하는 데 더 많은 레이저 출력을 사용해야합니다.

높은 개구수 대물렌즈가 이미징에 사용되기 때문에 샘플의 강도가 빠르게 증가하기 때문에 레이저 출력을 신중하게 증가시켜야 합니다. 2차 고조파 생성 이미징을 사용하면 세뇨관병증 모델의 중심 골수성의 병리학적 변화를 빠르고 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 기술의 잠재적 인 응용에는 H-ABC 세뇨관 병증의 기본 메커니즘 연구 및 환자 치료를위한 약리 요법 평가에 대한 사용이 포함됩니다. 장기적으로이 기술은 두개 내 또는 신선한 생검에 사용되는 무료 진단 도구가 될 가능성이 있습니다.