Name: 중심 미엘린의 튜불린 의존성 결함 연구를 위한 무표지 비선형 광학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 배우세요 중심 미엘린의 튜불린 의존성 결함 연구를 위한 무표지 비선형 광학 현미경 기법을 활용한 올리고덴드로사이트 탐지 방법입니다. 이 기술은 미세소관 역학과 신경세포 기능 이해에 활용됩니다.

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이 작업은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT)의 지원을 받아 다음과 같은 보조금을 받았습니다: VP-CIO에게 infraestructura 226450, VP에게 infraestructura 255277, FORDECYT-PRONACES/194171/2020에서 V.H.로 우리는 비디오 제작에서 CIO의 Juvenal Hernández Guevara의 지원을 인정합니다.

설명 된 모든 절차는 멕시코 정부의 건강 연구에 관한 일반 보건법 규정 (NOM-062-ZOO-1999)의 일곱 번째 제목에서 승인 된 법률 및 코드와 실험 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드의 권고에 따라 수행되었으며 과나후아토 대학교 및 베네메리타 대학교 연구에서 생명 윤리 기관위원회의 승인을 받았습니다. 푸에블라.
1. 현미경 설정
<ol><li>현미경 시스템을 켭니다.</li>
	<li>펄스 레이저를 켜서 샘플 추출 및 준비 후 최적의 안정적인 전력 수준으로 레이싱할 준비가 되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>레이저를 810nm로 조정하십시오. 적정 미세 소관을 연구하기 위해 사용 가능한 레이저 출력의 10 % -20 %가 사용되며, 이는 설명 된 시스템에서 대물 렌즈의 후면 초점면에서 측정 된 13-26mW에 해당합니다.</li>
	<li>현미경이 SHG 이미징에 사용될 대물렌즈와 함께 Köhler(보충 파일 1)로 정렬되었는지 확인하십시오. 알림: 이 작업에 사용된 상용 설정에서 감지는 전송 모드와 콘덴서를 통해 수행되기 때문에 중요합니다.</li>
	<li>광학 감지 경로에서 원치 않는 필터를 제거합니다(그림 1A).</li>
	<li>이 수준에서 불필요하게 빛이 멈추지 않도록 콘덴서 다이어프램이 완전히 열려 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>렌즈에 액침 오일을 약간 떨어뜨려 25x/0.8 개구수(NA) 오일 이멀젼 대물렌즈를 준비합니다. 참고: 이 대물렌즈는 콘덴서 NA와 가장 잘 일치하는 데 사용되었으며, 이는 0.55(이상적으로는 NA조건≥ NAobj)였습니다.</li>
</ol>2. 현미경 예비 제어
참고: 설정을 수정하지 않는 한 예비 현미경 제어를 한 번 수행하십시오.
<ol><li>레이저 편광 방향을 나타내는 SHG 이미지를 생성하기 위해 SHG 매개변수가 있는 유리 슬라이드 사이에 건조 옥수수 전분을 끼운 이미지. 옥수수 전분의 경우 2% 미만인 레이저 출력을 제외하고 보충 파일 5에 보고된 단계를 따르십시오.</li>
	<li>희박한 옥수수 전분 입자의 이미지 하나를 찍고 xy 평면에서 SHG 소엽의 방향을 표시합니다. 이 배향은 레이저 배향에 해당합니다(그림 2A).</li>
	<li>대조군으로 동일한 샘플의 다른 이미지를 가져와 광학 경로에 반파장판( 그림 1A에 표시된 위치)을 삽입하여 레이저의 진동 방향을 변경합니다. 결과 이미지는 회전된 SHG 신호 소엽을 표시합니다(그림 2B, C).</li>
	<li>SHG에 다른 유형의 대역 통과 필터를 사용하는 경우 라인 스캔을 따라 이미지(그림 2D, E)와 신호 강도를 픽셀 단위로 비교하여 최적의 전송 특성을 갖는지 확인합니다(그림 2F).</li>
</ol>3. 조직 추출
알림: 수술 절차를 수행하려면 항상 깨끗한 도구를 사용하십시오.
<ol><li>6-12 개월 된 taiep 쥐와 연령이 일치하는 Sprague-Dawley 대조군 (WT)을 사용하십시오.</li>
	<li>0.9% 멸균 NaCl 용액에 희석한 케타민-자일라진(0.125mg/Kg 및 5mg/Kg) 혼합물의 i.p. 주사로 동물을 마취합니다.<ol><li>통증 반사를 확인하고 결석 한 경우에만 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>참수를 통해 동물을 희생하십시오.</li>
	<li>머리가 분리되면 상단의 가장 꼬리 지점에서 코쪽으로, 안와 구멍에서 정중선으로, 그리고 가장 꼬리 지점에서 뇌와 소뇌 아래까지 정중선을 따라 두개골 금고의 뼈를 조심스럽게 엽니 다. 알림: 뼈 절단기와 Rongeurs는 뇌 구조를 손상시키지 않고 머리 뼈를 적절하게 제거 할 수 있습니다.</li>
	<li>뼈에서 뇌와 소뇌를 풀어줍니다. 두 반구는 분리 될 수 있습니다. 반구가 분할된 경우 절반을 SHG 이미징에 사용하고 나머지 절반은 후속 절단 및 염색을 위해 화학 후드 내부에 20분 동안 인산염 완충 식염수(PBS)의 3.7% 파라포름알데히드로 고정합니다.</li>
</ol>4. 비브라톰 절편
<ol><li>따뜻한(37°C) 행크스 밸런스드 소금 용액(HBSS)으로 채워진 비브라톰 버퍼 트레이를 준비합니다.</li>
	<li>마스킹 테이프 조각을 통해 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 뇌를 표본 플레이트에 고정시킵니다. 가장 꼬리 부분 / 영역이 접착제와 접촉하여 반대쪽의 부분에서 사용 가능한 관상 섹션을 절단 할 수 있습니다.<ol><li>샘플의 효과적인 부착을 얻기 위해 접착제가 중합될 때까지 ~10초를 허용합니다. 참고: 최상의 결과는 블레이드가 "좌우로"가 아니라 "위에서 아래로" 절단되도록 뇌의 방향을 지정할 때 얻을 수 있습니다(그림 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>시편 플레이트를 버퍼 트레이 내부의 자기 지지대로 옮깁니다.</li>
	<li>생성 된 조각이 뇌의 전체 표면을 포함 할 때까지 300-500 μm 섹션을 자르기 시작합니다.</li>
	<li>이 시점에서 단면의 두께를 160μm로 줄이십시오.</li>
	<li>뇌량 수준에서 완전한 160μm 섹션이 절단되면 큰 화염 오리피스가 있는 수정된 유리 파스퇴르 피펫으로 복구합니다(그림 1C).</li>
	<li>따뜻한 새 HBSS가 있는 깨끗한 페트리 접시에 옮기거나 현미경 검사를 위해 유리 지지대(커버슬립 또는 유리 바닥 접시)에 직접 옮깁니다. 참고: 설명된 실험 조건의 경우 샘플 위에 커버슬립을 추가하면 이미징에 해롭습니다.</li>
</ol>5. 현미경으로 이동
<ol><li>현미경이 다른 방에있는 경우 온도를 유지하면서 조직 섹션을 옮기기 위해 따뜻하게 한 젤 팩으로 단열 상자를 준비하십시오. 상자는 또한 이미지가 될 때까지 섹션을 따뜻하게 유지하는 역할을합니다.</li>
	<li>샘플을 현미경 아래에 놓고 투과광이 있는 접안렌즈를 통해 직접 관찰하여 대물렌즈 아래에 적절하게 배치되었는지 확인합니다. 알림: 목표는 예측된 방출 구조를 레이저의 진동 방향과 정렬하여 방출된(따라서 감지된) SHG 신호를 최대화하는 것입니다.</li>
	<li>얇은 액체 필름이 전체 샘플을 덮을 수 있도록 과도한 HBSS를 제거합니다. 샘플의 과도한 증발 및 건조를 피하기 위해 몇 분마다 액체 필름을 육안으로 확인하십시오. 알림: 설명 된 조건에서 섹션은 20 분 이상 사용되지 않습니다. 시료의 건조는 급격한 인공물 효과를 일으킨다(보충 그림 1A). 더 긴 이미징 시간이 필요한 경우 HBSS를 더 추가하는 대신 따뜻하고 신선한 매체에 섹션을 주기적으로 담그는 것이 좋습니다. 조직을 고정시키기 위해 관류 챔버와 접착제 또는 저 융점 아가 로스를 사용하는 것도 더 긴 실험을 수행 할 때 권장됩니다.</li>
	<li>어두운 배양 챔버의 모든 문을 닫거나 검은색 나일론 폴리우레탄 코팅 직물로 배양 챔버를 덮는 것을 포함할 수 있는 스캔되지 않은 이미징을 위한 현미경 단계를 준비합니다.</li>
</ol>6. 이미징
<ol><li>전송 경로를 따라 "스캔되지 않은" 이미징 모드를 선택합니다. 이렇게하면 튜 불린의 약한 SH 신호 캡처가 최적화됩니다.</li>
	<li>LCI 플랜-네오플루아 25x/0.8 NA 대물렌즈를 선택합니다.</li>
	<li>13mW에서 26mW 사이의 레이저 출력을 설정하고 픽셀 체류 시간은 12.6μs입니다. 평균 획득 시간 약 15초 동안 속도 5, 평균 2로 512픽셀 x 512픽셀 이하의 이미지를 촬영합니다. 알림: 더 높은 레이저 출력 및/또는 더 긴 체류 시간을 사용하면 샘플이 손상될 수 있습니다(보충 그림 1B).</li>
	<li>먼저 485nm 단거리 통과 필터(SP485)를 사용하여 이미지를 촬영하고 두 번째 단계에서 선명한 405nm 대역통과 필터(BP405; 그림 3). 보충 파일 2에 보고된 단계를 따릅니다. 참고: 의사 명시야 이미지는 가시선의 잔류 레이저 광을 사용하여 동일한 검출기를 통해 촬영할 수 있습니다(405nm 또는 488nm 레이저가 가장 적합).</li>
</ol>7. 소뇌의 처리
<ol><li>먼저 메스로 소뇌를 두 개의 반구로 자른 다음 중간 부분 (절단 후 얻은 평평한 부분)으로 비브라 톰 지지대에 붙입니다.</li>
	<li>뇌에 대해 기술된 것과 동일한 방식으로 소뇌를 절편화하고 이미지화하였다(160 μm 절편, 동일한 비브라톰 설정, 동일한 블레이드, 동일한 현미경 설정 등). 참고 : 소뇌의 해부학으로 인해 절편 순간의 방향은 중요하지 않습니다. 표면에서 멀리 떨어진 곳에서 생성 된 대부분의 조각에는 백질로 잘 절단 된 폴리아가 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없습니다.

SHG 현미경은 2광자 여기 현미경, 3차 고조파 생성 현미경 및 응집성 안티-스톡스 라만 산란 현미경을 포함하는 비선형 광학 기술 그룹의 일부로, 종래의 광학 현미경의 적용 범위를 생명 과학(20)으로 확장하는 데 기여했습니다.
특히, SHG 현미경의 주요 강점과 약점은 동일한 조건과 관련이 있습니다 : 신호 발생기는 비 중심 대칭21입니다. 이러한 특정 건축 조건은 종종 무기 및 유기 결정의 영역에서 발견되지만 생물학적 대상에서는 드뭅니다. 콜라겐 및 근육 미오신과 함께, 미세소관은 제2 고조파 신호(22)를 생성할 수 있으며, 이는 평행 중합체의 다발에서 충분한 합산이 발생하면 현미경으로 검출할 수 있다. 세포 내부에서 튜 불린은 축삭의 코어 (세포 유형 별 위치), 유사 분열 방추 (시간적 특이 적 분포)에서 평행 한 다발을 형성하기 위해 결합하...

조직 및 장기 준비에서 세포 골격 구조의 광학 이미징은 쉬운 일이 아닙니다. 세포골격 필라멘트는 어디에나 있으므로 예를 들어 상피 샘플의 알파-튜불린 또는 베타-액틴 또는 잠재적으로 케라틴에 대해 일반적인 염색을 수행하는 경우 신호는 샘플 전체에 다소 균일하게 분포될 수 있습니다. 염색을 세포 성분의 보다 의미 있는 하위 집합으로 제한하기 위해, 표적 발현1을 갖는 형질전환 마우스를 사용하거나 이소형 특이적 항체를 사용할 계획을 세울 수 있다. 후자 중 극소수가 시장에 나와 있지만(2,3,4에는 거의 존재하지 않음) 형질전환 동물 모델을 사용할 수 있습니다. 그러나 실험실에서 구입하여 프로세스에 관련된 모든 비용과 함께 적절하게 보관해야 합니다. 특정 항체 또는 화학 물질, 예를 들어 팔로이딘 또는 파클리탁셀과 같은 형광단 접합 약물은 살아있는 세포 또는 조직에서의 사용과 부분적으로 또는 완전히 양립할 수 없으므로 고정 샘플에 대한 연구에만 적용할 수 있습니다.
튜 불린의 경우, 고정에 대한 폴리머의 민감도 인 추가 측면을 고려해야합니다. 포름 알데히드에 의한 종래의 화학적 고정은 미세 소관의 완전성을 최적으로 보존하기에 적합하지 않은 것으로 알려져 있습니다5. 또한 최근 보고서에 따르면 포름 알데히드 가교는 GTP6과 같은 일부 약물 또는 생리 학적 분자의 결합에서 발생하는 것과 유사하게 미세 소관의 미세 구조에 미묘한 변화를 유도합니다.
따라서 염색되지 않고 고정되지 않은 샘플에서 미세소관을 직접 시각화하는 것이 종종 바람직합니다. 이를 달성하기 위한 한 가지 기술적 솔루션은 2차 고조파 생성(SHG) 현미경7로, 이는 병렬 미세소관 다발이 하모노포어 역할을 하고 강렬한 펄스 적외선 레이저로 적절하게 조명될 때 주파수 이중 빛을 방출하는 능력을 기반으로 합니다. 더 강력하고 안정적인 2차 고조파 신호가 주파수 배가가 가능한 것으로 알려진 유일한 다른 두 가지 생물학적 물질인 콜라겐과 미오신에서 생성될 수 있지만, 튜불린의 신호는 지금까지 주로 유사분열 방추 재배열 8,9,10 및 축삭 미세소관 형태 11,12,13을 연구하는 데 사용되었습니다.
이 연구에서 우리는 튜불린 베타 4 A (TUBB4A) 세뇨관 병증의 영향을받는 중추 신경계 (CNS) 조직을 건강한 대응물 14와 구별하기위한 진단 도구로서 SHG 현미경의 새로운 사용을 소개합니다. 기저핵과 소뇌 (H-ABC)의 저 수초화 및 위축을 유발하는 것과 같은이 주로 신경 이형 튜 불린에서 발생하는 돌연변이 중 일부는 희소 돌기 아교 세포에서 미세 소관 과충진을 유도합니다15,16; 세포 골격 변화는 차례로 운동 및 감각 경로16,17,18,19의 심오한 손상과 함께 수초화와 같은 하류 효과와 관련이 있습니다. 이 작업에 사용 된 taiep 쥐 모델은 희소 돌기 아교 세포에서 비정상적인 미세 소관 함량을 표시하고 H-ABC 환자17의 감각 운동 증상의 대부분을 요약합니다. 이 프로토콜은 건강한 조직과 돌연변이 조직 간의 SH 신호의 차이를 강조하기 위해 일반적으로 고도로 수초화되고 인간 환자와 taiep rat 19에서 심하게 영향을받는 뇌량과 소뇌로 구조를 이미지화하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>405/10nm BrightLine(R) 단일 대역 대역 통과 필터&nbsp;</td><td>셈록</td><td>FF01-405/10-25</td><td>직경 32mm, 하우징 링 포함</td></tr><tr><td>블랙 나일론, 폴리우레탄 코팅 원단</td><td>토랩스</td><td>BK5</td><td>5' x 9'(1.5m x 2.7m) x 0.005"(0.12mm) 두께&nbsp;</td></tr><tr><td>진동술용 블레이드</td><td>모든 광고; 예: 윌킨슨 소드</td><td></td><td>&nbsp; 클래식 스테인리스 스틸 양날 면도날</td></tr><tr><td>세포 배양 접시, 35 mm</td><td>모든 광고; 예: 팔콘</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>공초점 현미경</td><td>자이스</td><td>LSM710NLO AxioObserver Z1</td><td>도립 현미경, 사용 대물렌즈는 LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA&nbsp입니다.</td></tr><tr><td>냉각기</td><td>모든 광고</td><td></td><td>모든 절연 폴리스티렌 상자는 샘플을 약 37도 및 deg로 유지하기 위해 작동할 수 있습니다. C</td></tr><tr><td>옥수수 스타치</td><td>예: Maizena</td><td></td><td>슈퍼마켓에서</td></tr><tr><td>커버슬립 #1.5</td><td>모든 광고</td><td></td><td>직사각형</td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제</td><td>예: 록타이트</td><td></td><td>마스킹 테이프에 뇌를 붙이려면</td></tr><tr><td>미세 집게(Fine Forceps)</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11412-11</td><td>수막에서 취급하여 조직 절편을 조작하기 위해</td></tr><tr><td>가는 가위</td><td>정밀 과학 도구</td><td>14370-22</td><td>피부를 자르다면&nbsp;</td></tr><tr><td>가는 가위 곡선 끝</td><td>정밀 과학 도구</td><td>14061-09</td><td>정중선을 따라 자르려면</td></tr><tr><td>포름알데히드 37%</td><td>시그마-알드리치</td><td>252549</td><td>PBS에서 1:10으로 희석하려면</td></tr><tr><td>프리드먼 롱유르</td><td>정밀 과학 도구</td><td>16000-14</td><td>뼈를 자르려면</td></tr><tr><td>젤 팩</td><td>모든 광고</td><td></td><td>37 &g도로 예열; C, 쿨러 내부 온도를 유지하는 데 도움이 됩니다.</td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫, 개조</td><td>모든 광고</td><td></td><td>조직 절편을 옮기려면</td></tr><tr><td>행크스&프라임; 균형 소금 용액(HBSS)</td><td>깁코</td><td>14025-076</td><td>분말로 준비할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>켈리 지혈제</td><td>정밀 과학 도구</td><td>13018-14</td><td>뼈를 분리하려면&nbsp;</td></tr><tr><td>마스킹 테이프</td><td>모든 광고</td><td></td><td>시편 플레이트의 표면을 보호하기 위해</td></tr><tr><td>NDD 모듈, 유형 C</td><td>자이스</td><td>000000-1410-101</td><td>신호를 감지하여 빛 손실을 줄입니다. SP485와 함께 000000-1935-163 필터 세트 하우징</td></tr><tr><td>오프셋 뼈 니퍼</td><td>정밀 과학 도구</td><td>16101-10</td><td>뼈를 자르려면</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>깁코</td><td>10010-031</td><td>분말 또는 탭으로 준비할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>펄스 레이저</td><td>간섭성의</td><td>카멜레온 비전 II</td><td>680&ndash; 1080nm 가변 레이저</td></tr><tr><td>메스</td><td>모든 광고</td><td></td><td>뾰족한 끝이 있는 직선 칼날</td></tr><tr><td>표준 패턴 겸자</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>정밀 과학 도구</td><td>15018-10</td><td>비브라톰 절단에서 얻은 슬라이스와 표본 플레이트에 접착된 섹션 모두에 결합된 상태로 남아 있는 수막을 절단합니다.</td></tr><tr><td>비브라톰</td><td>모든 광고; 예: 라이카</td><td>VT1200 시리즈</td><td></td></tr></tbody></table>

중심 미엘린의 튜불린 의존성 결함 연구를 위한 무표지 비선형 광학

Label-Free Non-Linear Optics for the Study of Tubulin-Dependent Defects in Central Myelin

뇌의 세포 골격 구성 요소를 만족스럽게 시각화하는 것은 어려운 일입니다. 모든 신경 조직에서 미세소관, 미세필라멘트 및 중간 필라멘트 네트워크의 유비쿼터스 분포와 형광 단백질 융합 전략의 결과의 가변성 및 발색단 비히클로서의 항체 및 약물의 동적 연구에 대한 제한된 적용 가능성으로 인해 고전적인 광학 접근 방식은 다른 단백질만큼 효과적이지 않습니다. 튜 불린을 연구해야 할 때, 2 차 고조파의 표지없는 생성은 분자의 비 중심 대칭 조직으로 인해 매우 적합한 옵션입니다. 이 기술은 현미경에 접합 될 때 생물학적 샘플에서 평행 한 미세 소관 다발의 체적 분포를 정 성적으로 설명 할 수 있으며 고정되지 않고 투과되지 않은 신선한 조직으로 작업 할 수있는 추가적인 이점이 있습니다. 이 연구는 최근에 기술된 미엘린 장애인 기저핵 및 소뇌(H-ABC) 세뇨관 병증의 위축을 동반한 저수초화에서와 같이 희소돌기아교세포의 튜불린이 풍부한 구조에서 미세소관을 강조하기 위해 상업용 2차 고조파 생성 현미경 설정으로 튜불린을 이미지화하는 방법을 설명합니다.

이 방법론으로 얻은 이미지는 생물학적 조직에 존재하는 매우 제한된 수의 harmonophores로 인해 본질적으로 낮은 배경 수준을 가지며, 이는 방법의 중요한 장점 중 하나입니다.
뇌량의 섬유가 이미지화될 때, 섬유와 같은 짧은 구조와 둥근 요소는 taiep 뇌에서 일관되게 발견될 수 있는 반면(그림 3B), 대조 뇌의 뇌량은 뇌 영역 전체에 걸쳐 훨씬 더 이질적이고 등방성 신호를 나타냅니다(그림 3A). 차동 신호의 기원은 특히 2차 고조파 생성 현상에 있는데, 이는 좁은 대역통과 필터를 추가하면 제어 이미지(그림 3C-D)에서 비특이적 신호 강도만 감소하는 반면 항상 강렬한 SH 광을 생성하는 타이엡 이미지에서 이 낮고 확산된 신호를 선택적으로 제거하기 때문입니다(그림 ...

이 기사에서는 간단하고 혁신적인 2차 고조파 생성 현미경 접근 방식을 통해 세뇨관병증 모델에서 미세소관 로딩 희소돌기아교세포를 검출하는 프로토콜을 제시합니다.

The satisfactory visualization of cytoskeletal components in the brain is challenging. The ubiquitous distribution of the networks of microtubules, ...

생물학적 샘플의 2차 고조파 생성 이미징은 태그나 염료 없이 비중심대칭 분자와 그 어셈블리를 시각화할 수 있는 광학 기술입니다. 이 방법으로 생성 된 이미지는 조화력으로 작용할 수있는 생물학적 분자가 거의 없기 때문에 배경이 낮습니다. 이 프로토콜은 taiep 동물 모델에서 Tubulin beta-4A의 진단 영상화를위한 기술의 적용을 설명합니다.세뇨관 병증은 최근에 설명 된 질병입니다. 이러한 이유로 세포 수준에서 병태생리학의 기초가 되는 기본 메커니즘에 대해 제한된 양의 정보를 사용할 수 있습니다. 시작하려면 펄스 레이저를 켜서 최적의 안정적인 전력 수준으로 레이싱할 준비가 되었는지 확인하십시오.적정 미세 소관을 연구하기 위해 사용 가능한 레이저 출력의 10-20 %가 사용되며, 설명 된 시스템에서는 대물 렌즈의 후면 초점면에서 측정 된 13-26 밀리 와트에 해당합니다. 이미징하기 전에 레이저를 810나노미터로 돌립니다. 그런 다음 현미경이 2차 고조파 생성 또는 SHG 이미징에 사용되는 대물렌즈와 Koehler와 정렬되어 있는지 확인합니다.광학 감지 경로에서 원치 않는 필터를 제거하고 콘덴서 다이어프램이 완전히 열리고 조명이 불필요하게 멈추지 않는지 확인하십시오. 렌즈에 약간의 이멀젼 오일 방울을 사용하여 25x x 0.8 숫자 구경 오일 이멀젼 대물렌즈를 준비합니다. 옥수수 전분의 경우 5% 미만인 레이저 출력을 제외하고 여기 표에 보고된 단계를 따릅니다.이미지 건조 옥수수 전분은 유리 슬라이드 사이에 끼워져 있습니다. SHG 이미지를 생성하는 SHG 매개 변수를 사용하면 레이저 편광 방향을 나타냅니다. 희박한 옥수수 전분 입자의 이미지 하나를 캡처하고 레이저 편광 방향에 해당하는 XY 평면에서 SHG 소엽의 방향을 표시합니다.제어를 위해 레이저의 진동 방향을 변경하기 위해 반파장 플레이트를 광학 경로에 삽입하는 동일한 샘플의 다른 이미지를 가져옵니다. 결과 이미지는 회전된 SHG 신호 소엽을 표시합니다. SHG에 다른 대역 통과 필터를 사용하는 경우 스캔 라인을 따라 이미지와 신호 강도를 픽셀 단위로 비교하여 최적의 전송 특성을 갖는지 확인하십시오.따뜻한 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 또는 HBSS로 채워진 비브라톰 버퍼 트레이를 준비하십시오. 마스킹 테이프 조각을 통해 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 뇌를 표본 플레이트에 고정시킵니다. 가장 꼬리 부분이 접착제와 접촉하여 반대쪽 부분에서 사용 가능한 관상 동맥 부분을자를 수 있습니다.시편 플레이트를 버퍼 트레이 내부의 자기 지지대로 옮깁니다. 슬라이스가 전체 뇌 표면을 포함 할 때까지 300-500 미크론 섹션을 자르기 시작하십시오. 그런 다음 단면의 두께를 160 미크론으로 줄이십시오.뇌량 수준에서 160 미크론 섹션이 절단되면 큰 플랜지 오리피스가있는 수정 된 유리 파스퇴르 피펫으로 복구하십시오. 섹션을 새로운 따뜻한 HBSS가 있는 깨끗한 페트리 접시에 옮기거나 현미경 검사를 위해 커버 슬립 또는 유리 바닥 접시에 직접 옮깁니다. 샘플을 현미경 아래에 놓고 투과광으로 접안렌즈를 통해 직접 관찰하여 대물렌즈 아래에 적절하게 배치합니다.얇은 액체 필름이 전체 샘플을 덮을 수 있도록 과도한 HBSS를 제거합니다. 샘플의 과도한 증발 및 건조를 피하기 위해 몇 분마다 액체 필름을 육안으로 확인하십시오. 어두운 배양 챔버의 모든 도어를 닫거나 검은색 나일론 폴리우레탄 코팅 직물로 배양 챔버를 덮는 것을 포함하는 비스캔 이미징을 위한 현미경 스테이지를 준비합니다.전송 경로를 따라 스캔되지 않은 이미징 모드를 선택합니다. 이렇게하면 튜 불린의 약한 SH 신호 캡처가 최적화됩니다. 그런 다음 목표를 선택합니다.다음으로, 픽셀 체류 시간이 12.6마이크로초인 레이저 출력을 설정합니다. 512 x 512 픽셀 이하의 이미지를 속도 5, 평균 2로 촬영하여 평균 획득 시간은 15초입니다. 먼저 485나노미터 단축 필터를 사용하여 이미지를 캡처하고 두 번째 단계에서는 선명한 405나노미터 대역통과 필터를 추가합니다.메스로 소뇌를 두 개의 반구로 자르고 중간 부분의 비브라톰 지지대에 고정하십시오. 뇌에 대해 설명된 것과 동일한 비브라톰, 블레이드 및 현미경 설정을 사용하여 소뇌를 절편화하고 이미지화합니다. 뇌량의 섬유가 이미지화되면 taiep 뇌에서 섬유와 같은 짧은 구조와 둥근 요소가 관찰됩니다.대조적으로, 대조 뇌의 뇌량은 뇌 영역 전체에 걸쳐 훨씬 더 이질적이고 등방성 신호를 보여줍니다. 차동 신호의 기원은 특히 2차 고조파 생성 현상에 있는데, 이는 좁은 대역통과 필터를 추가하면 제어 이미지에서 비특이적 신호 강도만 감소하는 반면, 항상 강렬한 SH 빛을 생성하는 taiep 이미지에서 소마와 유사하고 짧고 길쭉한 구조 주변에서 이 낮은 확산 신호를 선택적으로 제거하기 때문입니다. 소뇌 백질 대조군 조직에서, SH 신호의 완전한 부재가 관찰되었다.Purkinje 세포는 단거리 통과 필터를 사용할 때 거의 보이지 않으며 길고 둥근 구조는 taiep 조직의 SH 이미지에서 지속됩니다. 최상의 이미지를 얻기 위한 중요한 단계는 조직 섹션을 가능한 한 얇게 자르는 것입니다. 또한 급성 조직 절편으로 작업하려면 조직 악화를 방지하기 위한 빠른 프로토콜이 필요합니다.따라서 사전에 광학 시스템을 설정하고 점검하는 것이 중요합니다. 미세소관의 2차 고조파 신호는 전분의 2차 고조파 신호보다 약합니다. 따라서 미세 소관을 이미징하는 데 더 많은 레이저 출력을 사용해야합니다.높은 개구수 대물렌즈가 이미징에 사용되기 때문에 샘플의 강도가 빠르게 증가하기 때문에 레이저 출력을 신중하게 증가시켜야 합니다. 2차 고조파 생성 이미징을 사용하면 세뇨관병증 모델의 중심 골수성의 병리학적 변화를 빠르고 쉽게 식별할 수 있습니다. 이 기술의 잠재적 인 응용에는 H-ABC 세뇨관 병증의 기본 메커니즘 연구 및 환자 치료를위한 약리 요법 평가에 대한 사용이 포함됩니다. 장기적으로이 기술은 두개 내 또는 신선한 생검에 사용되는 무료 진단 도구가 될 가능성이 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 적절한 완충액이 있는 커버슬립 표면에서 자라는 미세소관을 시각화하기 위한 간섭 반사 현미경(IRM) 기술에 대해 설명합니다. 입사광을 이용한 조명 시, 커버슬립-버퍼 인터페이스와 버퍼-미세소관 인터페이스는 빛을 반사하며, 이 두 인터페이스가 결합되어 간섭 패턴을 생성함으로써 미세소관을 밝은 배경에 대한 고대비 이미지로 시각화할 수 있습니다.

미세소관 역학의 Label-free 시각화를 위한 간섭 반사 현미경 검사

출처: Piazza, V., et al., Label-free Non-Linear optics for the study of tubulin-dependent defects in central myelin. J. Vis. Exp. (2023)이 비디오는 이광자 여기 현미경을 사용하여 쥐의 뇌 조직 절편에서 미세소관 이상을 이미징하는 절차를 보여줍니다. SHG(Second Harmonic Generation) 신호를 사용하여 튜불린 결함과 미엘린 생성 감소를 감지합니다.

세뇨관 결함을 연구하기 위한 쥐 모델의 2차 조화 생성 이미징

우리는 축삭돌기 및 미엘린 손상의 역학을 실시간으로 동시에 시각화하기 위해 이광자 여기 타임 랩스 현미경을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 제안된 프로토콜은 손상 후 중심 수초화된 축삭돌기의 운명에 영향을 미치고 영구적인 임상적 장애에 기여할 수 있는 내적 및 외적 요인에 대한 연구를 가능하게 합니다.

전의 VIVO 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Immunolabeling 방법 개발 zebrafish 두뇌에 microtubules의 명료한 인구를 분석 하는 다른 조직에 광범위 하 게 적용 되는 여기에, 설명 됩니다. 첫 번째 프로토콜 immunolabeling 안정적이 고 동적 microtubules에 대 한 최적화 된 방법을 설명합니다. 두 번째 프로토콜 이미지와 초기 microtubules 구체적으로 정량화 하는 방법을 제공 합니다.

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

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